一种同时测定人血浆中十二种酪氨酸激酶抑制剂浓度的方法与流程

chromatography.b,analytical technologies in the biomedical and life sciences,2019 apr 15；1113:37-44.)；rafael reis等人建立了定量方法用于检测血浆中阿法替尼、厄洛替尼、奥希替尼及克唑替尼等的浓度，前处理方法为蛋白沉淀(参见:reis r,labat l,allard m,boudou-rouquette p,chapron j,bellesoeur a,thomas-schoemann a,arrondeau j,giraud f,alexandre j,vidal m,goldwasser f,blanchet b.liquid chromatography-tandem mass spectrometric assay for therapeutic drug monitoring of the egfr inhibitors afatinib,erlotinib and osimertinib,the alk inhibitor crizotinib and the vegfr inhibitor nintedanib in human plasma from non-small cell lung cancer patients.j pharm biomed anal.2018 sep 5；158:174-183.)。这些检测标准不统一，方法不一致，而临床实际中不同的病人可能同时服用不同的靶向药物，可能需要不同的方法甚至不同的的仪器进行检测。不仅增加了工作量浪费了实验资源，增加了患者及医生等待血药浓度结果的时间。


技术实现要素：

5.鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种同时测定人血浆中十二种酪氨酸激酶抑制剂浓度的方法，结合药物特征性二级碎片例子分析，同时对人血浆中吉非替尼、厄洛替尼、阿法替尼、达可替尼、埃克替尼、奥希替尼、克唑替尼、阿来替尼、色瑞替尼、曲美替尼、达拉菲尼、安罗替尼的浓度进行分析，该方法检测时间短、灵敏度高、定量准确。
6.为实现上述目的及其他相关目的，本发明第一方面提供一种同时测定人血浆中十二种酪氨酸激酶抑制剂浓度的方法，包括：在人血浆样本中加入醋酸铵溶液沉淀血浆样本中的蛋白，再加入含有内标溶液的乙腈进行萃取，获得的样品溶液采用高效液相色谱质谱联用(hplc-ms/ms)法进行测定，根据保留时间确定样品溶液中12种酪氨酸激酶抑制剂，采用内标标准曲线法进行定量，确定样品溶液中12种酪氨酸激酶抑制剂的浓度。
7.优选地，所述12种酪氨酸激酶抑制剂包括吉非替尼(cas号为184475-35-2)、厄洛替尼(cas号为183321-74-6)、阿法替尼(cas号为850140-72-6)、达可替尼(cas号为1110813-31-4)、埃克替尼(cas号为610798-31-7)、奥希替尼(cas号为1421373-65-0)、克唑替尼(cas号为877399-52-5)、阿来替尼(cas号为1256580-46-7)、色瑞替尼(cas号为1032900-25-6)、曲美替尼(cas号为871700-17-3)、达拉菲尼(cas号为1195765-45-7)、安罗替尼(cas号为1058156-90-3)。
8.优选地，所述人血浆样本中加入醋酸铵溶液后要漩涡振荡15-45s，优选为30s。
9.优选地，所述醋酸铵溶液为浓度1-10mol/l的醋酸铵的水溶液。更优选地，所述醋酸铵溶液为浓度5mol/l的醋酸铵的水溶液。
10.优选地，所述醋酸铵溶液与人血浆样本加入的体积之比为0.9-1.1:1，优选为1:1。
11.优选地，所述内标溶液为伏立康唑的甲醇溶液。所述伏立康唑的cas号为137234-62-9。所述伏立康唑对12种酪氨酸激酶抑制剂无干扰。
12.更优选地，所述内标溶液的浓度为1mg/ml。
13.优选地，所述含有内标溶液的乙腈中内标的浓度为10-15ng/ml，优选为12ng/ml。
14.优选地，所述乙腈与人血浆样本加入的体积之比为1.9-2.1:1，优选为2:1。
15.优选地，所述萃取是先漩涡振荡后离心，取上清液。
16.更优选地，所述漩涡振荡的时间为2-4min，优选为3min。
17.更优选地，所述离心的时间为9-11分钟，所述离心的温度为3-5℃，所述离心的转速为10000-15000g/min。
18.进一步优选地，所述离心的时间为10分钟，所述离心的温度为4℃，所述离心的转速为12000g/min。
19.更优选地，所述上清液的取液量为90-110μl，优选为100μl。
20.优选地，所述样品溶液采用高效液相色谱质谱联用法进行测定，包括以下步骤：
21.1)配制标准溶液：在空白血浆样本中加入醋酸铵溶液沉淀血浆样本中的蛋白，加入药物溶液和含有内标溶液的乙腈进行萃取，获得标准溶液；
22.2)样品检测：采用高效液相色谱质谱联用法分别检测样品溶液和步骤1)中的标准溶液，将获得的样品溶液的液相色谱图，与标准溶液的液相色谱图进行比较，根据相对保留时间指认出共有特征峰定性，再根据共有特征峰的色谱峰面积通过内标标准曲线法进行定量，确定样品溶液中12种酪氨酸激酶抑制剂的浓度。
23.更优选地，步骤1)中，所述药物溶液为12种酪氨酸激酶抑制剂标准品的储备液，采用的溶剂为体积比3-5:1的甲醇与二甲基亚砜。
24.进一步优选地，所述溶剂为体积比4:1的甲醇与二甲基亚砜。
25.更优选地，步骤1)中，所述药物溶液中12种酪氨酸激酶抑制剂的浓度均为1mg/ml。
26.更优选地，步骤1)中，所述内标溶液为伏立康唑的甲醇溶液。
27.更优选地，步骤1)中，所述内标溶液的浓度为1mg/ml。
28.更优选地，步骤1)中，所述空白血浆样本加入醋酸铵溶液后要漩涡振荡15-45s，优选为30s。
29.更优选地，步骤1)中，所述醋酸铵溶液为浓度1-10mol/l的醋酸铵的水溶液。
30.进一步优选地，所述醋酸铵溶液为浓度5mol/l的醋酸铵的水溶液。
31.更优选地，步骤1)中，所述醋酸铵溶液与空白血浆样本加入的体积之比为0.9-1.1:1，优选为1:1。
32.更优选地，步骤1)中，所述乙腈与空白血浆样本加入的体积之比为1.9-2.1:1，优选为2:1。
33.更优选地，步骤1)中，所述萃取是先漩涡振荡后离心，取上清液。
34.进一步优选地，所述漩涡振荡的时间为2-4min，优选为3min。
35.进一步优选地，所述离心的时间为9-11分钟，所述离心的温度为3-5℃，所述离心的转速为10000-15000g/min。
36.最优选地，所述离心的时间为10分钟，所述离心的温度为4℃，所述离心的转速为12000g/min。
37.进一步优选地，所述上清液的取液量为90-110μl，优选为100μl。
38.更优选地，步骤1)中，所述标准溶液中12种酪氨酸激酶抑制剂的浓度范围为：吉非替尼1.25-625ng/ml；厄洛替尼0.5-250ng/ml；阿法替尼1-500ng/ml；达可替尼5-2500ng/ml；埃克替尼0.5-250ng/ml；奥希替尼1-500ng/ml；克唑替尼10-2500ng/ml；阿来替尼1-500ng/ml；色瑞替尼2-1000ng/ml；曲美替尼1-500ng/ml；达拉非尼0.5-250ng/ml；安罗替尼
0.4-200ng/ml。
39.更优选地，步骤1)中，所述标准溶液中内标的浓度为10-15ng/ml，优选为12ng/ml。
40.优选地，所述高效液相色谱质谱联用法中，所述高效液相色谱(hplc)的测定条件为：
41.色谱柱：c18柱；柱温：35-45℃；进样器内温度为室温；进样量：15-25μl；流速：0.5-2.0ml/min；柱后2-4:6-8分流，2-4/10流入质谱分析；流动相a相为水，内含体积分数为0.05-0.15％的甲酸和4-6mmol/l的醋酸铵；流动相b相为乙腈；分析时间为6min；梯度洗脱。
42.更优选地，所述高效液相色谱(hplc)的测定条件为：
43.色谱柱：waters xbridge c18柱(内径4.6
×
柱长100mm，粒径3.5μm)；柱温：40℃；进样器内温度为20-30℃；进样量：20μl；流速：1ml/min；柱后3:7分流，3/10流入质谱分析；流动相a相为水，内含体积分数为0.1％的甲酸和5mmol/l的醋酸铵；流动相b相为乙腈；分析时间为6min；梯度洗脱。
44.更优选地，所述梯度洗脱的具体程序为：
45.0-0.5min，a相：b相体积比为80：20-20：80；
46.0.5-3.5min，a相：b相体积比为20：80-20：80；
47.3.5-3.51min，a相：b相体积比为20：80-80：20；
48.3.51-4.0min，a相：b相体积比为80：20-80：20；
49.4.0-4.01min，a相：b相体积比为80：20-10：90；
50.4.01-4.5min，a相：b相体积比为10：90-10：90；
51.4.5-4.51min，a相：b相体积比为10：90-80：20；
52.4.51-6min，a相：b相体积比为80：20-80：20。
53.在上述梯度洗脱程序下，12种酪氨酸激酶抑制剂能够全部出峰，得到的色谱峰更窄、监测所需时间更短。
54.优选地，所述高效液相色谱质谱联用法中，所述质谱(ms/ms)的测定条件为：
55.电离方式：电喷雾离子源(h-esi)，正离子检测模式；离子源温度为500℃；气帘气为25psi；碰撞气为10psi；雾化气为50psi；辅助气为45psi；喷雾电压为5500v；监测方式为多反应监测(mrm)模式进行一/二级质谱分析。12种酪氨酸激酶抑制剂和内标的母离子质量通道(precursor)、子离子质量通道(product)、去簇电压(declustering potential，dp)、碰撞电压(collision energy，ce)、入口电压(entrance potential，ep)、出口电压(collision exit potential，cxp)见表1。
56.上述多反应监测(mrm)模式，通过质谱中的四级杆对母离子进行选择性筛选，筛选后的离子进入碰撞池发生碰撞碎裂，产生的碎片离子进行高分辨率扫描，然后选择特征性二级碎片离子进行靶向定量，能够有效地增强选择性，提高准确度、灵敏度。为临床上酪氨酸激酶抑制剂个体化治疗提供可靠的实验数据，反馈异常结果，协助临床调整用药，在保证药物疗效的同时，规避不良反应的发生。
57.更优选地，12种酪氨酸激酶抑制剂和内标的母离子质量通道(precursor，m/z)分别为：吉非替尼447.4；厄洛替尼394.1；阿法替尼486.1；达可替尼470.4；奥希替尼500.5；埃克替尼392.3；克唑替尼450.3；色瑞替尼558.4；阿来替尼483.2；曲美替尼616.2；达拉非尼520.2；安罗替尼408.3；伏立康唑350.2，具体见图1。
58.更优选地，12种酪氨酸激酶抑制剂和内标的子离子质量通道(product，m/z)分别为：吉非替尼127.8；厄洛替尼336.2；阿法替尼371.1；达可替尼319.1；奥希替尼72.2；埃克替尼304.3；克唑替尼259.3；色瑞替尼433.2；阿来替尼396.3；曲美替尼491.1；达拉非尼307.3；安罗替尼339.3；伏立康唑281.2，具体见图1。
59.更优选地，12种酪氨酸激酶抑制剂和内标的去簇电压(declustering potential，dp，v)分别为：吉非替尼100；厄洛替尼130；阿法替尼112；达可替尼100；奥希替尼108；埃克替尼75；克唑替尼111；色瑞替尼107；阿来替尼60；曲美替尼142；达拉非尼145；安罗替尼90；伏立康唑90。
60.更优选地，12种酪氨酸激酶抑制剂和内标的碰撞电压(collision energy，ce，v)分别为：吉非替尼42；厄洛替尼35；阿法替尼40；达可替尼48；奥希替尼42；埃克替尼40；克唑替尼35；色瑞替尼67；阿来替尼35；曲美替尼58；达拉非尼45；安罗替尼33；伏立康唑27。
61.更优选地，12种酪氨酸激酶抑制剂和内标的入口电压(entrance potential，ep，v)均为10v。
62.更优选地，12种酪氨酸激酶抑制剂和内标的出口电压(collision exit potential，cxp，v)均为15v。
63.表1
[0064][0065]
优选地，步骤2)中，所述内标标准曲线法包括以下步骤：
[0066]
a1)将含有一系列不同浓度的12种酪氨酸激酶抑制剂的标准溶液，分别进行高效液相色谱质谱联用法分析，对12种酪氨酸激酶抑制剂成分及内标的特征性二级碎片离子进行提取，获得12种酪氨酸激酶抑制剂在不同浓度下的色谱峰面积/内标的色谱峰面积的比值与相应成分的不同浓度/内标的浓度的比值的线性关系，绘制相应的标准曲线，用加权最小二乘法进行回归运算，得到12种酪氨酸激酶抑制剂成分的标准曲线的回归方程；
[0067]
a2)将样品溶液进行高效液相色谱质谱联用法分析，将获得的各种酪氨酸激酶抑制剂成分与内标的色谱峰面积比，代入步骤a1)中相应成分的标准工作曲线的回归方程，并根据内标的已知浓度，计算得到样品溶液中相应酪氨酸激酶抑制剂成分的浓度。
[0068]
更优选地，步骤a1)或a2)中，所述标准工作曲线中，以12种酪氨酸激酶抑制剂成分/内标的色谱峰面积比为纵坐标(y轴)，其相应成分与内标的浓度比为横坐标(x轴)。
[0069]
本发明第二方面提供一种同时测定人血浆中十二种酪氨酸激酶抑制剂浓度的方法在临床样本血药浓度监测中的用途。
[0070]
优选地，所述血药为抗肿瘤药物酪氨酸激酶抑制剂。
[0071]
如上所述，本发明提供的一种同时测定人血浆中十二种酪氨酸激酶抑制剂浓度的方法，具有以下有益效果：
[0072]
(1)本发明提供的一种同时测定人血浆中十二种酪氨酸激酶抑制剂浓度的方法，以同时适用和满足十二种不同药物的检测需求，能够大幅度降低后续开发成本，同时，有利于检测标准的统一，从而为不同检测点或实验室采集的数据能够相互参考或使用提供可能性。
[0073]
(2)本发明提供的一种同时测定人血浆中十二种酪氨酸激酶抑制剂浓度的方法，在采用高效液相色谱质谱联用法进行分析前，对待测样品采用盐析辅助均相液液萃取进行预处理，获得了较高的回收率，并且能够避免基质效应。
[0074]
(3)本发明提供的一种同时测定人血浆中十二种酪氨酸激酶抑制剂浓度的方法，经方法学验证，具有灵敏度高、特异性强、精密度和准确度良好、稳定性好的优点；并且，各药物的提取回收率在可接受的范围内，也未见明显的基质效应，无明显的稀释效应。同时，本发明还对溶血效应进行了验证。本发明具有简便快速、通量高的优点。
[0075]
(4)本发明提供的一种同时测定人血浆中十二种酪氨酸激酶抑制剂浓度的方法，通过临床血浆样本中药物浓度的测定结果，进一步证明了本发明方法适用于临床血浆中药物浓度的测定，可用于临床上常用的抗肿瘤药物酪氨酸激酶抑制剂的血药浓度监测。
附图说明
[0076]
图1为本发明的人血浆中十二种酪氨酸激酶抑制剂及内标的二级离子图a、b、c、d、e、f、g、h、i、j、k、l、m，其中，a为吉非替尼；b为厄洛替尼；c为阿法替尼；d为达可替尼；e为奥希替尼；f为埃克替尼；g为克唑替尼；h为色瑞替尼；i为阿来替尼；j为曲美替尼；k为达拉菲尼；l为安罗替尼；m为伏立康唑。
具体实施方式
[0077]
下面结合具体实施例进一步阐述本发明，应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的保护范围。
[0078]
以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。
[0079]
以下实施例中所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市场购得的常规产品。
[0080]
实施例1
[0081]
1、样品前处理
[0082]
用甲醇作为溶剂配制内标溶液，内标溶液为1mg/ml的伏立康唑的甲醇溶液。内标溶液存放于-40℃冰箱。
[0083]
取100μl人血浆样品置于1.5ml ep管中，加入100μl的5mol/l醋酸铵的水溶液后漩涡振荡30s，沉淀血浆样本中的蛋白。再加入200μl含有内标溶液的乙腈漩涡振荡3min，在4
℃下以12000g/min转速离心10min，取100μl上清液置于进样管中，获得样品溶液待用。含有内标溶液的乙腈中内标的浓度为12ng/ml。
[0084]
2、标准溶液
[0085]
采用体积比4:1的甲醇与二甲基亚砜作为溶剂，配制药物溶液。药物溶液中12种酪氨酸激酶抑制剂的浓度均为1mg/ml。药物溶液存放于-40℃冰箱。
[0086]
取一系列100μl空白血浆样品置于1.5ml ep管中，加入100μl的5mol/l醋酸铵的水溶液后漩涡振荡30s，沉淀血浆样本中的蛋白。再分别加入含有一系列不同浓度的12种酪氨酸激酶抑制剂的药物溶液和含有内标溶液的乙腈漩涡振荡3min，在4℃下以12000g/min转速离心10min，取100μl上清液置于进样管中，获得一系列含有不同浓度的12种酪氨酸激酶抑制剂的标准溶液待用。标准溶液中内标的浓度为12ng/ml。标准溶液中所含的12种酪氨酸激酶的一系列浓度见表2。
[0087]
表2
[0088][0089][0090]
3、检测
[0091]
采用高效液相色谱质谱联用法分别检测一系列含有不同浓度的12种酪氨酸激酶抑制剂的标准溶液，将获得的样品溶液的液相色谱图，与标准溶液的液相色谱图进行比较，根据相对保留时间指认出共有特征峰定性，确定样品溶液中12种酪氨酸激酶抑制剂。
[0092]
再对12种酪氨酸激酶抑制剂成分及内标的特征性二级碎片离子进行提取，获得12种酪氨酸激酶抑制剂在不同浓度下的色谱峰面积/内标的色谱峰面积的比值与相应成分的不同浓度/内标的浓度的比值的线性关系，绘制相应的标准曲线，用加权最小二乘法进行回归运算，得到12种酪氨酸激酶抑制剂成分的标准曲线的回归方程。
[0093]
将样品溶液进行高效液相色谱质谱联用法分析，将获得的各种酪氨酸激酶抑制剂成分与内标的色谱峰面积比，代入相应成分的标准工作曲线的回归方程，并根据内标的已知浓度，计算得到样品溶液中相应酪氨酸激酶抑制剂成分的含量。
[0094]
其中，高效液相色谱(hplc)的测定条件为：色谱柱：waters xbridge c18柱(内径4.6
×
柱长100mm，粒径3.5μm)；柱温：40℃；进样器内温度为20-30℃；进样量：20μl；流速：1ml/min；柱后3:7分流，3/10流入质谱分析；流动相a相为水，内含体积分数为0.1％的甲酸和5mmol/l的醋酸铵；流动相b相为乙腈；分析时间为6min；梯度洗脱。
[0095]
梯度洗脱的具体程序为：
[0096]
0-0.5min，a相：b相体积比为80：20-20：80；
[0097]
0.5-3.5min，a相：b相体积比为20：80-20：80；
[0098]
3.5-3.51min，a相：b相体积比为20：80-80：20；
[0099]
3.51-4.0min，a相：b相体积比为80：20-80：20；
[0100]
4.0-4.01min，a相：b相体积比为80：20-10：90；
[0101]
4.01-4.5min，a相：b相体积比为10：90-10：90；
[0102]
4.5-4.51min，a相：b相体积比为10：90-80：20；
[0103]
4.51-6min，a相：b相体积比为80：20-80：20。
[0104]
质谱(ms/ms)的测定条件为：电离方式：电喷雾离子源(h-esi)，正离子检测模式；离子源温度为500℃；气帘气为25psi；碰撞气为10psi；雾化气为50psi；辅助气为45psi；喷雾电压为5500v；监测方式为多反应监测(mrm)模式进行一/二级质谱分析；12种酪氨酸激酶抑制剂和内标的母离子质量通道(precursor)、子离子质量通道(product)、去簇电压(declustering potential，dp)、碰撞电压(collision energy，ce)、入口电压(entrance potential，ep)、出口电压(collision exit potential，cxp)见表1。
[0105]
实施例2
[0106]
取一系列空白血浆样品置于1.5ml ep管中，采用上述实施例1的步骤2进行处理，制得12种酪氨酸激酶抑制剂的不同质控浓度的质控溶液。质控溶液中12种酪氨酸激酶的浓度见表3。
[0107]
表3
[0108][0109]
实施例3
[0110]
对本发明中方法进行方法学验证，主要包括线性、精密度和准确度、基质效应和回收率、稀释效应、溶血效应、稳定性。
[0111]
1、线性
[0112]
按实施例1的步骤2中表2，配制一系列含有不同浓度的12种酪氨酸激酶抑制剂的标准溶液，按实施例1的步骤3进行检测，以12种酪氨酸激酶抑制剂成分/内标的色谱峰面积比为纵坐标(y轴)，其相应成分与内标的浓度比为横坐标(x轴)，得到12种酪氨酸激酶抑制
剂成分的标准曲线的回归方程，结果如表4所示。由表4可知，12种酪氨酸激酶抑制剂成分具有良好的线性关系，相关系数(r2)均大于0.99。同时定量下限的结果也如表4所示。
[0113]
表4
[0114][0115]
2、精密度和准确度
[0116]
取上述实施例2制备的质控溶液，每个酪氨酸激酶抑制剂成分每个浓度各制备6份，每天制备一批样品，连续3天，一共制备3批。按实施例1的步骤3进行检测，计算批内和批间精密度(绝对值小于15％为合格)和准确度(85-115％为合格)，具体结果如表5所示。
[0117]
由表5可知，质控溶液样品中各酪氨酸激酶抑制剂成分的各测试浓度的准确度均在85-115％的区间内，质控溶液样品中各酪氨酸激酶抑制剂成分的各测试浓度的批内和批间精密度绝对值均小于15％。由此证明本发明方法对血浆中12种各酪氨酸激酶抑制剂成分的检测具有良好的精密度和准确度。
[0118]
表5
[0119]
[0120][0121]
3、基质效应和回收率
[0122]
取6份不同来源的人血浆样品，处理获得血浆的空白基质，以该空白基质按上述实施例2配制已知低、中、高浓度上述12种酪氨酸激酶抑制剂成分的质控溶液各6份。按实施例1的步骤3进行lc-ms/ms检测，计算12种酪氨酸激酶抑制剂成分的基质效应和回收率，结果见表6。由表6可知，本发明中方法的基质效应和回收率良好，血浆基质对上述十二个药物及内标影响程度基本一致。
[0123]
表6人血浆内基质效应和提取回收率试验(n＝6)
[0124]
[0125][0126]
4、稀释效应
[0127]
按表2中所列的12种酪氨酸激酶抑制剂成分的浓度7，配制样品溶液，每个样品溶液均制备6份。用空白血浆稀释十倍或二十倍，按上述实施例1的步骤2进行处理，按实施例1的步骤3进行检测，计算稀释溶液中12种酪氨酸激酶抑制剂成分的浓度。将浓度结果乘以10或20，计算出未稀释时的样品溶液中12种酪氨酸激酶抑制剂成分的浓度。
[0128]
将计算结果与表2中浓度7，进行比较，结果显示：10倍或20倍稀释后，各药物的精密度均在15％以内，准确度均在85-115％之间，表明在该稀释条件下，未出现明显的稀释效应，样品的精密度和准确度不受影响。
[0129]
5、溶血效应
[0130]
取空白血浆于-80℃条件下反复冻融2次，剧烈涡旋振荡3min后，12000g离心10分钟，分别取上层溶血血浆0.5、1、2、3、5、10、20、40μl加入空白血浆中，配制0％、0.05％、0.1％、0.2％、0.3％、0.5％、1％、2％、4％溶血血浆样品。用4％的溶血血浆样品按上述实施例2配制表3中浓度1和浓度4的质控样品，再按实施例1的步骤3进行检测。12种酪氨酸激酶抑制剂成分的精密度均在15％以内，准确度均在85-115％之间，表明在该溶血条件下，未出现明显的溶血效应，样品的精密度和准确度不受影响。
[0131]
6、稳定性
[0132]
考察不同条件下的血浆样品，不同条件包括室温下放置6h，30天稳定性、冻融三次及处理后进样器放置24小时。将上述血浆样品按实施例1的步骤1进行前处理，按实施例1的步骤3进行检测后，结果如表7所示。由表7可知，血浆样品中12种酪氨酸激酶抑制剂成分在上述考察条件下检测得出的re值均小于15％，在上述考察条件下本发明方法对血浆中上述12种酪氨酸激酶抑制剂成分的检测具有较强稳定性。
[0133]
表7
[0134][0135][0136]
以上所述，仅为本发明的较佳实施例，并非对本发明任何形式上和实质上的限制，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还将可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。凡熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，当可利用以上所揭示的技术内容而做出的些许更动、修饰与演变的等同变化，均为本发明的等效实施例；同时，凡依据本发明的实质技术对
上述实施例所作的任何等同变化的更动、修饰与演变，均仍属于本发明的技术方案的范围内。