基于核磁共振技术的异麦芽酮糖天然丰度双量子转移谱的测试方法

1.本发明涉及化学分析技术领域，特别涉及基于核磁共振技术的异麦芽酮糖天然丰度双量子转移谱(inadequatead)的测试方法。


背景技术：

2.异麦芽酮糖(isomaltulose)源自甜菜，是一种天然糖类，具有独特的分子结构。与蔗糖类似，它由葡萄糖和果糖分子组成，但其分子间的连接比蔗糖更强，这意味着它能被人体完全消化，但速度更慢。作为一种能够缓慢释放碳水化合物的天然成分，异麦芽酮糖能以更稳定、更持续的方式提供完整的碳水化合物能量(葡萄糖)，同时保持血糖平衡，能够在更长时间内利用体内的碳水化合物能量来源。同时，因其优良口感、低甜和具有抑制蛀牙的特性，被广泛地应用于各种食品和甜味剂中。
3.异麦芽酮糖的结构式如下：
[0004][0005]
中国专利cn100448884c，cn1324038c，cn1324039c，cn1148377c，cn1030530c报道了异麦芽酮糖的制备方法。专利cn1297217c报道了异麦芽酮糖在食物中的应用。因此如何表征、检测的异麦芽酮糖的结构显得尤为重要，更有利于异麦芽酮糖的使用。近年来，已有将二维核磁共振谱技术应用于有机分子结构的测定分析中，二维的天然丰度双量子转移实验(incredible natural abundance double quantum transfer experiment，inadequate)谱是一种
13
c-13
c化学位移相关谱，该谱在化合物结构确定及
13
c谱峰指认的nmr研究中具有重要的价值，但由于该谱灵敏度较低，做谱有一定难度，应用报告不多。目前尚没有关于异麦芽酮糖的inadequatead谱测试方法的报道。


技术实现要素：

[0006]
本发明的目的在于提供一种基于核磁共振技术的异麦芽酮糖天然丰度双量子转移谱的测试方法。通过采用绝热180
°
和梯度-90-梯度稳态的方式，并将改造的脉冲序列应用于测试异麦芽酮糖天然丰度双量子转移谱，得到更清晰的异麦芽酮糖天然丰度双量子转移谱。
[0007]
为实现上述目的，本发明提供了如下技术方案：
[0008]
一种基于核磁共振技术的异麦芽酮糖天然丰度双量子转移谱的测试方法，包括以下步骤：
[0009]
(1)将异麦芽酮糖溶于氘代二甲亚砜和四甲基硅烷(tms)的混合溶剂中，转移至核磁管中，将核磁管放入核磁谱仪的检测磁体中；
[0010]
(2)在仪器工作站中选择氘代二甲亚砜，进行调谐、匀场和锁场；
[0011]
(3)采用绝热180
°
和梯度-90-梯度稳态的脉冲方式，载入脉冲序列并设置其他检测参数；
[0012]
(4)完成设置后执行程序，得到异麦芽酮糖天然丰度双量子转移谱；
[0013]
步骤(3)中所述脉冲序列为：以碳为观测核，依次经过一个梯度场(hsgt)、一个矩形π/2脉冲(pw)、一个梯度场(hsgt)、一个驰豫延迟时间(d1)、一个矩形π/2脉冲(pw)、一段绝热脉冲(ad)、一个梯度-90-梯度稳态(compad)、一段绝热脉冲(ad)、两个矩形π/2脉冲(pw)和一个采样时间(at)。
[0014]
优选地，所述梯度场(hsgt)的时间为2.0ms；所述矩形π/2脉冲(pw)的脉冲时间为10.1μs；所述驰豫延迟时间(d1)为1.0s；所述绝热脉冲(ad)的脉冲时间为3.545ms；所述梯度-90-梯度稳态(compad)的时间为1.999ms；所述采样时间(at)为30～65ms。
[0015]
优选地，步骤(3)中所述其他检测参数包括：直接维谱宽(sw)、
13
c-13
c耦合常数(j
c-c
)、扫描次数(nt)和采集模式。
[0016]
更优选地，所述直接维谱宽(sw)为37878.8hz；所述
13
c-13
c耦合常数(j
c-c
)为45～65hz；所述扫描次数(nt)为256～512次。
[0017]
优选地，步骤(1)中所述混合溶剂中氘代二甲亚砜和四甲基硅烷的体积比为100:3；所述异麦芽酮糖在所述混合溶剂中的浓度为50mg/ml。
[0018]
本发明的有益技术效果如下：
[0019]
本发明采用基于碳核的绝热180
°
脉冲(adiabatic pulses)，比通常的inadequate谱产生更高灵敏度，特别是当碳脉冲未针对给定样品进行完美校准时，并且绝热180
°
脉冲在较宽的13c谱宽上提供了更均匀的反转。绝热脉冲是一种特殊条件下的射频脉冲，是一种电磁波。对于一个核磁共振序列，射频脉冲是不可或缺，可以说没有射频脉冲就不能产生磁共振信号。电磁振动的传播是一个电磁波，共振的本质是能量传播，如果发射一个射频(radiofrequency，rf)脉冲，且该射频脉冲的频率等于位于静电场b0磁场环境中的氢质子进动频率(即拉莫尔频率)，则质子能够吸收能量，产生能量跃迁，该现象就叫做核磁共振。rf脉冲分类很多，按对场敏感性来说，分为绝热脉冲和非绝热脉冲等。绝热脉冲所需要的时间较短，对射频场b1不敏感，保证反转角度的准确。绝热脉冲的脉宽比较长，b1幅度大，可增加样品对rf能量的吸收；为了保证绝热脉冲对b1非均匀性不敏感，脉冲角度只能选择90
°
的整倍数，可提高对流动、偏共振和弛豫效应的敏感性。此外，使用梯度-90-梯度(grad-90-grad)稳态有助于清除未松弛的磁化，这可以产生更清晰的谱图。
[0020]
由于二维inadequatead谱灵敏度较常规碳谱低两个数量级，信号灵敏度低，噪声较大，假峰较多，并且还会因为个别碳核灵敏度过低，其谱峰被噪声淹没，以及因数值分辨率不够大，因此造成峰的丢失。本发明通过优化了相关参数(
13
c-13
c耦合常数、采样时间、扫描次数)，为异麦芽酮糖样品的
13
c-13
c化学位移相关谱测定提供了一种简便有效的手段。
附图说明
[0021]
图1为本发明实施例1中异麦芽酮糖的
13
c谱的脉冲序列；
[0022]
其中，脉冲序列的时序分为预备期、演化期和检测期三个时期，以碳为观测核，在预备期经过一段弛豫延迟时间(d1)；在演化期x轴上加一个矩形π激发脉冲(p1)，经过脉冲
间隔时间(d2)后再加上一个矩形π/2脉冲(pw)；在检测期设置采样时间(at)，接收机记录自由衰减信号；
[0023]
弛豫延迟时间(d1)为1.0s，矩形π脉冲(p1)为0.0μs，脉冲间隔时间(d2)为0.0μs，矩形π/2脉冲(pw)为5.05μs，脉冲后的采样时间(at)为865.075ms。
[0024]
图2为本发明实施例1测得的异麦芽酮糖的
13
c谱图。
[0025]
图3为本发明实施例1中异麦芽酮糖的inadequatead谱的脉冲序列；
[0026]
其中，脉冲序列的时序分为预备期、演化期和检测期三个时期，以碳为观测核，依次经过一个梯度场(hsgt)、一个矩形π/2脉冲(pw)、一个梯度场(hsgt)、一个弛豫延迟时间(d1)，使磁化矢量处于热平衡态，加一个矩形π/2脉冲(pw)，分别依次经过一段绝热脉冲(ad)、一个梯度-90-梯度稳态(compad)、一段绝热脉冲(ad)、两个矩形π/2脉冲(pw)；在检测期设置采样时间(at)，接收机记录自由衰减信号；
[0027]
梯度场(hsgt)的时间为2.0ms，矩形π/2脉冲(pw)的脉冲时间为10.1μs，弛豫延迟时间(d1)为1.0s，绝热脉冲(ad)的脉冲时间为3.545ms，梯度-90-梯度稳态(compad)为1.999ms；脉冲后的采样时间(at)为54.067ms。
[0028]
图4为本发明实施例1测得的异麦芽酮糖的inadequatead谱图。
具体实施方式
[0029]
现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。
[0030]
另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
[0031]
除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。
[0032]
关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。
[0033]
本发明实施例所采用的样品是异麦芽酮糖，实验测试是在一台agilent600mhz nmr谱议(agilent，usa)下进行，整个实验过程没有对样品进行任何样品预处理、没有改动仪器硬件设施。
[0034]
实施例1
[0035]
异麦芽酮糖inadequatead谱测定的具体步骤如下：
[0036]
步骤1，称取异麦芽酮糖装入试管，加入氘代二甲亚砜少量tms(体积比为100:3)，超声溶解充分，转入核磁管中，然后将装好样品(异麦芽酮糖浓度为50mg/ml)的试管放入核磁谱仪的检测磁体中；
[0037]
步骤2，在仪器工作站里选择相应氘代溶剂，进行调谐、匀场、锁场；
[0038]
步骤3，设置
13
c的测试参数：打开脉冲序列，设置实验条件包括直接维谱宽、扫描次
数、采集模式；
[0039]
本步骤中的脉冲序列为：以碳观测核，经过一个弛豫延迟时间(d1)，使磁化矢量处于热平衡态；加一个矩形π激发脉冲(p1)，经过一段脉冲间隔时间(d2)后加上一个矩形π/2脉冲(pw)；最后紧跟着是采样时间(at)，用于采集最终信号；
[0040]
本步骤中，实验参数设置如下：直接维谱宽(sw)为37878.8hz，弛豫延迟时间(d1)为1.0s，矩形π/2脉冲(pw)的脉冲时间为5.05μs，单个采样时间的采样时间(at)为865.075ms，重复扫描次数(nt)为512次，整个采样周期为24min，如图1所示。
[0041]
步骤4，完成实验参数设置后，直接执行数据预采样；
[0042]
步骤5，当数据预采样全部完成后，进行数据后处理，得到异麦芽酮糖的
13
c谱，如图2所示。
[0043]
步骤6，基于步骤3中的
13
c的测试结果，设置inadequatead的测试参数；打开脉冲序列，设置实验条件包括直接维谱宽、
13
c-13
c耦合常数、扫描次数、采集模式；
[0044]
本步骤中的脉冲序列为：以碳为观测核，依次经过一个梯度场(hsgt)、一个矩形π/2脉冲(pw)、一个梯度场(hsgt)、一个弛豫延迟时间(d1)，使磁化矢量处于热平衡态，加一个矩形π/2脉冲(pw)，分别依次经过一段绝热脉冲(ad)、一个梯度-90-梯度稳态(compad)、一段绝热脉冲(ad)、两个矩形π/2脉冲(pw)；在检测期设置采样时间(at)，接收机记录自由衰减信号；
[0045]
本步骤中，实验参数设置如下：直接维谱宽(sw)为37878.8hz，梯度场(hsgt)的时间为2.0ms，弛豫延迟时间(d1)为1.0s，矩形π/2脉冲(pw)的脉冲时间为10.1μs，
13
c-13
c耦合常数(j
c-c
)为55hz，绝热脉冲(ad)的脉冲时间为3.545ms，梯度-90-梯度稳态(compad)的时间为1.999ms，脉冲后的采样时间(at)为54.067ms，扫描次数(nt)为450次，整个采样周期为17h，如图3所示。
[0046]
步骤7，完成实验参数设置后，直接执行数据预采样；
[0047]
步骤8，当数据预采样全部完成后，进行数据后处理，得到异麦芽酮糖的inadequatead谱，如图4所示。
[0048]
实施例2
[0049]
如表1所示，本实施例在实施例1的基础上对不同
13
c-13
c耦合常数(j
c-c
)进行了优选，若不合适的耦合常数会造成峰的丢失。分别设
13
c-13
c耦合常数(j
c-c
)为45hz、55hz、65hz，发现当最大值为55hz时，测得的inadequatead相关点数目最多，基本稳定，故优选为55hz。
[0050]
表1样品在不同
13
c-13
c耦合常数(j
c-c
)的inadequatead谱的信号相应表
[0051][0052][0053]
实施例3
[0054]
如表2所示，本实施例根据检测的直接维谱宽(sw)为37878.8hz，在实施例1的基础
上，调整了采样时间的采样时间(at)，由55ms设置为35ms、75ms，发现测得的inadequatead相关点数目变化较大，特别是采样时间为35ms时会峰出现“侧摆”，说明采样时间为35ms时设置过短。故优选采样时间(at)为54.067ms。
[0055]
表2样品在不同采样时间(at)的inadequatead谱的信号相应表
[0056]
序号采样时间(ms)inadequatead相关点数目1at＝35.01282at＝54.067123at＝74.3529
[0057]
实施例4
[0058]
如表3所示，本实施例在实施例1和2的基础上，对扫描次数(nt)进行了优选，分别设置256次、450次和512次，发现扫描450次与512次的结果变化不大，趋于稳定，说明对扫描次数的优化较为有效且扫描450次已足够，故扫描次数(nt)为450次。
[0059]
表3样品在不同扫描次数(nt)的inadequatead谱的信号相应表
[0060]
序号扫描次数inadequatead相关点数目1nt＝256102nt＝450123nt＝51212
[0061]
从以上表中可以看出，本发明所提出的方法能够测定异麦芽酮糖的inadequatead谱，这有利于剖析异麦芽酮糖的碳碳连接的结构信息。由此可见，利用本发明所述的方法能够测定异麦芽酮糖的inadequatead谱，而且当直接维谱宽(sw)为37878.8hz，
13
c-13
c耦合常数(j
c-c
)为55hz，梯度-90-梯度稳态(compad)为1.999ms；单次采样的采样时间(at)为54.067ms，重复扫描次数(nt)为450次，整个采样周期为17h时，效果最佳。
[0062]
以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。