植物质外体铅离子和/或镉离子示踪方法和Leadmium与流程

植物质外体铅离子和/或镉离子示踪方法和leadmium
tm
green am新用途
技术领域
1.本发明涉及植物细胞中金属元素的示踪方法，尤其是植物质外体铅离子和/或镉离子示踪方法和leadmium
tm green am试剂的新用途。


背景技术：

2.目前，土壤铅、镉等重金属污染形式严峻。而利用植物对重金属的吸收和积累来修复铅、镉等重金属污染土壤，因其经济、环境友好，被当作理想的重金属污染土壤治理修复方法。近年来，大量研究致力于解析植物吸收、转运和积累铅、镉等重金属的机制。在植物中，铅和镉等重金属的吸收和转运经由两条途径：细胞内途径(共质体途径)和细胞外途径(质外体途径)。如何精确和特异的指示胞内和胞外的铅、镉等重金属离子一直是植物吸收转运重金属研究的热点和难点。
3.leadmium
tm green am(铅离子/镉离子绿色荧光探针)是thermofisher scientific旗下品牌invitrogen的专利产品，是一种独特的工具用来高度特异性和高灵敏度的检测细胞内铅(lead,pb)离子和镉(cadmium,cd)离子水平。该指示剂中的am(acetoxymethyl)基团一方面可以促进指示剂跨膜进入细胞内，另一方面能够阻止指示剂与铅、镉离子结合。当leadmuim
tm green am进入细胞后，细胞质中的非特异性酯酶会水解掉am基团，从而释放出带电荷的leadmium
tm green，其与细胞内的铅、镉离子易于结合，并在特定波长照射发出荧光，由此实现对细胞内铅、镉离子的示踪和检测。由此可见，leadmium
tm green am试剂只能用于指示细胞内的铅、镉离子，而不能用于对细胞外(质外体)铅、镉离子的特异性指示。


技术实现要素：

4.(一)要解决的技术问题
5.鉴于现有技术的上述缺点、不足，本发明提供一种植物质外体铅离子和/或镉离子示踪方法以及leadmium
tm green am新用途。该方法主要是通过对leadmium
tm green am进行改性处理，去除其所带的am(acetoxymethyl)基团，使其不能进入细胞内并易于与细胞外的铅离子和/或镉离子结合产生荧光效应，借此用于对植物质外体中的铅离子和/或镉离子进行指示和示踪。
6.(二)技术方案
7.为了达到上述目的，本发明采用的主要技术方案包括：
8.第一方面，本发明提供一种植物质外体铅离子和/或镉离子示踪方法，其包括：
9.s1、先对leadmium
tm green am进行改性处理，去掉其连接的am基团，得到不含am基团的leadmium
tm green-，并配成溶液；
10.s2、将植物组织与上述不含am基团的leadmium
tm green-溶液混合、避光孵育，孵育结束后，将植物组织取出，用适当波长的光照射植物组织，检测观察植物组织细胞外的荧光
am溶液、pre-leadmium溶液后，在荧光显微镜下观察的荧光情况。
具体实施方式
24.为了更好的解释本发明，以便于理解，下面结合附图，通过具体实施方式，对本发明作详细描述。
25.本发明使用酯酶体外水解掉leadmuim
tm green am的am基团，使该指示剂不能进入细胞内(共质体)，并且能够在体外结合铅、镉离子。预处理后的leadmuim
tm green-，可应用于植物细胞外(质外体)铅离子和/或镉离子特异性示踪，开拓了leadmuim
tm green am的新用途，解决了特异性指示细胞外(质外体)铅、镉离子的科学难题。
26.以下结合具体实施例，对本发明的方案和技术效果说明。
27.实施例1
28.本实施例采用生化方法(酯酶)体外水解掉leadmuim
tm green am的am基团。
29.试剂：leadmuim
tm green am(a10024,invitrogen,paisley,uk)
30.dmso(d2650,sigma,st louis,usa)
31.酯酶(46058,sigma,st louis,usa)
32.水解leadmuim
tm green am的am基团的方法为：
33.(1)取50μg leadmuim
tm green am粉末，加入10μl dmso溶解，随后加入490μl去离子水，配成终浓度为100μg/ml的溶液。
34.(2)将酯酶粉末用去离子水配成100u/ml的溶液。
35.(3)取500μl leadmuim
tm green am溶液，加入100μl酯酶，混匀，25℃避光反应30min。
36.此混合液为预处理后的leadmuim
tm green am，命名为“pre-leadmium”，以下“pre-leadmium”均指该预处理后的leadmuim
tm green am或记作leadmuim
tm green-。
37.本发明的实施例采用生化方法(酯酶)体外水解am基团对leadmuim
tm green am进行改造，改造后的产物不残留任何对细胞有毒的因子。相比利用化学方法(如甲醇+氢氧化钾)，可避免使用化学试剂如甲醇或强碱等对植物细胞产生的毒害作用。同时，化学方法使用的有机溶剂(如甲醇)还会改变细胞膜通透性，导致细胞内和细胞外铅、镉离子分布发生改变。相对而言，酯酶广泛存在于在植物细胞内，外源酯酶对植物细胞活性和细胞膜的通透性几无影响。因此，本发明使用生化方法水解掉leadmuim
tm green am的am基团，对植物细胞干扰小，从而能够更加准确的指示植物质外体中的铅、镉离子。
38.实施例2
39.本实施例验证“pre-leadmium”是否具有在细胞外结合铅离子并受激发光激发产生荧光的特性。
40.将实施例1制备的100μg/ml的leadmuim
tm green am溶液、实施例1制备的“pre-leadmium”和实施例1制备的100u/ml的酯酶分别取50μl滴加到载玻片上，随后，在载玻片上分别滴加20μl的硝酸铅溶液(50μmol/l)或氯化镉溶液(50μmol/l)。将载玻片室温避光反应5min，在荧光显微镜下观察荧光情况。
41.结果如图1所示，“leadmiumtm green am+pb/cd”以及“酯酶+pb/cd”和均没有荧光，而“pre-leadmium+pb/cd”均有荧光，这说明了酯酶预处理后的leadmuim
tm green am
(“pre-leadmium”)仍能够在体外和铅、镉离子结合，并发出荧光。而leadmuim
tm green am不能直接与铅、镉离子结合。
42.实施例3
43.本实施例为对pre-leadmium的应用，对杨树根质外体的铅进行示踪实验，实验方法如下：
44.(1)按照实施例1的方法准备100μg/ml的leadmuim
tm green am溶液、实施例1制备的“pre-leadmium”溶液，配制5mmol/l硝酸铅溶液、20mmol/l edta-na2溶液(去离子水配制)。
45.(2)试验材料为灰杨(populus
×
canescense)幼苗的根。将灰杨组培苗转移到8l营养液(1/4hoagland)中培养1个月，随后在营养液中加入80ml 5mmol/l的硝酸铅溶液，进行铅处理。加入硝酸铅前将营养液中的磷酸二氢钾移除，防止出现铅沉淀。2天后，采集新鲜铅处理灰杨根尖和未处理的灰杨根尖，进行染色。
46.(3)将新鲜的灰杨根尖浸入10ml 20mmol/l的edta-na2溶液中，室温静置1min，随后取出，用去离子水冲洗3次。
47.将根尖分为两部分，分别浸入leadmuim
tm green am溶液和pre-leadmium溶液中，室温避光静置1h，随后取出，用去离子水冲洗3次。利用激光共聚焦显微镜观察灰杨根尖上的荧光分布情况，激发光为488nm，接收光为505-545nm。
48.如图2所示，在对照根尖(未使用硝酸铅处理的)中并未发现荧光信号，但在铅处理的根尖中有明显的荧光信号，且leadmuim
tm green am染色结果和pre-leadmium染色结果存在明显差异。leadmuim
tm green am染色后，荧光信号主要分布在根尖顶端的细胞内，而pre-leadmium染色后，荧光信号主要分布在根尖中后部和根毛区的胞外空间。由此说明，pre-leadmium可与根尖细胞外的铅离子结合并可在激发光下产生荧光，因此能够用于特异性地指示植物细胞外铅、镉离子的分布情况。
49.最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。