一种结合雌激素片中游离甾体杂质含量的检测方法与流程

1.本发明属于药物分析领域，涉及一种结合雌激素片中游离甾体杂质含量的检测方法，具体涉及一种结合雌激素片中游离甾体杂质含量的高效液相色谱检测方法。


背景技术：

2.结合雌激素片是一种雌激素类药物，主要是用来治疗女性更年期综合症。绝经期的女性由于缺乏雌激素，容易出现血管舒缩症状，有血管舒缩症状时，会表现为有潮热和轰热出汗，每天可能会发作数次，严重影响到患者的工作和生活。通过服用结合雌激素片可以适当的补充一些雌激素，有利于缓解这种血管舒缩症状。
3.结合雌激素片中含有从孕母马尿液中提取的雌激素混合物，为水溶性雌激素硫酸钠盐混合物。雌激素硫酸钠盐降解会产生一些游离甾体杂质，主要包括雌酮、马烯雌酮和17α-二氢马烯雌酮。现有的测定结合雌激素片含量的方法中，往往无法对非游离雌激素及游离的雌激素杂质进行区分，导致含量检测不准确。因此，有必要开发一种准确测定结合雌激素片中游离甾体杂质含量的检测方法。目前药物中游离甾体杂质含量的检测方法均为气相色谱法，且操作复杂，步骤繁多，其重复性与精密度均不理想，不适用于结合雌激素片剂，具有一定的应用局限性。
4.因此如何实现快速、高效、简便，经济地测定结合雌激素片中游离甾体杂质的含量成为了本领域亟待解决的问题。


技术实现要素：

5.针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种结合雌激素片中游离甾体杂质含量的检测方法，具体提供一种结合雌激素片中游离甾体杂质含量的高效液相色谱检测方法。
6.为达到此发明目的，本发明采用以下技术方案：
7.第一方面，本发明提供一种结合雌激素片中游离甾体杂质含量的检测方法，所述检测方法包括：对待测结合雌激素片溶液与甾体杂质标准对照液进行高效液相色谱分析，根据分析结果利用外标法计算得到所述结合雌激素片中游离甾体杂质含量；
8.所述游离甾体杂质包括雌酮、马烯雌酮或17α-二氢马烯雌酮中的任意一种或至少两种的组合。
9.本发明提供的方法适用于对结合雌激素片中雌酮、马烯雌酮或17α-二氢马烯雌酮中任意一种单杂质组分进行检测，也适用于对雌酮和马烯雌酮的组合、马烯雌酮与17α-二氢马烯雌酮的组合、雌酮与17α-二氢马烯雌酮的组合进行检测，也适用于同时对雌酮、马烯雌酮和17α-二氢马烯雌酮进行检测。
10.本发明提供的检测方法专属性好、精密度高、准确度高、分析快速、操作简便，对具有重要的应用价值。
11.优选地，所述待测结合雌激素片溶液的制备方法包括：利用稀释液对待测结合雌
激素片进行溶解，离心，收集上清液，即得。
12.所述甾体杂质标准对照液的制备方法包括：利用稀释液对甾体杂质标准品进行溶解，稀释，即得。
13.优选地，所述离心的转速为2000-20000rpm，例如2000rpm、3000rpm、4000rpm、5000rpm、6000rpm、7000rpm、8000rpm、9000rpm、10000rpm、12000rpm、14000rpm、16000rpm、18000rpm、20000rpm等。
14.优选地，所述待测结合雌激素片溶液中结合雌激素的浓度为0.11-0.13mg/ml，例如0.11mg/ml、0.112mg/ml、0.114mg/ml、0.116mg/ml、0.118mg/ml、0.12mg/ml、0.122mg/ml、0.124mg/ml、0.126mg/ml、0.128mg/ml、0.13mg/ml等，所述甾体杂质标准对照液中甾体杂质的浓度为1.4-1.7μg/ml，例如1.4μg/ml、1.42μg/ml、1.45μg/ml、1.47μg/ml、1.5μg/ml、1.52μg/ml、1.55μg/ml、1.57μg/ml、1.6μg/ml、1.62μg/ml、1.65μg/ml、1.67μg/ml、1.7μg/ml等。
15.优选地，所述稀释液包括80％-95％甲醇水溶液，例如80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％等，所述80％-95％为甲醇在溶液中的体积百分含量。
16.优选地，所述高效液相色谱分析中使用的色谱柱为八烷基键合硅胶色谱柱。
17.优选地，所述色谱柱的规格为4.6mm
×
250mm，5μm。
18.优选地，所述高效液相色谱分析中使用的流动相包括a相和b相，所述a相为30％的乙腈水溶液，所述b相为95％的乙腈水溶液。所述30％和95％是指乙腈在溶液中的体积百分含量。
19.优选地，所述高效液相色谱分析中采用梯度洗脱方式。
20.优选地，所述梯度洗脱的程序为：
21.在0min，a相的体积占比为100％，b相的体积占比为0％；后匀速变化至第30min，a相的体积占比为70-80％，b相的体积占比为20-30％；后匀速变化至第33min，a相的体积占比为5-15％，b相的体积占比为85-95％；在33-37min内，恒定a相的体积占比为5-15％，b相的体积占比为85-95％；后匀速变化至第40min，a相的体积占比为100％，b相的体积占比为0％；最后在40-45min内，恒定a相的体积占比为100％，b相的体积占比为0％。
22.上述70-80％中的具体数值例如70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％等。
23.上述20-30％中的具体数值例如20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％等。
24.上述5-15％中的具体数值例如5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％等。
25.上述85-95％中的具体数值例如85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％等。
26.优选地，所述高效液相色谱分析中的流速为1.4-1.6ml/min，例如1.4ml/min、1.42ml/min、1.45ml/min、1.47ml/min、1.5ml/min、1.52ml/min、1.55ml/min、1.57ml/min、1.6ml/min等。
27.优选地，所述高效液相色谱分析中的进样体积为15-25μl，例如15μl、16μl、17μl、18μl、19μl、20μl、21μl、22μl、23μl、24μl、25μl等。
28.优选地，所述高效液相色谱分析中的柱温设置为28-32℃，例如28℃、28.5℃、29℃、29.5℃、30℃、30.5℃、31℃、31.5℃、32℃等。
29.本发明所述的数值范围不仅包括上述列举的点值，还包括没有列举出的上述数值范围之间的任意的点值，限于篇幅及出于简明的考虑，本发明不再穷尽列举所述范围包括的具体点值。
30.相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：
31.本发明提供了一种结合雌激素片中游离甾体杂质含量的检测方法，所述检测方法包括：对待测结合雌激素片溶液与甾体杂质标准对照液进行高效液相色谱分析，根据分析结果利用外标法计算得到所述结合雌激素片中游离甾体杂质含量；所述游离甾体杂质包括雌酮、马烯雌酮或17α-二氢马烯雌酮中的任意一种或至少两种的组合。本发明提供的方法专属性好、精密度高(rsd％在3.2以下)、准确度高(回收率87.4％-96.3％)、分析快速、操作简便，具有重要的应用价值。
附图说明
32.图1为实施例1中待测药物溶液的色谱图，其中1—17α-二氢马烯雌酮峰、2—马烯雌酮峰、3—雌酮峰。
33.图2为实施例1中甾体杂质标准对照液的色谱图，其中1—17α-二氢马烯雌酮峰、2—马烯雌酮峰、3—雌酮峰。
34.图3为空白溶液的色谱图。
具体实施方式
35.下面通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。
36.下述实施例所涉及的结合雌激素片的具体信息如下：
37.规格：0.3mg，生产厂家：南通联亚药业，产品批号：0253007。
38.实施例1
39.本实施例提供一种结合雌激素片中游离甾体杂质含量的检测方法，具体步骤如下：
40.(1)待测药物溶液的配制：
41.取不少于十片的结合雌激素片，研磨至精细粉末。取约含有1.2mg结合雌激素的粉末置于50ml离心管中，加入10.0ml 95％(v/v)甲醇水溶液，盖紧，涡旋5min后再超声5min。于4000rpm离心10min。再将上清液于15000rpm离心5min直至溶液澄清。将上清液装至液相进样小瓶，得待测药物溶液。
42.(2)甾体杂质标准对照液的配制：
43.称取雌酮、马烯雌酮及17α-二氢马烯雌酮标准品各2.6mg，置于50ml量瓶中，用95％(v/v)甲醇水溶液溶解并稀释至刻度，摇匀，制成各杂质浓度均为52μg/ml的对照品储备液。精密量取3.0ml，置于100ml量瓶中，用95％(v/v)甲醇水溶液定容至刻度，摇匀，配成各杂质浓度均为1.56μg/ml的甾体杂质标准对照液。
44.(3)高效液相色谱分析
45.仪器与条件：
46.美国沃特世e2690色谱系统及empower工作站，色谱柱：沃特世zorbax rx-c8，内径4.6mm，柱长250mm,，填料粒径5μm；流速：1.5ml/min；进样体积：20μl；柱温：30℃；运行时间：45min；检测波长：205nm(紫外检测器)；
47.流动相a：乙腈：水＝3:7(v/v)；
48.流动相b：乙腈：水＝95:5(v/v)；
49.梯度洗脱程序：
[0050][0051][0052]
分别对甾体杂质标准对照液和待测药物溶液进行高效液相色谱分析，记录色谱图，计算游离甾体杂质含量。
[0053]
实施例2
[0054]
本实施例提供一种结合雌激素片中游离甾体杂质含量的检测方法，具体步骤如下：
[0055]
(1)待测药物溶液的配制：
[0056]
取不少于十片的结合雌激素片，研磨至精细粉末。取约含有1.1mg结合雌激素的粉末置于50ml离心管中，加入10.0ml 80％(v/v)甲醇水溶液，盖紧，涡旋5min后再超声5min。于5000rpm离心10min。再将上清液于18000rpm离心5min直至溶液澄清。将上清液装至液相进样小瓶，得待测药物溶液。
[0057]
(2)甾体杂质标准对照液的配制：
[0058]
称取雌酮、马烯雌酮及17α-二氢马烯雌酮标准品各2.4mg，分别置于50ml量瓶中，用80％(v/v)甲醇水溶液溶解并稀释至刻度，摇匀，制成各杂质浓度均为48μg/ml的对照品储备液。精密量取3.0ml，置于100ml量瓶中，用95％(v/v)甲醇水溶液定容至刻度，摇匀，配成各杂质浓度均为1.44μg/ml的甾体杂质标准对照液。
[0059]
(3)高效液相色谱分析
[0060]
仪器与条件：
[0061]
美国沃特世e2690色谱系统及empower工作站，色谱柱：沃特世zorbax rx-c8，内径4.6mm，柱长250mm,，填料粒径5μm；流速：1.4ml/min；进样体积：18μl；柱温：28℃；运行时间：45min；检测波长：205nm(紫外检测器)；
[0062]
流动相a：乙腈：水＝3:7(v/v)；
[0063]
流动相b：乙腈：水＝95:5(v/v)；
[0064]
梯度洗脱程序：
[0065]
时间(min)流动相a(％)流动相b(％)01000307030331585371585401000451000
[0066]
分别对甾体杂质标准对照液和待测药物溶液进行高效液相色谱分析，记录色谱图，计算游离甾体杂质含量。
[0067]
实施例3
[0068]
本实施例提供一种结合雌激素片中游离甾体杂质含量的检测方法，具体步骤如下：
[0069]
(1)待测药物溶液的配制：
[0070]
取不少于十片的结合雌激素片，研磨至精细粉末。取约含有1.3mg结合雌激素的粉末置于50ml离心管中，加入10.0ml 90％(v/v)甲醇水溶液，盖紧，涡旋5min后再超声5min。于3000rpm离心15min。再将上清液于16000rpm离心5min直至溶液澄清。将上清液装至液相进样小瓶，得待测药物溶液。
[0071]
(2)甾体杂质标准对照液的配制：
[0072]
称取雌酮、马烯雌酮及17α-二氢马烯雌酮标准品各2.8mg，分别置于50ml量瓶中，用90％(v/v)甲醇水溶液溶解并稀释至刻度，摇匀，制成各杂质浓度均为56μg/ml的对照品储备液。精密量取3.0ml，置于100ml量瓶中，用95％(v/v)甲醇水溶液定容至刻度，摇匀，配成各杂质浓度均为1.68μg/ml的甾体杂质标准对照液。
[0073]
(3)高效液相色谱分析
[0074]
仪器与条件：
[0075]
美国沃特世e2690色谱系统及empower工作站，色谱柱：沃特世zorbax rx-c8，内径4.6mm，柱长250mm,，填料粒径5μm；流速：1.6ml/min；进样体积：22μl；柱温：32℃；运行时间：45min；检测波长：205nm(紫外检测器)；
[0076]
流动相a：乙腈：水＝3:7(v/v)；
[0077]
流动相b：乙腈：水＝95:5(v/v)；
[0078]
梯度洗脱程序：
[0079][0080][0081]
分别对甾体杂质标准对照液和待测药物溶液进行高效液相色谱分析，记录色谱图，计算游离甾体杂质含量。
[0082]
实施例4
[0083]
本实施例提供一种结合雌激素片中游离甾体杂质含量的检测方法，其与实施例1的区别仅在于将色谱柱替换为zorbax rx-c18，4.6
×
250mm，5μm。其他条件均保持不变。
[0084]
实施例5
[0085]
本实施例提供一种结合雌激素片中游离甾体杂质含量的检测方法，其与实施例1的区别仅在于将流动相a替换为30％(v/v)的甲醇水溶液，将流动相b替换为95％(v/v)甲醇水溶液。其他条件不变。
[0086]
实施例6
[0087]
本实施例提供一种结合雌激素片中游离甾体杂质含量的检测方法，其与实施例1的区别仅在于将流动相a替换为30％(v/v)的乙醇水溶液，将流动相b替换为95％(v/v)乙醇水溶液。其他条件不变。
[0088]
实施例7
[0089]
本实施例提供一种结合雌激素片中游离甾体杂质含量的检测方法，其与实施例1的区别仅在于将“流动相a：乙腈：水＝3:7(v/v)；流动相b：乙腈：水＝95:5(v/v)”替换为“流动相a：乙腈：水＝35:65(v/v)；流动相b：乙腈：水＝98:2(v/v)”。其他条件不变。
[0090]
实施例8
[0091]
本实施例提供一种结合雌激素片中游离甾体杂质含量的检测方法，其与实施例1的区别仅在于将“流动相a：乙腈：水＝3:7(v/v)；流动相b：乙腈：水＝95:5(v/v)”替换为“流动相a：乙腈：水＝25:75(v/v)；流动相b：乙腈：水＝90:10(v/v)”。其他条件不变。
[0092]
实施例9
[0093]
本实施例提供一种结合雌激素片中游离甾体杂质含量的检测方法，其与实施例1的区别仅在于将液相色谱的梯度洗脱程序改为：
[0094]
时间(min)流动相a(％)流动相b(％)010003065353359537595401000451000
[0095]
其他条件保持不变。
[0096]
实施例10
[0097]
本实施例提供一种结合雌激素片中游离甾体杂质含量的检测方法，其与实施例1的区别仅在于将液相色谱的梯度洗脱程序改为：
[0098][0099][0100]
其他条件保持不变。
[0101]
实施例11
[0102]
本实施例提供一种结合雌激素片中游离甾体杂质含量的检测方法，其与实施例1的区别仅在于将液相色谱的洗脱程序改为等度洗脱：流动相a：75％，流动相b：25％。其他条件均保持不变。
[0103]
测试例
[0104]
对上述实施例中的分析条件进行方法学考察，包括可行性、专属性、准确性(回收率)、精密度，具体如下：
[0105]
实施例1中待测药物溶液和甾体杂质标准对照液经高效液相色谱分析得到的色谱图分别见图1和图2。将95％(v/v)甲醇水溶液经涡旋5min，超声5min，于4000rpm离心10min，再于15000rpm离心5min后装至液相进样小瓶，作为空白溶液，其经高效液相色谱分析得到的色谱图见图3。图中纵坐标表示时间(min)，其中1—17α-二氢马烯雌酮峰、2—马烯雌酮峰、3—雌酮峰。结果显示：17α-二氢马烯雌酮峰的保留时间为11.5min左右，马烯雌酮峰的
保留时间为13.9min左右，雌酮峰的保留时间为14.9min左右，各峰互不干扰，峰形良好，分离效果好，且空白溶液在各峰的保留时间附近无干扰，说明本方法充分可行，专属性优异。
[0106]
准确度(回收率)
[0107]
分别配制浓度为0.3％的各杂质的回收率溶液各三份、浓度为3.4％的各杂质的回收率溶液各三份、浓度为1.4％的各杂质的回收率溶液各六份(每种杂质12份回收率溶液)，分别测定其含量，实测值与理论值比较，计算回收率，结果见表1-1、表1-2和表1-3。
[0108]
表1-1
[0109][0110]
表1-2
[0111]
[0112][0113]
表1-3
[0114]
[0115][0116]
精密度
[0117]
分别平行配制6份回收率样品药物溶液(结合雌激素片)，由同一个分析员在尽可能相同的条件下进行测试，计算所得6份待测药物溶液中游离甾体杂质含量的相对标准差(rsd％)。结果如表2所示：
[0118]
表2
[0119]
[0120][0121]
由表1和表2的数据可知：采用本发明所涉及的结合雌激素片中游离甾体杂质含量的检测方法，各杂质在各浓度水平的回收率结果良好(87.4％-96.3％)，说明本方法的准确性较高。精密度试验中，平行配制6份样品进行检测，得到的结果的相对标准偏差在3.2以下，小于限度10.0，说明本方法精密度良好。
[0122]
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的一种结合雌激素片中游离甾体杂质含量的检测方法，但本发明并不局限于上述实施例，即不意味着本发明必须依赖上述实施例才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
[0123]
以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。
[0124]
另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。