通过质谱法的C肽检测的制作方法

通过质谱法的c肽检测
1.本技术是分案申请，原申请的申请日是2013年12月23日，申请号为201380073416.x(pct/us2013/077575)，发明名称为“通过质谱法的c肽检测”。
2.相关申请的交叉引用
3.本技术根据美国法典第35卷第102条(e)款规定要求于2012年12月26日提交的美国临时申请序列号61/745,976的权益，其内容通过引用整体并入本文。
发明领域
4.本发明涉及定量测量c肽。在具体方面，本发明涉及通过质谱法定量测量c肽的方法。
5.发明背景
6.以下对本发明背景的描述被提供仅仅是作为帮助理解本发明，并不意在描述或构成本发明的现有技术。
7.c肽是在从胰腺内胞吞小泡释放之前，作为胰岛素原(通过裂解)转化成胰岛素的过程的部分而形成的肽。人c肽的摩尔质量约为3020.3amu。
8.c肽与细胞表面的受体结合，并将引起刺激na+、k+atp酶和内皮型一氧化氮合酶(enos)的信号传导途径激活。这些酶在2型糖尿病中都具有降低的活性。c肽也起着修复动脉肌层的作用。
9.c肽水平而非胰岛素通常在新诊断出患糖尿病的患者中测量，因为门静脉中的胰岛素浓度会比外周循环高2至10倍的范围。肝脏从血浆中提取约一半的胰岛素，但这会随着受试者的营养状况而变化。因此，c肽可以是比胰岛素直接测量更加全面的胰岛素状态的指标。1型糖尿病患者无法有效产生胰岛素，因而将有下降的c肽水平，而2型糖尿病患者的c肽水平通常是正常的或甚至升高的。因此，c肽测量用于将1型糖尿病与2型糖尿病区分开。另外，当在天然胰岛素产生过程中形成c肽时，在经受胰岛素治疗的患者中测量c肽可有助于确定患者正产生多少天然胰岛素。
10.c肽测量还可用于确定患者是否可能具有与多发性内分泌肿瘤综合征相关的胃泌素瘤。存在胃泌素瘤的大量多发性内分泌肿瘤综合症还包括胰腺腺瘤、甲状旁腺腺瘤和垂体腺瘤。更高水平的c肽与胃泌素瘤的存在一起提示，除了胃之外的器官可携带肿瘤。c肽还可在疑似有胰岛素滥用的患者和患多囊卵巢综合征的妇女中进行评估，以评估胰岛素抗性的程度。
11.发明概述
12.本发明提供通过质谱法测定样品中c肽的存在或含量的方法。
13.本文呈现的一些实施方式利用串联质谱法。在这些实施方式的一些中，方法包括：(a)将疑似含c肽的样品经历高效液相色谱法(hplc)以得到c肽富集的部分；(b)将富集的c肽在适合产生质谱法可检测的一种或多种c肽离子的条件下经历电离源；(c)通过串联质谱法测定一种或多种c肽离子的量，其中所测定的离子包括具有质荷比为1007.5
±
0.5的前体离子和选自具有由927.6
±
0.5、785.4
±
0.5和646.1
±
0.5组成的质荷比的离子组的一种或
多种碎片离子。在这些实施方式中，步骤(c)中所测定的一种或多种离子的量与样品中c肽的量相关，例如，用于测定样品中c肽的量。在一些实施方式中，hplc是1-d hplc。在一些实施方式中，选自927.6
±
0.5、785.4
±
0.5和646.1
±
0.5的两种或多种碎片离子的量在步骤(c)中被测定。
14.在利用串联质谱法的其它实施方式中，方法包括：(a)将样品经历1-d高效液相色谱法(1-d hplc)以得到c肽富集的部分；(b)将c肽富集的部分在适合产生质谱法可检测的一种或多种c肽离子的条件下经历电离源；和(c)通过串联质谱法测定一种或多种c肽离子的量。在这些实施方式中，步骤(c)中所测定的离子的量与样品中c肽的量相关。在一些实施方式中，步骤(c)中所测定的一种或多种离子包括质荷比(m/z)为约1007.5
±
0.5的前体离子。在一些相关的实施方式中，步骤(c)中所测定的一种或多种离子进一步包括选自具有质荷比(m/z)为约927.6
±
0.5、785.4
±
0.5和646.1
±
0.5的离子组的一种或多种碎片离子。在一些相关的实施方式中，步骤(c)中所测定的一种或多种离子包括选自具有质荷比(m/z)为约927.6
±
0.5、785.4
±
0.5和646.1
±
0.5的离子组的两种或多种碎片离子。
15.在利用串联质谱法的实施方式中，串联质谱法可通过任何本领域已知的方法进行，包括例如多反应离子监测、前体离子扫描或产物离子扫描。
16.在一些实施方式中，串联质谱法包括将具有质荷比为1007.5
±
0.50的前体离子裂解成一种或多种碎片离子。在某些相关的实施方式中，一种或多种碎片离子包括选自具有质荷比为927.6
±
0.5、785.4
±
0.5、646.1
±
0.5、147.0
±
0.5和260.3
±
0.5的离子的一种或多种离子。在其它相关的实施方式中，一种或多种碎片离子包括选自具有质荷比为927.6
±
0.5、785.4
±
0.5、646.1
±
0.5的离子的一种或多种离子。在两种或多种碎片离子的量被测定的实施方式中，所述量可经历本领域已知的任何数学处理以便使所测量的离子量与样品中c肽的量相关。例如，两种或多种碎片离子的量可以作为测定样品中c肽量的部分而被求和。
17.本文呈现的一些实施方式利用高分辨率/高准确度质谱法。在这些实施方式中，方法包括：(a)将疑似含c肽的样品经历高效液相色谱法(hplc)以得到c肽富集的部分；(b)将c肽富集的部分在适合产生质谱法可检测的一种或多种c肽离子的条件下经历电离源；和(c)通过高分辨率/高准确度质谱法测定一种或多种c肽离子的量。在这些实施方式中，步骤(c)中所测定的离子的量与样品中c肽的量相关。
18.在一些实施方式中，高分辨率/高准确度质谱法是在分辨率或fwhm(极大值半处的全宽度)为10,000和质量准确度为50ppm下进行的。在一些实施方式中，高分辨率/高准确度质谱仪是高分辨率/高准确度飞行时间(tof)质谱仪。在一些实施方式中，hplc是1-d hplc。在一些实施方式中，步骤(c)中所测定的一种或多种离子包括具有电荷为2+或3+的离子。在一些实施方式中，步骤(c)中所测定的一种或多种离子包括选自具有质荷比(m/z)在约1007.5
±
1和1510.3
±
1范围内的离子组的离子。
19.在一些实施方式中，高分辨率/高准确度质谱法在大于或等于约10,000的分辨率(fwhm)进行，如大于或等于约15,000，如大于或等于约20,000，如大于或等于约25,000。在一些实施方式中，高分辨率/高准确度质谱法在小于或等于约50ppm的准确度下进行，如小于或等于约20ppm，如小于或等于约10ppm，如小于或等于约5ppm；如小于或等于约3ppm。在一些实施方式中，高分辨率/高准确度质谱法在大于或等于约10,000的分辨率(fwhm)和小
于或等于约50ppm的准确度下进行。在一些实施方式中，分辨率大于约15,000并且准确度小于或等于约20ppm。在一些实施方式中，分辨率大于或等于约20,000并且准确度小于或等于约10ppm；优选地分辨率大于或等于约20,000并且准确度小于或等于约5ppm，如小于或等于约3ppm。
20.在一些实施方式中，高分辨率/高准确度质谱法可以用轨道阱质谱仪、飞行时间(tof)质谱仪或傅里叶变换离子回旋共振质谱仪(有时称作傅里叶变换质谱仪)进行。
21.在本文所描述的任何方法中，样品可包括生物学样品。在一些实施方式中，生物学样品可包括体液，如尿液、血浆或血清。在一些实施方式中，生物学样品可包括来自人的样品；如来自成年男性或女性，或未成年男性或女性，其中未成年人是年龄在18岁以下、15岁以下、12岁以下或10岁以下。人样品可被分析以诊断或监测疾病状态或状况，或监测疾病状态或状况治疗的疗效。在一些相关的实施方式中，本文所描述的方法可用于测定当从人获取时的生物学样品中c肽的量。
22.在利用串联质谱法或高分辨率/高准确度质谱法的实施方式中，样品可在电离之前经历高效液相色谱法(hplc)。
23.在利用串联质谱法或高分辨率/高准确度质谱法的实施方式中，样品在经历分析柱如高效液相色谱(hplc)柱之前可经历萃取柱，如固相萃取(spe)柱。在一些相关的实施方式中，萃取柱不是免疫纯化柱(即，免疫亲和柱)。在一些实施方式中，在方法中的任何点都不使用免疫纯化。在可选实施方式中，用免疫纯化技术从样品中萃取c肽；如用免疫亲和萃取柱。
24.在利用萃取柱如固相萃取柱(spe)、分析柱如高效液相色谱(hplc)柱和电离源中的两种或多种的实施方式中，可以以线上方式连接这些组件中的两种或多种，以允许自动样品处理和分析。
25.本文呈现的任何方法中，样品可包括生物学样品；如体液样品，包括例如血浆或血清。
26.质谱法(串联质谱法或高分辨率/高精度质谱法)可以阳离子模式进行。可选地，质谱法可以阴离子模式进行。各种电离源，包括例如大气压化学电离(apci)或电喷雾电离(esi)可用于电离c肽。在一些实施方式中，c肽以阳离子模式通过esi电离。
27.在本文呈现的任何方法中，单独可检测的内部标准品可提供在样品中，其在样品中的量也被测定。在利用单独可检测的内部标准品的实施方式中，存在于样品中的感兴趣的分析物和内部标准品两者的全部或部分被电离以产生多个质谱仪可检测的离子，并通过质谱法检测从每个产生的一种或多种离子。在这些实施方式中，从感兴趣的分析物所产生的离子的存在或量通过与所检测的内部标准品离子的量比较可与样品中感兴趣的分析物的量相关。
28.可选地，样品中c肽的量可通过与一种或多种外部参考标准品进行比较而被测定。示例性外部参考标准品包括掺入有c肽或其同位素标记的变体的空白血浆或血清。
29.在一些实施方式中，所述方法证明对c肽水平测定的线性范围至少在约0.049ng/50μl至25ng/50μl的范围内。
30.如本文所使用的，除另外指出，单数形式“一个(a，an，或仅该冠词所修饰的名词)”和“所述(该，the)”包括复数指示物。因此，例如，提及“蛋白质(a protein)”包括多个蛋白
质分子。
31.术语“纯化”(“purification”或“purifying”)和“富集”并不是指从样品中除去感兴趣的分析物(一种或多种)以外的所有物质。相反，这些术语指的是相对于样品中可能干扰感兴趣的分析物测定的其它组分富集一种或多种感兴趣的分析物的量的程序。通过多种手段纯化样品可使一种或多种干扰物质，例如可能干扰或可能不干扰通过质谱法检测所选母离子或子离子的一种或多种物质，相对减少。当使用该术语时，相对减少并不要求在要被纯化的物质中与感兴趣分析物一起存在的任何物质都通过纯化被完全除去。
32.如本文所使用的，术语“免疫纯化”(“immunopurification”或“immunopurify”)指的是利用抗体，包括多克隆抗体或单克隆抗体，富集一种或多种感兴趣的分析物的纯化程序。免疫纯化可以使用本领域熟知的任何免疫纯化方法进行。通常，免疫纯化程序利用结合、偶联或以其它方式连接至固体载体，例如柱、孔、管、凝胶、囊、颗粒等的抗体。本文所使用的免疫纯化没有限制地包括通常在本领域中称为免疫沉淀的程序，以及通常在本领域中称为亲和色谱法或免疫亲和色谱法的程序。
33.如本文所使用的，术语“免疫颗粒”指的是具有结合、偶联或以其它方式连接至其表面(在颗粒上和/或中)的抗体的囊、珠、凝胶颗粒等。在某些优选的实施方式中，免疫颗粒是琼脂糖(sepharose or agarose)球。在替代的优选实施方式中，免疫颗粒包括玻璃、塑料或二氧化硅珠，或硅胶。
34.如本文所使用的，术语“抗c肽抗体”指的是对c肽具有亲和力的任何多克隆抗体或单克隆抗体。在各种实施方式中，c肽抗体对除c肽以外的化学物质的特异性可以变化；例如，在某些优选的实施方式中，抗c肽抗体对c肽有特异性，并因此对除c肽以外的化学物质有很少或没有亲和力，而在其它优选实施方式中，抗c肽抗体是非特异性的，并因此结合除c肽以外的某些化学物质。
35.如本文所使用的，术语“样品”指的是可能包含感兴趣的分析物的任何样品。如本文所使用的，术语“体液”意思是能从个体的身体中分离的任何流体。例如，“体液”可包括血液、血浆、血清、胆汁、唾液、尿液、眼泪、汗液等。在某些实施方式中，样品包括来自人的体液样品；如血浆或血清。
36.如本文所使用的，术语“固相萃取”或“spe”指的是这样的工艺：其中化学混合物由于溶解或悬浮在溶液(即，流动相)中的组分对该溶液所经过或围绕的固体(即，固相)的亲和力而被分离成多个组分。在一些情况下，随着流动相经过或围绕固相，不需要的流动相组分可被固相保留，导致流动相中分析物的纯化。在其它情况下，分析物可被固相保留，允许不需要的流动相组分经过或围绕固相。在这些情况下，第二流动相随后用于洗脱所保留的分析物离开固相用于进一步处理或分析。spe，包括tflc可经单一或混合模式机制操作。混合模式机制使用同一柱中的离子交换和疏水保留；例如，混合模式spe柱的固相可显示出强的阴离子交换和疏水保留；或可显示出强的阳离子交换和疏水保留。
37.通常，spe柱填充物质对分析物的亲和力可能是由于多种机制，如一种或多种化学作用或免疫亲和作用。在一些实施方式中，在不使用免疫亲和柱填充物质的情况下进行c肽的spe。即，在一些实施方式中，胰岛素通过不是免疫亲和柱的spe柱从样品中纯化。
38.如本文所使用的，术语“色谱法”指的是这样的工艺：其中当由液体或气体携带的化学混合物环流或流过固定的液体或固体相时，由于化学物体的差别分布，它们被分离成
多个组分。
39.如本文所使用的，术语“液相色谱法”或“lc”意思是当流体均匀地渗滤通过细分物质的柱或通过毛细管路径时，流体溶液的一种或多种组分选择性延迟的工艺。延迟是当该流体相对于固定相(一种或多种)移动时，由在一种或多种固定相和主体流体(即，流动相)之间的混合物组分的分布导致。“液相色谱法”的例子包括反向液相色谱(rplc)、高效液相色谱法(hplc)和湍流液相色谱(tflc)(有时称作高湍流液相色谱(htlc)或高通量液相色谱)。
40.如本文所使用的，术语“高效液相色谱法”或“hplc”(有时称作“高压液相色谱法”)指的是通过在压力下迫使流动相通过固定相——通常为致密填充柱——增加分离程度的液相色谱法。术语“1-d高效液相色谱法”或“1-dhplc”指的是传统的单柱hplc。术语“2-d高效液相色谱法”指的是高效液相色谱技术，其中以在将分析物从第一hplc柱引导至具有不同固定相的第二hplc柱的同时共洗脱分析物和任何附加物质的方式，使用两种hplc柱。选择第二个hplc柱的固定相，以便在将分析物引入质谱仪之前将分析物和共洗脱物质分离。通常，2-d hplc在运行时间方面更昂贵，并且相对于1-d hplc需要附加的复杂性设置；然而，特别是复杂的样品，相比于1-d hplc可使用2-d hplc达到更高的分析物纯度。
41.如本文所使用的，术语“湍流液相色谱法”或“tflc”(有时称作高湍流液相色谱法或高通量液相色谱法)指的是这样的色谱法形式：其利用通过柱填充正被分析的物质的湍流作为进行分离的基础。在通过质谱法分析之前，tflc已应用于含有两种不知名药物的样品的制备。参见，例如zimmer等人，j chromatogr a 854:23-35(1999)；也参见美国专利号5,968,367、5,919,368、5,795,469和5,772,874，其进一步解释了tflc。本领域普通技术人员理解“湍流”。当流体缓慢且平稳地流动时，流体被称为“层流”。例如，以低流速移动通过hplc柱的流体是层式的。在层流中，流体的颗粒运动是有序的，其中颗粒大体上以基本上直线移动。在较快的速度下，水的惯性克服了流体摩擦力，并且湍流产生。不与不规则边界接触的流体比被摩擦减慢或被不均匀表面偏转的流体“移动更快(outruns)”。当流体湍流地流动时，其以旋涡和回旋(或涡流)流动，比流动为层式时具有更大的“阻力(drag)”。许多参考文献可用于帮助确定何时流体流动为层式或湍流(例如，turbulent flow analysis:measurement and prediction,p.s.bernard&j.m.wallace,john wiley&sons,inc.,(2000)；an introduction to turbulent flow,jean mathieu&julian scott,cambridge university press(2001))。
42.如本文所使用的，术语“气体色谱”或“gc”指的是这样的色谱法：其中样品混合物被汽化并注入移动通过含有由液体或颗粒固体组成的固定相的柱的载气流(如氮或氦气)中，并且根据化合物对固定相的亲和力被分离成其组分化合物。
43.如本文所使用的，术语“大颗粒柱”或“萃取柱”指的是含大于约50μm的平均粒径的色谱柱。如上下文所使用的，术语“约”意思是
±
10％。
44.如本文所使用的，术语“分析柱”指的是具有足够的色谱板来实施样品中物质的分离，所述物质从足够允许测定分析物的存在或量的该柱中洗脱。这种柱通常区别于“萃取柱”，其具有从非保留物质中分离或萃取保留物质的总体目的，以便得到纯化样品用于进一步分析。如上下文所使用的，术语“约”意思是
±
10％。在优选的实施方式中，分析柱包含直径约5μm的颗粒。
45.如本文所使用的，术语“线上(on-line)”和“在线(inline)”，例如在“线上自动方式”或“线上萃取”中所使用的，指的是不需要操作员介入而进行的程序。相反地，如本文使用的术语“脱线(off-line)”指的是要求操作员手动介入的程序。因此，如果样品经历沉淀并且随后将上清液手动加载到自动采样器中，那么沉淀和加载步骤与随后的步骤是脱线的。在该方法的不同实施方式中，一个或多个步骤可以以线上自动方式进行。
46.如本文所使用的，术语“质谱法”或“ms”指的是通过化合物的质量鉴定化合物的分析技术。ms指的是基于离子质荷比或“m/z”过滤、检测和测定离子的方法。ms技术通常包括(1)电离化合物以形成带电化合物；和(2)检测带电化合物的分子量并计算质荷比。化合物可通过任何合适的手段电离并检测。“质谱仪”通常包括电离器、质量分析器和离子检测器。一般而言，一种或多种感兴趣的分子被电离，并且随后将离子引入质谱仪，其中由于磁场和电场的组合，离子遵从空间中依赖于质量(“m”)和电荷(“z”)的路径。参见例如美国专利号6,204,500，其名称为“mass spectrometry from surfaces”；6,107,623，其名称为“mass spectrometry from surfaces”；6,107,623，其名称为“methods and apparatus for tandem mass spectrometry”；6,268,144，其名称为“dna diagnostics based on mass spectrometry”；6,124,137，其名称为“surface-enhanced photolabile attachment and release for desorption and detection of analytes”；wright等人，prostate cancer and prostatic diseases 1999,2:264-76；和merchant和weinberger,electrophoresis 2000,21:1164-67。
47.如本文所使用的，“高分辨率/高准确度质谱法”指的是用能够以足够的精确度和准确度测定带电种质质荷比以确认独特化学离子的质量分析仪进行的质谱法。当来自离子的各个同位素峰容易分辨时，对于该离子可能确认独特化学离子。确认独特化学离子所需要的具体分辨率和质量准确度随着离子的质量和电荷状态而变化。
48.如本文所使用的，术语“分辨率”或“分辨率(fwhm)”(本领域也称为“m/δm
50％”)指的是观察到的质荷比除以在50％最大高度时质量峰的宽度(极大值半处的全宽度，“fwhm”)。例如，分辨率的差异效果被图解在共同未决的美国专利公开号2011/0111512的图1a-c中，其通过参考并入本文。
49.如本文所使用，就质谱法而言，“独特化学离子”指的是具有单个原子组成的单个离子。该单个离子可以是单电荷的或多电荷的。
50.如本文所使用，就质谱法而言，术语“准确度”(或“质量准确度”)指的是仪器响应与所研究离子的真实m/z的可能偏差。准确度通常表示为百万分之一(ppm)。例如，质量准确度的差异效果被图解在共同未决的美国专利公开号2011/0111512的图2a-d中，其通过引用并入到本文中。
51.本发明的高分辨率/高准确度质谱法方法可以在能够以大于10,000、15,000、20,000、25,000、50,000、100,000或甚至更大的fwhm进行质量分析的仪器上进行。同样，本发明的方法可以在能够以小于50ppm、20ppm、15ppm、10ppm、5ppm、3ppm或甚至更小的准确度进行质量分析的仪器上进行。能够实现这些性能特征的仪器可结合某些轨道阱质量分析仪、飞行时间(“tof”)质量分析仪或傅里叶变换离子回旋共振质量分析仪。在优选的实施方式中，用包括轨道阱质量分析仪或tof质量分析仪的仪器实施该方法。
52.术语“轨道阱”描述由外部桶样电极和同轴内部电极组成的离子阱。离子切线地注
入电极之间的电场，并且当离子围绕同轴内部电极运行时，因为离子和电极之间的静电作用被离心力平衡而使离子被捕获。当离子围绕同轴内部电极运行时，捕获的离子的轨道路径沿着中心电极的轴线以相对于离子质荷比的谐振频率震动。测定轨道震动频率允许轨道阱被用作高准确度(低至1
–
2ppm)和高分辨率(fwhm)(高至约200,000)的质量分析仪。基于轨道阱的质量分析仪详细描述在美国专利号6,995,364中，其通过引用整体并入本文。已经报道使用轨道阱分析仪用于定性和定量分析各种分析物。参见，例如美国专利申请公开号2008/0118932(2007年11月9日提交)；等rapid commun.mass spectrom.,2008,22:477-485；le breton等,rapid commun.mass spectrom.,2008,22:3130-36；thevis等,mass spectrom.reviews,2008,27:35-50；thomas等,j.mass spectrom.,2008,43:908-15；schenk等,bmc medical genomics,2008,1；41；和olsen等,nature methods,2007,4:709-12。
53.如本文所使用的，术语“以阴离子模式运行”指的是生成并检测阴离子的那些质谱法。如本文所使用的，术语“以阳离子模式运行”指的是生成并检测阳离子的那些质谱法。在优选的实施方式中，质谱法是以阳离子模式进行的。
54.如本文所使用的，术语“电离”(“ionization”或“ionizing”)指的是生成具有等于一个或多个电子单位的净电荷的分析物离子的过程。阴离子是具有一个或多个电子单位的净负电荷的那些，而阳离子是具有一个或多个电子单位的静正电荷的那些。
55.如本文所使用的，术语“电子电离”或“ei”指的是这样的方法：其中气相或蒸汽相的感兴趣分析物与电子流相互作用。电子与分析物的撞击产生分析物离子，其可随后经历质谱技术。
56.如本文所使用的，术语“化学电离”或“ci”指的是这样的方法：其中试剂气体(即，氨气)经历电子撞击，并且分析物离子由试剂气体离子和分析物分子的相互作用而形成。
57.如本文所使用的，术语“快原子轰击”或“fab”指的是这样的方法：其中一束高能原子(通常是xe或ar)撞击非挥发性样品，解吸和电离包含在该样品中的分子。将测试样品溶于粘性液体基质如甘油、巯基甘油、间硝基苄醇、18-冠-6冠醚、2-硝基苯辛醚、四氢噻酚砜、二乙醇胺和三乙醇胺中。用于化合物或样品的适合基质的选择是经验过程。
58.如本文所使用的，术语“基质辅助激光解吸电离”或“maldi”指的是这样的方法：其中将非挥发性样品暴露于激光辐射，其通过不同的电离途径解吸和电离样品中的分析物，所述电离途径包括光致电离、质子化、去质子化和群集衰变。对于maldi，将样品与能量吸收基质进行混合，这促进分析物分子的解吸。
59.如本文所使用的，术语“表面增强激光解吸电离”或“seldi”指的是另一种方法：其中将非挥发性样品暴露于激光辐射，其通过不同的电离途径解吸和电离样品中的分析物，所述电离途径包括光致电离、质子化、去质子化和群集衰变。对于seldi，样品通常结合至优先保留一种或多种感兴趣分析物的表面。如在maldi中那样，该过程还可使用能量吸收物质来促进电离。
60.如本文所使用的，术语“电喷雾电离”或“esi”指的是这样的方法：其中溶液沿短长度的末端被施加高正或负电位的毛细管经过。到达管末端的溶液被汽化(雾化)成溶剂蒸气中溶液的很小液滴的喷射或喷雾。该雾滴流经蒸发室。随着液滴变得越来越小，电表面电荷密度增加，直到同样电荷之间的自然排斥力使离子以及中性分子释放时。
61.如本文所使用的，术语“大气压化学电离”或“apci”指的是与esi相似的质谱法；然而，apci通过在大气压下在等离子体内发生的离子-分子反应产生离子。等离子体由喷雾毛细管和对电极之间的放电所维持。然后，通常通过使用一组压差泵送分离器阶段(differentially pumped skimmer stages)将离子提取到质量分析仪中。干燥且预热的n2气体的逆流可用于提高溶剂的去除。apci中的气相电离可以比esi更有效分析低极性物质。
62.如本文所使用的，术语“大气压光致电离”或“appi”指的是质谱的形成，其中分子m电离的机制是光子吸收和电子发射以形成分子离子m+。由于光子能量通常恰好高于电离势，所以分子离子更不易受解离影响。在许多情况下，这可能分析样品而不需要色谱法，从而节省了大量时间和费用。在水蒸气或质子溶剂存在的情况下，分子离子可以提取h以形成mh+。如果m具有高质子亲和力，则这种情况易出现。这并不影响定量准确度，因为m+和mh+的和是不变的。质子溶剂中的药物成分通常被观察为mh+，而非极性化合物如萘或睾酮通常形成m+。参见，例如，robb等,anal.chem.2000,72(15):3653-3659。
63.如本文所使用的，术语“电感耦合等离子体”或“icp”指的是这样的方法：其中样品在足够高的温度下与部分电离的气体相互作用，以使大部分元素被原子化和电离。
64.如本文所使用的，术语“场解吸”指的是这样的方法：其中非挥发性测试样品被置于电离表面上，并且强电场用于产生分析物离子。
65.如本文所使用的，术语“解吸”指的是从表面移除分析物和/或分析物进入气相中。激光解吸型热解吸(laser desorption thermal desorption)是一种含分析物的样品通过激光脉冲被热吸附到气相中技术。激光击打用金属基底特制的96-孔板的背面。激光脉冲将基底加热，并且热使样品转移到气相中。气相样品随后被吸入质谱仪。
66.如本文所使用的，术语“选择性离子监测”是其中只有在相对窄的、通常约一个质量单位的质量范围内的离子被检测的质谱仪检测模式。
67.如本文所使用的，“多反应模式”，有时称作“选择反应监测”是其中前体离子和一种或多种碎片离子被选择性检测的质谱仪检测模式。
68.如本文所使用的，术语“定量低限(lower limit of quantification或lower limit of quantitation)”或“lloq”指的是测量变得定量上有意义的点。在该lloq的分析物响应是可鉴定的、离散的和可重现的，相对标准偏差(rsd％)小于20％和准确度为85％至115％。
69.如本文所使用的，“检测限”或“lod”是这样的点，在该点的测量值大于与其相关的不确定性。lod是这样的点，在该点的值超过与其测量相关的不确定性，并且被定义为在0浓度下平均值的rsd的三倍。
70.如本文所使用的，体液样品中分析物的“量”通常指的是反映样品体积中可检测分析物的质量的绝对值。然而，量也考虑与其它分析物的量相比的相对量。例如，样品中分析物的量可以是大于对照或正常存在于样品中的分析物的正常水平的量。
71.如本文所使用的，涉及定量测定——不包括离子质量测量——的术语“约”指的是所指出的值加或减10％。质谱仪可以在测定给定分析物的质量时稍微变化。在离子质量或离子质/荷比的情况中，术语“约”指的是+/-0.50原子质量单位。
72.上述发明概述是非限制性的，并且从本发明的以下详细描述和权利要求书看，本发明的其它特征和优点将是明显的。
73.附图简述
74.图1显示全扫描质谱，其显示可能的c肽前体离子。细节在实施例3中讨论。
75.图2显示横跨约50至1200m/z范围的具有约1007.5
±
0.50m/z的c肽前体离子裂解的示例性裂解谱图(产物离子扫描)。细节在实施例3中讨论。
76.图3显示用ms/ms测量的在掺料模拟血清(spiked mock serum)标准品中的c肽定量的线性度图。细节在实施例4中讨论。
77.图4显示用ms/ms测量的在掺料处理血清(spiked stripped serum)样品中的c肽定量的线性度图。细节在实施例4中讨论。
78.图5a-c显示通过分别横跨约500至2000、1005-1040和1519-1526的m/z范围扫描高分辨率/高准确度质谱仪所收集的c肽和其钠加合物电离的质谱。细节在实施例5中讨论。
79.图6显示通过横跨约1005至1012的m/z范围扫描高分辨率/高准确度质谱仪所收集的m/z为约1007.5
±
0.50的c肽离子的质谱。细节在实施例5中讨论。
80.图7显示用高分辨率/高准确度ms测量的在掺料模拟血清标准品中的c肽定量的线性度图。细节在实施例6中讨论。
81.图8显示用高分辨率/高准确度ms测量的在掺料处理血清样品中的c肽定量的线性度图。细节在实施例6中讨论。
82.发明详述
83.描述了用于测量样品中c肽的量的方法。更具体地，描述了用于检测和定量样品中c肽的质谱方法。与质谱(ms)方法相结合，该方法可利用固相萃取(spe)和/或液相色谱(lc)，以进行所选分析物的纯化，从而提供用于检测和定量样品中c肽的分析系统。优选的实施方式尤其非常适合应用于大的临床实验室，以进行自动c肽定量分析。
84.用于本发明方法的合适的测试样品包括可包含感兴趣分析物的任何测试样品。在一些优选的实施方式中，样品是生物学样品；即，从任何生物学来源，如动物、细胞培养物、器官培养物等获得的样品。在某些优选的实施方式中，样品从哺乳动物，如狗、猫、马等中获得。尤其优选的哺乳动物为灵长类，最优选男性人或女性人。优选的样品包括体液如血液、血浆、血清、唾液、脑脊液或组织样品；优选血浆和血清。这种样品可从如患者中获得；即，在诊断的临床环境、预后、或疾病或病症的治疗中存在的活体本身，男性或女性。在样品包括生物学样品的实施方式中，当从生物学来源获得样品时，该方法可用于测定样品中c肽的量(即，样品中内源性c肽的量)。
85.本发明也考虑用于c肽定量分析的试剂盒。用于c肽定量分析的试剂盒可包括含有本文提供的组合物如外部参考标准品的试剂盒。在某些方面，外部参考标准品包括掺有c肽或其同位素标记的变体的空白血浆或血清。例如，试剂盒可包括包装材料和测量量的同位素标记的内部标准品，其量足够进行至少一次分析。通常，试剂盒还包括以有形形式记录(例如，包含在纸上或电子介质上)的使用包装的试剂的说明，用于c肽定量分析。
86.用于本发明实施方式中的校准和qc库(pools)优选地使用与期望的样品矩阵类似的矩阵制备，条件是c肽实际上并不存在。
87.用于质谱分析的样品制备
88.在准备质谱分析时，可通过本领域已知的各种方法相对于样品中的一种或多种其它组分富集c肽，所述方法包括例如，液相色谱法、过滤、离心、薄层色谱法(tlc)、电泳——
包括毛细管电泳、亲和分离——包括免疫亲和分离、萃取方法——包括乙酸乙酯或甲醇萃取，以及使用离液剂或任何上述组合等。
89.可在质谱法之前使用的样品纯化的一种方法是在感兴趣分析物通过柱填充物质可逆地保留而一种或多种其它物质不保留的条件下将样品施加到固相萃取(spe)柱。在此技术中，可以使用第一流动相条件，其中感兴趣分析物被柱保留，并且在未保留物质被冲洗过后，可随后使用第二流动相条件以从柱移出保留的物质。
90.在一些实施方式中，样品中c肽可用含烷基结合表面的填充物质被可逆地保留在spe柱上。例如，在一些实施方式中，c-8线上spe柱(如来自phenomenex公司的strata c-8线上spe柱(20mm
×
2.0mm)或等同物)可在质谱分析之前用于富集c肽。在一些实施方式中，用hplc级0.1％甲酸水溶液作为冲洗溶液和使用乙腈中0.1％的甲酸作为洗脱溶液进行spe柱的使用。
91.在一些实施方式中，c肽不是通过任何免疫亲和技术纯化。这些实施方式中的一些是使用spe柱。在这些实施方式中，spe柱不是免疫亲和柱。
92.在其它实施方式中，该方法在质谱分析之前包括免疫纯化c肽。该免疫纯化步骤可使用本领域熟知的任何免疫纯化方法进行。通常，免疫纯化过程利用结合、偶联或其它方式连接至固体载体例如柱、孔、管、囊、颗粒等的抗体。通常，免疫纯化方法涉及(1)温育包含感兴趣分析物的样品与抗体，使得分析物结合至抗体，(2)进行一次或更多冲洗步骤，和(3)将分析物从抗体中洗脱。
93.在某些实施方式中，免疫纯化的温育步骤是与溶液中游离的抗体进行免疫纯化的温育步骤，并且随后将抗体在冲洗步骤之前结合或连接至固体表面。在某些实施方式中，这可以使用为抗c肽抗体的第一抗体和连接至对第一抗c肽抗体有亲和力的固体表面的第二抗体来实现。在可选实施方式中，在温育步骤之前将第一抗体结合至固体表面。
94.合适的固体载体没有限制地包括管、载玻片、柱、珠、囊、颗粒、凝胶等。在一些优选的实施方式中，固体载体为多孔板，例如，96孔板、384-孔板等。在一些实施方式中，固体载体为琼脂糖珠或凝胶。可以通过多种本领域熟知的方法将抗体(例如，抗c肽抗体或第二抗体)结合、连接、固定或偶联至固体载体，例如，共价或非共价键合吸附、亲和结合、离子键合等。在一些实施方式中，使用cnbr偶联抗体，例如，抗体可偶联至cnbr活化的琼脂糖。在其它实施方式中，通过抗体结合蛋白质如蛋白质a、蛋白质g、蛋白质a/g或蛋白质l，将抗体连接至固体载体。
95.免疫纯化法的冲洗步骤通常涉及冲洗固体载体，使得c肽保持结合至固体载体上的抗c肽抗体。免疫纯化的洗脱步骤通常涉及添加破坏c肽与抗c肽抗体结合的溶液。示例性洗脱液包括有机溶液、盐溶液和高或低ph溶液。
96.可在质谱法之前使用的样品纯化的另一种方法是液相色谱法(lc)。在液相色谱技术中，可以在感兴趣分析物以与一种或多种其它物质相比的差异速度下洗脱的流动相条件下，通过将样品施加至色谱分析柱而纯化分析物。这种程序可相对于样品的一种或多种其它组分富集一种或多种感兴趣分析物的量。
97.液相色谱的某些方法，包括hplc，依赖于相对慢的层流技术。传统的hplc分析依赖于柱填料，其中通过该柱的样品的层流是将感兴趣分析物从样品分离的基础。本领域技术人员将理解在这种柱中的分离是分配过程，并且可选择适于与c肽使用的lc包括hplc仪器
和柱。通常，色谱分析柱包括介质(即，填充物质)以促进化学部分的分离(即，分馏)。介质可包括微小的颗粒。颗粒通常包括与各种化学部分相互作用促进化学部分分离的结合表面。一个合适的结合表面是疏水结合表面，如烷基结合表面或氰基结合表面。烷基结合表面可包括c-4、c-8、c-12或c-18结合的烷基。在一些实施方式中，色谱分析柱是整体(monolithic)c-18柱。色谱分析柱包括用于接收样品的入口和用于排放包括分馏样品的流出液的出口。样品可直接，或从spe柱，如线上spe柱或tflc柱供应至入口。在一些实施方式中，可在spe柱和或hplc柱前使用线上过滤器，以在样品到达spe和/或tflc和/或hplc柱之前除去样品中的微粒和磷脂。
98.在一个实施方式中，样品可在入口处被施加到lc柱，用溶剂或溶剂混合物洗脱，并在出口处排放。可选择不同的溶剂模式来洗脱感兴趣分析物(一种或多种)。例如，可使用梯度模式、等度模式或多型(polytypic)(即混合)模式进行液相色谱。在色谱法期间，物质的分离通过变量如洗脱液(也称作“流动相”)、洗脱模式、梯度条件、温度等的选择而实施。
99.在一些实施方式中，用hplc对样品中的c肽进行富集。该hplc可以是用整体c-18柱色谱系统进行的1-d hplc，例如，来自phenomenex公司的onyx整体c-18柱(50
×
2.0mm)或等同物。在某些实施方式中，使用hplc级0.1％甲酸水溶液作为冲洗液和乙腈中0.1％甲酸作为洗脱液进行hplc。
100.通过仔细选择阀和连接器管件，两种或多种色谱柱可根据需要连接，使得物质从一个经过至下一个，而无需任何手动步骤。在优选的实施方式中，阀和管件的选择通过预编程以进行必要的步骤的计算机控制。最优选地，以这种线上方式也将色谱法系统连接至检测器系统，例如ms系统。因此，操作员可将样品托盘置于自动采样器中，并且在计算机控制下进行其余操作，这导致所有选择的样品的纯化和分析。
101.在一些实施方式中，上述纯化技术中的一种或多种可同时用于纯化c肽，以允许多个样品的同时处理。在一些实施方式中，所使用的纯化技术不包括免疫纯化技术，如免疫亲和色谱。
102.在一些实施方式中，tflc可用于在质谱法之前纯化c肽。在这种实施方式中，可使用捕获分析物的tflc柱萃取样品。然后分析物被洗脱并线上转移至分析hplc柱。例如，可用具有大粒径(50μm)填料的tflc萃取柱完成样品萃取。然后，该柱洗脱出的样品可被线上转移至hplc分析柱，以在质谱法之前进一步纯化。因为涉及这些色谱程序的步骤可以以自动方式连接，所以在分析物纯化期间操作员介入的需要能被最小化。该特征可导致节约时间和成本，并且消除操作员出误的机会。
103.通过质谱法检测和定量c肽
104.使用质谱仪进行质谱法，所述质谱仪包括用于电离分馏样品和产生带电分子以进行进一步分析的离子源。在各种实施方式中，c肽可通过技术人员已知的任何方法电离。例如，c肽的电离可通过如下进行：电子电离、化学电离、电喷雾电离(esi)、光子电离、大气压化学电离(apci)、光致电离、大气压光致电离(appi)、激光二极管热解吸(ldtd)、快原子轰击(fab)、液体次级电离(lsi)、基质辅助激光解吸电离(maldi)、场致电离、场解吸、热喷雾/等离子体喷雾电离、表面增强激光解吸电离(seldi)、电感耦合等离子体(icp)和粒子束电离。本领域技术人员将理解选择电离的方法可基于待测量的分析物、样品类型、检测器类型、正模式与负模式的选择等确定。可以以正模式或负模式电离c肽。在优选的实施方式中，
通过esi以正离子模式电离c肽。
105.在质谱法技术中，一般而言，在样品已经被电离之后，由此产生的带正电离子或带负电离子可被分析以测定质荷比(m/z)。用于测定m/z的各种分析仪包括四级杆分析仪、离子阱分析仪、飞行时间分析仪、傅立叶变换离子回旋共振质量分析仪和轨道阱分析仪。在bartolucci,等,rapid commun.mass spectrom.2000,14:967-73中描述了一些示例性离子阱方法。
106.可使用若干检测模式检测离子。例如，所选择的离子的检测即可使用选择性离子监测模式(sim)，或可选地，源自碰撞诱导的解离或中性损失的质量转移可被监测，例如，多反应监测(mrm)或选择反应监测(srm)。在一些实施方式中，使用四级杆分析仪测定质荷比。在“四级杆”或“四级杆离子阱”仪器中，振荡射频场中的离子承受与施加在电极之间的dc电位、rf信号的振幅和质/荷比成正比的力。可选择电压和振幅使得仅具有具体质/荷比的离子行经四级杆的长度，而所有其它的离子被偏离。因此，四级杆仪器可用作注入仪器中的离子的“质量过滤器”和“质量检测器”。
107.当离子碰撞检测器时，它们产生电子脉冲，其被转变成数字信号。所获得的数据中转至计算机，计算机绘制所收集离子的计数对时间的图。所得质量色谱图与传统hplc-ms方法产生的色谱图类似。可测量对应于具体离子的峰下面积，或这些峰的振幅，并使之与感兴趣分析物的量相关联。在某些实施方式中，测量碎片离子(一种或多种)和/或前体离子的曲线下面积，或峰的振幅以测定c肽的量。可基于内部或外部分子标准品的一种或多种离子的峰，使用校准标准曲线将给定离子的相对丰度转换为初始分析物的绝对量。
108.通过“串联质谱法”或“ms/ms”使用某些质谱分析仪可提高ms技术的分辨率。在该技术中，从感兴趣的分子中产生的前体离子(也称为母离子)可以在ms仪器中过滤，并且随后前体离子被裂解以产生随后在第二ms过程中分析的一种或多种碎片离子(也称为子离子或产物离子)。通过仔细选择前体离子，只有由某些分析物产生的离子被传送到裂解室，其中与惰性气体原子的碰撞产生碎片离子。因为在给定组的电离/裂解条件下以可重现方式产生前体离子和碎片离子，ms/ms技术可提供极其有力的分析工具。例如，过滤/裂解的组合可用于消除干扰物质，并且具体可用于复杂样品，如生物学样品。在某些实施方式中，使用具有多重四级杆分析仪(如，三重四级杆仪器)的质谱仪进行串联质谱分析。
109.在使用ms/ms技术的某些实施方式中，前体离子被分离用于进一步裂解，并且碰撞活化解离(cad)被用于从前体离子产生碎片离子用于进一步检测。在cad中，前体离子通过与惰性气体碰撞获得能量，随后通过称为“单分子分解”的方法裂解。必须将足够的能量沉积在前体离子中，使得由于增加的振动能而可以破坏离子中的某些键。
110.在一些实施方式中，如下使用ms/ms检测和/或定量样品中的c肽。首先通过使样品经历spe，然后进经历液相色谱法——优选地hplc，如1-d hplc——将c肽富集在样品中；来自色谱分析柱的液体溶剂流进入ms/ms分析仪的加热的喷雾器界面；和在界面的加热的带电管中，将溶剂/分析物混合物转变成蒸汽。在这些过程中，分析物(即，c肽)被电离。离子，即前体离子，经过仪器孔并进入第一个四极杆。四级杆1和3(q1和q3)为质量过滤器，其允许基于其质荷比(m/z)选择离子(即，分别在q1和q3中选择“前体”离子和“碎片”离子)。四级杆2(q2)是碰撞池，在那里离子被裂解。质谱仪的第一个四级杆(q1)选择具有c肽前体离子m/z的分子。具有正确m/z的前体离子被允许进入到碰撞室(q2)中，而具有任何其它m/z的不需
要的离子与四级杆的侧面碰撞并被消除。进入q2的前体离子与中性气体分子(如氩分子)碰撞和裂解。所产生的碎片离子被传送到四级杆3(q3)内，在那里c肽碎片离子被选择，而其它离子被消除。
111.该方法可涉及以阳离子模式或阴离子模式进行的ms/ms；在某些实施方式中，ms/ms以阳离子模式进行。在某些实施方式中，q1选择m/z为约1007.5
±
0.5的前体离子。在相关的实施方式中，q3可选择m/z为约927.6
±
0.5、和/或785.4
±
0.5、和/或646.1
±
0.5的碎片离子。在某些实施方式中，可测量单个碎片离子的相对丰度。可选地，可测量两种或多种碎片离子的相对丰度。在这些实施方式中，可对每个碎片离子的相对丰度求和以定量评估最初在样品中的c肽。
112.操作可在某些实施方式中使用的串联质谱仪的替换模式包括产物离子扫描和前体离子扫描。对于这些操作模式的描述，参见，例如michael thurman，等，chromatographic-mass spectrometric food analysis for trace determination of pesticide residues,chapter 8(amadeo r.fernandez-alba,ed.,elsevier 2005)(387)。
113.在其它实施方式中，根据本发明的方法，高分辨率/高准确度质量分析仪可用于定量分析c肽。为了得到可接受水平的定量结果，质谱仪必须对于感兴趣的离子能够展示10,000或更高的分辨率(fwhm)以及约50ppm或更小的准确度；优选地，质谱仪展示18,000或更高的分辨率(fwhm)和约5ppm或更小的准确度；如20,000或更高的分辨率(fwhm)和约3ppm或更小的准确度；如25,000或更高的分辨率(fwhm)和约3ppm或更小的准确度。对于c肽离子能够展示性能必要水平的三种示例性分析仪是轨道阱质量分析仪、某些tof质量分析仪和傅立叶变换离子回旋共振质量分析仪。
114.在生物学活性分子中发现的元素如碳、氧和氮以许多不同的同位素形式自然存在。例如，大部分碳以
12
c存在，但所有天然存在的碳的约1％以
13
c存在。因此，一些部分的天然存在的含至少一个碳原子的分子将包含至少一个
13
c原子。分子中包含天然存在的元素同位素产生多个分子同位素形式。分子同位素形式的质量差是至少1个原子质量单位(amu)。这是因为元素同位素相差至少有一个中子(一个中子的质量≈1amu)。当分子同位素形式被电离为多电荷状态，同位素形式之间的质量差别可以变得难以区分，因为质谱检测是基于质荷比(m/z)。例如，都被电离为5+状态的质量相差1amu的两种同位素形式将展示它们的m/z差仅为0.2。高分辨率/高准确度质谱仪能够区分高度多电荷离子的同位素形式(如带电荷
±
2、
±
3、
±
4、
±
5或更高的离子)。
115.由于天然存在的元素同位素，对于每种分子离子通常存在多个同位素形式(如果用足够灵敏的质谱仪分析，其中的每个可以产生可单独检测的光谱峰)。多个同位素形式的m/z比和相对丰度共同包括分子离子的同位素信号(signature)。在一些实施方式中，两个或多个分子同位素形式的m/z比和相对丰度可用于确认所研究的分子离子的同一性(identity)。在一些实施方式中，来自一个或多个同位素形式的质谱峰用于定量分子离子。在一些相关的实施方式中，来自一个同位素形式的单个质谱峰用于定量分子离子。在其它相关的实施方式中，多个同位素峰用于定量分子离子。在这些后者的实施方式中，多个同位素峰可经历任何合适的数学处理。若干数学处理是本领域已知的，并且包括但不限于多个峰下面积的求和，或对来自多个峰的响应求平均值。表明在m/z范围为约1007.5内的这种多个同位素形式的c肽离子的示例性光谱见图6。如在示例性光谱中所见，来自各种同位素形
式的峰在1007.1750、1007.5092、1007.8362、1008.1745、1008.5081、1008.8355处看到。但是，注意因为仪器的差异，观察到的任何离子的同位素变体的精确质量可能稍微变化。
116.在一些实施方式中，为了定量评估样品中c-肽的量，用高分辨率/高准确度质谱仪来测量一种或多种离子的相对丰度。在一些实施方式中，通过高分辨率/高准确度质谱法测量的一种或多种离子是多电荷c肽离子。这些多电荷离子可包括m/z为约1510.3(2+离子)和约1007.3(3+离子)的一种或多种离子。
117.已经报道使用高分辨率轨道阱分析仪定性和定量分析各种分析物。见，例如美国专利申请公开号2008/0118932(2007年11月9日提交)；等rapid commun.mass spectrom.,2008,22:477-485；le breton等,rapid commun.mass spectrom.,2008,22：3130-36；thevis等,mass spectrom。reviews,2008,27:35-50；thomas等,j.mass spectrom.,2008,43：908-15；schenk等,bmc medical genomics,2008,1：41；和olsen等,nature methods,2007,4:709-12。
118.通过本领域已知的许多方法可将分析物分析的结果与初始样品中的分析物量的相关联。例如，在取样和分析参数被仔细控制的情况下，给定离子的相对丰度可与将该相对丰度转换为初始分子的绝对量的表相比较。可选地，外部标准品可与样品一起运行，并且基于从这些标准品所产生的离子构建标准曲线。使用这种标准曲线，可将给定离子的相对丰度转换成初始分子的绝对量。在某些优选的实施方式中，内部标准品用于产生计算c肽量的标准曲线。产生和使用这种标准曲线的方法是本领域熟知的并且普通技术人员能够选择合适的内部标准品。例如，在优选的实施方式中，同位素标记的c肽的一种或多种形式可用作内部标准品。将离子的量与初始分子的量关联的许多其它方法是本领域普通技术人员熟知的。
119.如本文所使用的，当通过质谱技术分析时，“同位素标记”在标记的分子中相对于未标记的分子产生质量位移。合适的标记的例子包括氘(2h)、
13
c和
15
n。一种或多种同位素标记可结合在分子中的一个或多个位置处并且一种或多种类型的同位素标记可用在相同的同位素标记分子上。
120.该方法的一个或多个步骤可使用自动机器进行。在某些实施方式中，一种或多种纯化步骤线上进行，并且更优选地所有纯化和质谱法步骤都可以线上方式进行。
121.下列实施例用于阐明本发明。这些实施例并不意欲限制该方法的范围。
实施例
122.实施例1：样品制备
123.通过以不同浓度将人c肽掺入模拟血清(在具有0.002％蛋白酶抑制剂aebsf的磷酸盐缓冲盐水(pbs)中的40mg/ml牛血清白蛋白(bsa))中来制备含不同量的人c肽的模拟血清样品，用于评估线性响应(在下面的实施例4中讨论)。
124.人c肽也以不同浓度掺入从golden west biologicals公司获得的双活性炭处理血清(double charcoal stripped serum)中，以评估线性响应(在下面的实施例4中讨论)。
125.实施例2：在质谱法之前富集c肽
126.使用aria os v 1.6或更新的软件以cohesive technologies aria tx-420系统进行对以上制备的掺入人c肽的模拟血清和处理血清的样品注射。
127.将50μl样品引入(来自phenomenex公司的strata c-8线上spe柱(20mm
×
2.0mm)或等同物)线上固相萃取柱。固相萃取柱保留c肽，同时使其它血清蛋白和大分子流过。
128.用40％乙腈中的0.1％甲酸将c肽从萃取柱洗脱出并转移到分析柱(来自phenomenex公司的onyx整体c18分析柱(50
×
2.0mm))上。hplc梯度被施加到分析柱，以从包含在样品中的其它分析物中分离出c肽。流动相a是在水中的0.1％甲酸，流动相b是在乙腈中的0.1％甲酸。hplc梯度以24.0％有机梯度开始，以约90秒提升到35.5％。
129.c肽富集的样品随后经历ms/ms或高分辨率/高准确度ms或ms/ms用于定量c肽。
130.实施例3：通过串联ms检测和定量c肽
131.使用thermo tsq vantage ms/ms系统(thermo electron corporation)进行ms/ms。在本文所述的实施例中使用下列软件程序——所有都来自thermo electron：tsq ultra quantum v 1.4.1或更新的、xcalibur v 2.0或更新的，以及lcquan v 2.5或更新的。离开分析柱的液体溶剂/分析物流向ms/ms分析仪的加热的喷雾器界面。在界面的加热管中，将溶剂/分析物混合物转变为蒸汽。通过esi电离分析物。
132.离子传送到第一四级杆(q1)。在q1处观察到作为1007.5、1510.38的峰的若干可能的c肽前体离子。示例性q1光谱显示在图1中。m/z为1007.5
±
0.50的三电荷c肽前体离子被选择用于裂解。进入四级杆2(q2)的离子与氩气碰撞(以20v的碰撞池能量)以产生离子碎片，所述离子片段传送到四级杆3(q3)用于进一步选择。从q3扫描(产物离子扫描)收集的示例性碎片谱显示在图2中。对于1007.5
±
0.50前体离子的裂解观察到以下质量转变。
133.表1.观察到的c肽的质量转变(阳极)
[0134][0135]
所观察到的转变中，三个以mrm模式监测并求和用于定量分析：1007.5
±
0.50的前体离子至927.6
±
0.50、785.4
±
0.50和646.1
±
0.50。尽管通过监测三个质量转变完成定量，但通过监测少至单个质量转变可完成定量。相反地，可选择额外的质量转变，以任意组合替代或增加任何上述监测的转变。
[0136]
实施例4：定量c肽的串联ms数据分析
[0137]
通过用三重四级杆串联质谱仪监测所指出的转变的c肽定量在c肽掺入模拟血清样品和掺入处理血清样品上进行。
[0138]
为了确立分析中c肽检测的线性度，横跨约1ng/ml至约500ng/ml的浓度范围对多个掺料模拟血清标准品和掺料处理血清样品进行分析。显示掺料模拟血清标准品和掺料处理血清样品中c肽检测的数据线性度的图表分别显示在图3和图4中。模拟血清中c肽的拟合优度(r2)被确定为0.998，而处理血清中被确定为0.996。
[0139]
实施例5：通过高分辨率/高准确度ms检测c肽
[0140]
使用agilent tof ms系统(agilent technologies公司)进行高分辨率/高准确度ms。该系统使用能够进行高分辨率/高准确度ms的qtof ms分析仪。当测量c肽时，仪器显示出分辨率为约10,000fwhm，质量准确度为约50ppm。
[0141]
以阳离子模式用esi源进行电离。观察到m/z为1510.3
±
0.50(2+离子)和1007.5
±
0.50(3+离子)的多电荷c肽离子。显示c肽离子的横跨约500至2000、1005-1040和1519-1526m/z范围的示例性高分辨率/高准确度光谱分别显示在图5a-5c中。
[0142]
收集m/z为1007.5
±
0.50的离子的数据用于定量c肽。该离子的高分辨率扫描被收集并用于确认所预测的天然同位素分布的相对丰度。横跨约1005至1012范围的示例性高分辨率/高准确度光谱显示在图6中。
[0143]
实施例6：定量c肽的高分辨率/高准确度ms数据分析
[0144]
通过用高分辨率/高准确度质谱仪监测所指出的转变的c肽定量在c肽掺入模拟血清样品和掺入处理血清样品上进行。
[0145]
为了确立分析中c肽检测的线性度，横跨约3.9ng/ml至约500ng/ml(掺料模拟血清)和约31.25ng/ml至约500ng/ml(掺料处理血清)的浓度范围对多个掺料模拟血清标准品和掺料处理血清样品进行分析。显示掺料模拟血清标准品和掺料处理血清样品中c肽检测数据的线性度的图表分别显示在图7和图8中。掺料模拟血清中c肽的拟合优度(r2)被确定为0.998，以及掺料处理血清中被确定为0.996。
[0146]
本文提到或引用的文章、专利和专利申请以及所有其它的文件和电子可得信息的内容以其全部通过引用并入本文，达到如同每个单独出版物被具体地和单独地指出通过引用并入的程度。申请人保留完全地将来自任何这些文章、专利、专利申请或其它有形文件和电子文件的任何和所有材料和信息有形地并入本技术的权利。
[0147]
本文说明性描述的方法可适当地在不存在任何一种或多种要素、一种或多种限定的情况下适当地施行，而不特定为本文所公开的。因此，例如术语“包含”、“包括”、“含有”等应该被扩展性地而非限制性地理解。另外，本文使用的术语和表达被用作描述性而非限制性的术语，并且在这些术语和表达的使用中不意图排除任何示出和描述的特征或其部分。应该认识到在要求保护的本发明的范围内各种修改是可能的。因此，应该理解尽管本发明已通过优选实施方式和任选特征具体公开，但是本文公开的其中体现本发明的修改和变化可由本领域普通技术人员所进行，并且考虑这些修改和变化在本发明的范围内。
[0148]
本发明在本文已经被广泛地和一般地描述。落入一般公开内容内的每一个较窄的种类和亚属的分组也形成本方法的一部分。这包括方法的一般描述，其限制性条款或否定限制从分类除去任何主题，而不管排除的材料是否在本文被具体叙述。
[0149]
其它实施方式在下述权利要求内。此外，在该方法的特征或方面按照马库什组进行描述的情况下，本领域技术人员将认识到本发明也从而按照马库什组成员的任何独立成员或亚组进行描述。