一种整合素生物制剂的抗体检测试剂盒及制备方法与流程

1.本发明涉及抗整合素的抗体检测技术领域，具体而言，涉及一种整合素生物制剂的抗体检测试剂盒及制备方法。


背景技术：

2.整合素是一类细胞膜表面受体，是由α亚基和β亚基组成的一种异二聚体跨膜糖蛋白，是介导细胞与细胞外间质相互作用的主要因子，在免疫调节中起到重要的作用。整合素参与了多种生理与病理过程如炎症、血栓形成、恶性肿瘤生长浸润及转移等。
3.目前，以整合素为靶点而设计的单抗药物或生物制剂，包括α4β7整合素的单抗(vedolizumab维多珠单抗，人源化单抗)和整合素α4的单抗(natalizumab那他珠单抗)，被fda批准用于治疗溃疡性结肠炎、克罗恩病、多发性硬化症等。
4.尽管临床实践证明此类生物制剂在治疗上述疾病时获得良好的疗效，但不是所有的患者均有效，有些患者一开始就无效(原发性无效)，更多的患者是开始时有效，但在使用多次后产生耐药而无效(继发无效)。进一步的研发发现，继发无效者跟体内产生抗生物制剂药物的抗体有关，因此，检测血液中抗生物制剂的抗体是一项重要的伴随诊断。
5.抗整合素的生物制剂抗体的检测方法主要是通过免疫学反应而进行，包括间接法或双抗原夹心法。对于elisa、管式化学发光等有洗涤步骤的检测方案中，间接法是高效有效的检测方法。但对于像层析检测缺乏洗涤步骤的检测方案中，间接法由于受样本中大量的无关抗体干扰，导致假阳性等检测失真。双抗原夹心法虽能有效避免样本中无关抗体的干扰，但在所公布的双抗原夹心法技术方案中，然而假阴性较为严重。
6.鉴于此，特提出本发明。


技术实现要素：

7.本发明的目的在于提供一种整合素生物制剂的抗体检测试剂盒及制备方法以解决上述技术问题。
8.本发明是这样实现的：
9.本发明提供了一种整合素生物制剂的抗体检测试剂盒，其包括抗体捕获器件和抗体检测器件，抗体捕获器件包括固相载体，抗体检测器件为纤维素膜或带有可被检测的标记物的功能性片段；且在固相载体上包被有整合素生物制剂，在纤维素膜上固定有不带标记物的功能性片段；功能性片段为整合素生物制剂的可变区、重链可变区或互补决定区。
10.发明人提供了一种整合素生物制剂的抗体检测试剂盒，该试剂盒同时克服了假阳性和假阴性的缺陷。针对假阳性的缺陷，发明人采用整合素生物制剂作为抗体捕获器件，由于整合素生物制剂具有空间接触面大，更容易捕获到样本中的抗抗体，具有捕获效率高的优点。
11.针对假阴性的缺陷，发明人在检测器件上固定整合素生物制剂的fv(可变区)、hv(重链可变区)或cdrs(互补决定区)，通过减小检测器件上包被物的分子量，从而减小包被
物的空间位阻，使得检测器件上固定物更容易与抗抗体的fab片段结合，使得样本中更低浓度的抗抗体也能实现与检测器件上的固定物特异性结合，提升了检测的灵敏度，达到了整合素生物制剂的伴随诊断的目的。
12.上述试剂盒进行抗抗体检测原理为：以整合素生物制剂作为捕获抗原，与样本中的抗整合素生物制剂的抗体结合，然后用标记的整合素单抗的可变区、重链可变区或互补决定区或固定于膜上的整合素单抗的可变区、重链可变区或互补决定区对抗抗体进行定性或定量。
13.采用上述试剂盒进行抗抗体检测的方法为：待检样本作用于抗体捕获器件，形成抗原抗体复合物，然后让抗原抗体复合物作用于抗体检测器件，形成抗原-抗体-抗原复合物。利用公知的显色方法进行定量或定性检测。
14.在一种可选的实施方式中，上述功能性片段通常具有与其来源抗体相同的结合特异性。fv(可变区)是由重链可变区和轻链可变区通过连接肽或二硫键连接以保持fv的稳定性。cdrs(互补决定区)包含重链可变区和轻链可变区中的cdr1、cdr2及cdr3部分。本领域技术人员根据本发明记载的内容容易理解到，上述抗体的功能性片段可以通过比如酶消化的方法(包括胃蛋白酶或木瓜蛋白酶)和/或通过化学还原分裂二硫键的方法获得。在本发明公开了完整抗体的结构基础上，本领域技术人员容易获得上述的功能性片段。
15.包括不限于选自上述整合素生物制剂的hv、f(ab’)2、fab’、fab、fv、cdrs和scfv中的任意一种。
16.上述抗体的功能性片段还可以通过本领域技术人员所知的重组遗传学技术(如基因重组的方法重组表达)或通过例如自动肽合成仪，比如applied biosystems等销售的自动肽合成仪合成获得。
17.在本发明应用较佳的实施方式中，整合素生物制剂选自整合素的单抗药物。
18.在一种可选的实施方式中，整合素的单抗药物为特异性识别α1β1、α2β1、α4β1、α5β1、αlβ2、αmβ2、αⅱbβ3、αvβ3、α6β4、α4β7、α4、α6整合素的单抗药物。
19.只要能针对上述整合素特异性识别的单抗药物均在本发明的保护范围内。在一种可选的实施方式中，α4单抗药物选自那他珠单抗(natalizumab)；α4β7单抗药物选自维多珠单抗(vedolizumab)。
20.在本发明应用较佳的实施方式中，上述固相载体选自荧光微球、乳胶微球、树脂微球、磁性微球、胶体金颗粒、量子点、微孔板或微孔膜。上述胶体金即四氯金酸经还原剂还原后得到的胶体溶液。在其他实施方式中，上述胶体金也可以是其他的胶体物质，例如胶体碳、胶体银或胶体硒。
21.在一种可选的实施方式中，上述量子点为核壳型量子点，如zns/cdse或zns/cdte形成的量子点。根据需要，上述量子点可以调整为单一化合物形成的量子点，如硒化镉(cdse)、硫化锌(zns)、碲化镉(cdte)、硫化镉(cds)、硒化锌(znse)、磷化铟(inp)或砷化铟(inas)，或是cdse核上包裹一层zns或cds组成的纳米晶或半导体纳米晶等物质中的一种。
22.在一种可选的实施方式中，固相载体上包被的整合素生物制剂上修饰有亲和素或生物素。
23.在一种可选的实施方式中，荧光微球选自时间分辨荧光微球，磁性微球选自磁珠。在一种可选的实施方式中，时间分辨荧光微球选自时间分辨荧光物质与乳胶或纳米颗粒的
结合物，时间分辨荧光物质为镧系元素、镧系元素与乳胶的结合物、镧系元素的螯合物中的一种；镧系元素可以为铕，铽，钐或镝中的任意一种。
24.固相载体上包被有整合素生物制剂的全长，包被全长具有空间接触面大，更容易捕获到样本中的抗抗体，具有捕获效率高的优点。
25.可被检测的标记物是指具有能够被肉眼直接观察或被仪器检测或探测到的特性例如发光、显色、放射性等特性的一类物质，通过该特性可以实现对相应目标物的定性或定量检测。在本发明应用较佳的实施方式中，上述可被检测的标记物选自荧光染料、催化底物显色的酶、放射性同位素、化学发光试剂或纳米颗粒类标记物。
26.在一种可选的实施方式中，荧光染料包括但不限于荧光素类染料及其衍生物(例如包括但不限于异硫氰酸荧光素(fitc)羟基光素(fam)、四氯光素(tet)等或其类似物)、罗丹明类染料及其衍生物(例如包括但不限于红色罗丹明(rbitc)、四甲基罗丹明(tamra)、罗丹明b(tritc)等或其类似物)、cy系列染料及其衍生物(例如包括但不限于cy2、cy3、cy3b、cy3.5、cy5、cy5.5、cy3等或其类似物)、alexa系列染料及其衍生物(例如包括但不限于alexafluor350、405、430、488、532、546、555、568、594、610、33、647、680、700、750等或其类似物)和蛋白类染料及其衍生物(例如包括但不限于藻红蛋白(pe)、藻蓝蛋白(pc)、别藻蓝蛋白(apc)、多甲藻黄素-叶绿素蛋白(precp)等)。
27.在一种可选的实施方式中，催化底物显色的酶包括不限于辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、葡萄糖氧化酶、碳酸酐酶、乙酰胆碱酯酶或6-磷酸葡萄糖脱氧酶。
28.在一种可选的实施方式中，放射性同位素包括不限于
212
bi、
131
i、
111
in、
90
y、
186
re、
211
at、
125
i、
188
re、
153
sm、
213
bi、
32
p、
94
mtc、
99
mtc、
203
pb、
67
ga、
68
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43
sc、
47
sc、
110
min、
97
ru、
62
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64
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68
cu、
86
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88
y、
121
sn、
161
tb、
166
ho、
105
rh、
177
lu、
172
lu或
18
f。
29.在一种可选的实施方式中，化学发光试剂包括不限于鲁米诺及其衍生物、光泽精、甲壳动物荧光素及其衍生物、联吡啶钌及其衍生物、吖啶酯及其衍生物、二氧环乙烷及其衍生物、洛粉碱及其衍生物或过氧草酸盐及其衍生物。
30.在一种可选的实施方式中，纳米颗粒类标记物包括不限于纳米颗粒或胶体。
31.在一种可选的实施方式中，胶体包括不限于胶体金属、分散型染料、染料标记的微球和乳胶；在一种可选的实施方式中，胶体金属包括不限于胶体金、胶体银、胶体碳或胶体硒；
32.在一种可选的实施方式中，纳米颗粒包括不限于有机纳米颗粒、磁性纳米颗粒、量子点纳米颗粒或稀土络合物纳米颗粒。
33.在本发明应用较佳的实施方式中，上述纤维素膜上还固定有质控抗体作为质控t线，且功能性片段与质控抗体分别间隔设置；
34.在一种可选的实施方式中，纤维素膜包括不限于醋酸纤维素膜或硝酸纤维素膜。
35.在本发明应用较佳的实施方式中，上述维多珠单抗的可变区由重链可变区和轻链可变区通过连接肽或二硫键连接。维多珠单抗的重链可变区如seq id no.1所示：
36.qvqlvqsgaevkkpgasvkvsckgsgytftsywmhwvrqapgqaiewigeidpsesntnynqktkgrvtltvdisastaymelsslrsedtavyycarggkdgwdyaidywgqgtlvtvss。
37.维多珠单抗的轻链可变区如seq id no.2所示：
38.dvvmtqsplslpvtpgepasiscrssqslaksygntylswylqkpgqspqlliygisnrfsgvpdrfs
gsgsgtdftlkisrveaedvgvyyclqgthqpytfgqgtkveikrtv。
39.维多珠互补决定区包括通过二硫键或连接肽连接的cdr-h1、cdr
–
h2、cdr
–
h3、cdr-l1、cdr
–
l2和cdr
–
l3：
40.cdr-h1：sywmh；cdr-h2：eidpsesntnynqktkg；cdr-h3：ggkdgwdyaidy；
41.cdr-l1：rssqslaksygntyls；cdr-l2：gisnrfs；cdr-l3：lqgthqpyt。
42.那他珠单抗的可变区包括通过二硫键或连接肽连接的重链可变区和轻链可变区。
43.重链可变区如seq id no.3所示：
44.qvqlvqsgaevkkpgasvkvsckasgfnikdtyihwvrqapgqrlewmgridpangytkydpkfqgrvtitadtsastaymelsslrsedeavyycaregyygnygvyamdywgqgtlvtvss。
45.那他珠单抗的轻链可变区如seq id no.4所示：
46.diqmtqspsslsasvgdrvtitcktsqdinkymawyqqtpgkaprllihytsalqpgipsrfsgsgsgrdytftisslqpediatyyclqydnlwtfgqgtkveikrtv。
47.那他珠互补决定区包括通过二硫键或连接肽相连的cdr-h1、cdr
–
h2、cdr
–
h3、cdr-l1、cdr
–
l2和cdr
–
l3：
48.cdr-h1：dtyih；cdr-h2：ridpangytkydpkfqg；cdr-h3：egyygnygvyamdy；
49.cdr-l1：ktsqdinkyma；cdr-l2：ytsalqp；cdr-l3：lqydnlwt。
50.需要说明的是，在其他的实施例中，本发明提供的整合素生物制剂的重链可变区的氨基酸序列可以与上述对应可变区序列、重链可变区或互补决定区可以具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同源性。
51.本发明还提供了一种整合素生物制剂的抗体检测试剂盒的制备方法，其包括：将整合素生物制剂固定在固相载体上作为抗体捕获器件，将不带标记物的功能性片段结合或固定在纤维素膜上或者对功能性片段进行标记物标记作为抗体检测器件。
52.在本发明应用较佳的实施方式中，当固相载体选自磁性微球时，制备方法包括先在磁性微球上修饰链霉亲和素。
53.在本发明应用较佳的实施方式中，整合素生物制剂的抗体检测试剂盒为定量检测试剂盒或定性检测试剂盒。
54.在本发明应用较佳的实施方式中，整合素生物制剂的抗体检测试剂盒为时间分辨荧光免疫层析检测试剂盒、胶体金免疫层析检测试剂盒、量子点荧光免疫层析检测试剂盒、酶联免疫检测试剂盒或化学发光检测试剂盒。
55.本发明具有以下有益效果：
56.本发明提供了一种整合素生物制剂的抗体检测试剂盒，该试剂盒同时克服了假阳性和假阴性的缺陷。针对假阳性的缺陷，发明人采用整合素生物制剂作为抗体捕获器件，由于整合素生物制剂具有空间接触面大，更容易捕获到样本中的抗抗体，具有捕获效率高的优点。
57.针对假阴性的缺陷，发明人在检测器件上固定整合素生物制剂的重链可变区，通过减小检测器件上包被物的分子量，从而减小包被物的空间位阻，使得检测器件上固定物更容易与抗抗体的fab片段结合，使得样本中更低浓度的抗抗体也能实现与检测器件上的固定物特异性结合，提升了检测的灵敏度，达到了整合素生物制剂的伴随诊断的目的。
附图说明
58.为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
59.图1是本发明抗维多珠单抗抗体时间分辨荧光免疫层析试纸的装置图；
60.图2是本发明抗那他珠单抗抗体胶体金免疫层析试纸的装置图；
61.图3是本发明抗维多珠单抗抗体量子点荧光免疫层析试纸的装置图；
62.图4是本发明抗那他珠单抗抗体酶联免疫测定试剂盒检测原理图；
63.图5是本发明抗维多珠单抗抗体化学发光测定试剂盒检测原理图；
64.图6是本发明抗维多珠单抗抗体时间分辨荧光免疫层析试剂盒校准曲线回归图；
65.图7是本发明抗那他珠单抗抗体胶体金免疫层析试剂盒校准曲线回归图；
66.图8是本发明抗维多珠单抗抗体量子点荧光免疫层析试剂盒校准曲线回归图；
67.图9是本发明抗那他珠单抗抗体酶联免疫测定试剂盒校准曲线回归图；
68.图10是本发明抗维多珠单抗抗体化学发光测定试剂盒校准曲线回归图。
69.附图标记：1-样品垫；2-结合垫；3-硝酸纤维素膜；4-检测线；5-质控线；6-吸水膜；7-背衬底板。
具体实施方式
70.为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
71.以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
72.实施例1
73.本实施例提供了一种抗维多珠单抗时间分辨荧光免疫层析定量检测试剂盒及其制备方法。
74.抗维多珠抗体免疫层析试纸图1所示，该试纸是在背衬底板7上设置有硝酸纤维素膜3、样品垫1、结合垫2和吸水膜6，样品垫1叠压在结合垫2一端，结合垫2另一端和吸水膜6分别叠压在硝酸纤维素膜3的两端上；该结合垫2上包被有时间分辨荧光微球标记的维多珠单抗和时间分辨荧光微球标记的羊抗鸡igy抗体；该硝酸纤维素膜3上设有检测线4(t线)和质控线5(c线)，检测线4(t线)包被有维多珠单抗的重链可变区(hv)，质控线5(c线)包被有鸡igy抗体。
75.维多珠单抗的重链可变区如下：
76.qvqlvqsgaevkkpgasvkvsckgsgytftsywmhwvrqapgqaiewigeidpsesntnynqktkgrvtltvdisastaymelsslrsedtavyycarggkdgwdyaidywgqgtlvtvss。
77.试剂盒的制备以及检测方法如下：
78.1)时间分辨荧光微球的标记。
79.取时间分辨荧光微球500μl(300nm)(1％原液)，13000rpm,4℃离心10min，弃上清。
加入10mg/ml的edc，反应15min；离心，弃上清，加硼酸盐缓冲液(20mm，ph8.0)1000μl，超声10秒混匀；加入标记抗体(维多珠单抗或羊抗鸡igy)100μg(标记浓度100μg/ml)，室温反应2h；离心，弃上清，加入封闭液，反应1h；离心，弃上清，加入1000μl硼酸盐缓冲液，超声混匀，做好标签，4℃保存待用。
80.2)样品垫、结合垫的处理
81.聚酯膜用含有表面活性剂的缓冲液(配方：20mm ph 8.0bb，其中含有2％bsa、1％酪蛋白、2％吐温-20、1％s9和5％海藻糖)浸泡进行预处理，37℃干燥过夜，制备得到结合垫；取制备好的结合垫，以金标hm3035喷金划膜仪，将标记有时间分辨荧光微球的维多珠单抗和羊抗鸡igy抗体混合后，以4μl/cm喷至预处理过宽为1cm的结合垫上，37℃干燥，干燥3小时，制备得到特异性结合垫。
82.玻璃纤维素膜用含有表面活性剂的缓冲液(配方：100mm ph 7.4pb，其中含有2％bsa、0.5％s9和5％蔗糖)浸泡进行预封闭后，37℃干燥过夜，裁切为30*1.5cm制备得到样品垫。
83.3)硝酸纤维素膜(nc膜)的包被
84.氨基酸合成方法合成维多珠单抗(vedolizumab)的重链可变区，经验证，该合成多肽能与抗维多珠单抗抗体反应。
85.将nc膜贴至背衬底板的指定位置，用50mm的ph 7.4磷酸盐缓冲液将维多珠单抗的重链可变区(hv)稀释至1.5mg/ml，用于制备t线；50mm的ph7.4磷酸盐缓冲液将鸡igy抗体稀释至0.5mg/ml，用于制备c线；按1μl/cm划液量，通过金标hm3035喷金划膜仪将上述两种稀释后的抗体均匀的划至nc膜上制备t线和c线；将划好的nc膜放置于37℃干燥箱中干燥过夜。
86.4)组装
87.将步骤2)结合垫叠压在步骤3)得到的硝酸纤维素膜的一端，并将吸水膜固定叠压在硝酸纤维素膜的另一端，最后将步骤2)得到的样品垫叠压在结合垫另一端，用裁膜仪按每条4mm的宽度进行裁剪，并装入层析条壳体中，即得成品。
88.5)检测
89.将血清稀释20倍，取90μl加入加样孔，反应10min后置于荧光读数仪检测。与标准品或参考品的数值比较，判断待检样本中抗抗体的含量。
90.本实施例之中，时间分辨荧光物质乳胶微球为含铕乳胶微球，即时间分辨荧光物质为镧系元素铕与乳胶的结合物。在其他实施方式中，也可以根据需要，将时间分辨荧光物质调整为镧系元素、镧系元素与乳胶的结合物、镧系元素的螯合物中的一种；镧系元素可以为铕，铽，钐或镝中的一种。
91.实施例2
92.本实施例提供了一种抗那他珠单抗(natalizumab)胶体金免疫层析测定试剂盒及其制备方法。
93.抗那他珠单抗免疫层析试纸参照图2所示，该试纸是在背衬底板7上设置有硝酸纤维素膜3、样品垫1、结合垫2和吸水膜6，样品垫1叠压在结合垫2一端，结合垫2另一端和吸水膜6分别叠压在硝酸纤维素膜3的两端上；该结合垫2上包被有胶体金标记的生物素化那他珠单抗和羊抗鸡igy抗体2；该样品垫1含有链霉亲和素；该硝酸纤维素膜3上设有检测线4(t
线)和质控线5(c线)，检测线4(t线)包被有那他珠单抗的可变区(fv)，质控线5(c线)包被有鸡igy抗体。
94.那他珠单抗的可变区包括通过连接肽连接的重链可变区和轻链可变区。
95.那他珠单抗的重链可变区如下：
96.qvqlvqsgaevkkpgasvkvsckasgfnikdtyihwvrqapgqrlewmgridpangytkydpkfqgrvtitadtsastaymelsslrsedeavyycaregyygnygvyamdywgqgtlvtvss。
97.那他珠单抗的轻链可变区如下：
98.diqmtqspsslsasvgdrvtitcktsqdinkymawyqqtpgkaprllihytsalqpgipsrfsgsgsgrdytftisslqpediatyyclqydnlwtfgqgtkveikrtv。
99.连接肽选自ggggsggggsggggs。
100.1)胶体金的制备
101.将制备胶体金所用的圆底烧瓶及玻璃试剂瓶洗净，与次强酸洗液中浸泡后，彻底洗净，烘干。取洁净的圆底烧瓶，向其中添加100ml超纯水，加入1ml 1％氯金酸，煮沸。迅速向其中加入2ml 1％柠檬酸钠，待颜色变成紫红色后，继续反应10min，停止加热。冷却后，加超纯水至100ml，4度备用。
102.2)标记抗体的生物素化
103.取1mg那他珠单抗置于5ml离心管中，加入60μl 10mg/ml的活化生物素(sulfo-nhs-lc-bintin)，补加0.02m pbs至体积为1ml，室温反应1小时，将反应液取出，以0.02m pbs透析过夜。将生物素化那他珠单抗抗体取出，加入0.03％proclin300防腐，4度备用。
104.3)胶体金的标记
105.取10ml制备好的胶体金，加入300μl 0.2m碳酸钾混匀后，加入150μg生物素化那他珠单抗或羊抗鸡igy反应室温30min，加入1％bsa封闭30min。12000rpm 4℃离心30min，取沉淀以1ml重悬溶液(配方：20mm ph 8.0bb，其中含有2％bsa、2％吐温-20和5％蔗糖)溶解，4度备用。
106.3)样品垫、结合垫的处理
107.以金标hm3035喷金划膜仪，将标记胶体金的生物素化那他珠全长和羊抗鸡igy抗体混合后，以3μl/cm喷至宽为1cm*30cm的玻璃纤维垫上，37℃干燥3小时，制备得到胶体金结合垫。
108.玻璃纤维素膜用含有链霉亲和素的缓冲液(配方：100mm ph 7.4pb，其中含有1％链霉亲和素，1％bsa、0.5％酪蛋白、0.5％s9和2％蔗糖)浸泡进行预封闭后，37℃干燥过夜，裁切为30*1.5cm制备得到样品垫。
109.4)硝酸纤维素膜(nc膜)的包被
110.氨基酸合成方法合成那他珠单抗的可变区，经验证，该合成多肽能与抗那他珠单抗抗体反应。
111.将nc膜贴至背衬底板的指定位置，用50mm的ph 7.4磷酸盐缓冲液将那他珠的可变区(fv)稀释至1.5mg/ml，用于制备t线；50mm的ph7.4磷酸盐缓冲液将鸡igy抗体稀释至0.5mg/ml，用于制备c线；按1μl/cm划液量，通过金标hm3035喷金划膜仪将上述两种稀释后的抗体均匀的划至nc膜上制备t线和c线；将划好的nc膜放置于37℃干燥箱中干燥过夜。
112.5)组装
113.将步骤2)结合垫叠压在步骤3)得到的硝酸纤维素膜的一端，并将吸水膜固定叠压在硝酸纤维素膜的另一端，最后将步骤2)得到的样品垫叠压在结合垫另一端，用裁膜仪按每条4mm的宽度进行裁剪，并装入层析条壳体中，即得成品。
114.6)检测
115.将血清稀释20倍，取90μl加入加样孔，反应10min后置于胶体金读数仪检测。与标准品或参考品的数值比较，判断待检样本中抗抗体的含量。
116.本实施例之中，胶体金，即四氯金酸经还原剂还原后得到的胶体溶液；在其他实施方式中，根据需要，上述标记物可以调整为胶体碳、胶体银中的一种。
117.实施例3
118.本实施例提供了抗维多珠单抗抗体量子点荧光免疫层析测定试剂盒及其制备方法。
119.抗维多珠单抗抗体免疫层析试纸参照图3所示，该试纸是在背衬底板7上设置有硝酸纤维素膜3、样品垫1、结合垫2和吸水膜6，样品垫1叠压在结合垫2一端，结合垫2另一端和吸水膜6分别叠压在硝酸纤维素膜3的两端上；该结合垫2上包被有量子点标记的维多珠单抗和羊抗鸡igy抗体；该硝酸纤维素膜3上设有检测线4(t线)和质控线5(c线)，检测线4(t线)包被有维多珠单抗的重链可变区(hv)，质控线5(c线)包被有鸡igy抗体。
120.维多珠单抗的重链可变区(hv)同实施例1所示。
121.1)量子点的标记
122.取量子点100μl，13000rpm,4℃离心10min，弃上清，加入mes buffer 1000μl，超声混匀，称量20mg edc和20mg nhs缓慢加入微球混合液中，及时超声混匀，反应15分钟；离心，弃上清，加硼酸盐缓冲液(20mm，ph8.0)1000μl，超声混匀；加入标记抗体(维多珠单抗或羊抗鸡igy)100μg(标记浓度100μg/ml)，室温反应2h；离心，弃上清，加入1000μl封闭液，冰水超声混匀，室温反应1h；离心，弃上清，加入1000μl硼酸盐缓冲液(20mm ph8.0)，超声10-30秒混匀，做好标签，4℃保存待用。
123.2)样品垫、结合垫的处理
124.聚酯膜用含有表面活性剂的缓冲液(配方：20mm ph 8.0bb，其中含有2％bsa、2％吐温-20、1％s9和5％海藻糖)浸泡进行预封闭，37℃干燥过夜，制备得到结合垫；取制备好的结合垫，以金标hm3035喷金划膜仪，将标记有量子点的维多珠单抗和羊抗鸡igy抗体混合后，以4μl/cm喷至预处理过宽为1cm的结合垫上，37℃干燥，干燥时间至少3小时，制备得到特异性结合垫。
125.玻璃纤维素膜用含有表面活性剂的缓冲液(配方：100mm ph 7.4pb，其中含有1％bsa、0.5％酪蛋白、0.1％吐温-20、0.5％s9和2％蔗糖)浸泡进行预封闭后，37℃干燥过夜，裁切为30*1.5cm制备得到样品垫。
126.3)硝酸纤维素膜(nc膜)的包被
127.氨基酸合成方法合成维多珠单抗的重链可变区，经验证，用该合成多肽包被酶标板，能与抗维多珠单抗抗体反应。
128.将nc膜贴至背衬底板的指定位置，用50mm的ph 7.4磷酸盐缓冲液将维多珠单抗的重链可变区(hv)稀释至1.5mg/ml，用于制备t线；50mm的ph7.4磷酸盐缓冲液将鸡igy抗体稀释至0.5mg/ml，用于制备c线；按1μl/cm划液量，通过金标hm3035喷金划膜仪将上述两种稀
释后的抗体均匀的划至nc膜上制备t线和c线；将划好的nc膜放置于37℃干燥箱中干燥过夜。
129.4)组装
130.将步骤2)结合垫叠压在步骤3)得到的硝酸纤维素膜的一端，并将吸水膜固定叠压在硝酸纤维素膜的另一端，最后将步骤2)得到的样品垫叠压在结合垫另一端，用裁膜仪按每条4mm的宽度进行裁剪，并装入层析条壳体中，即得成品。
131.5)检测
132.将血清稀释20倍，取70μl加入加样孔，反应10min后置于荧光读数仪检测。与标准品或参考品的数值比较，判断待检样本中抗抗体的含量。
133.本实施例之中，量子点为核壳型量子点，zns/cdse或zns/cdte形成的量子点。在其他实施方式中，根据需要量子点可以调整为单一化合物形成的量子点，如硒化镉(cdse)、硫化锌(zns)、碲化镉(cdte)/硫化镉(cds)等其中的一种。
134.实施例4
135.本实施例提供了一种抗那他珠单抗抗体酶联免疫测定试剂盒及其制备方法。
136.抗那他珠抗体酶联免疫检测试剂盒，包括酶标板、生物素化那他珠单抗，抗那他珠抗体校准品、抗那他珠抗体质控品、酶结合物、清洗液、终止液。所述酶结合物为辣根过氧化物酶(hrp)标记的那他珠互补决定区(cdrs)。该酶标板包被有链霉亲和素。
137.那他珠互补决定区包括通过二硫键相连的cdr-h1、cdr
–
h2、cdr
–
h3、cdr-l1、cdr
–
l2和cdr
–
l3：
138.cdr-h1：dtyih；cdr-h2：ridpangytkydpkfqg；cdr-h3：egyygnygvyamdy；
139.cdr-l1：ktsqdinkyma；cdr-l2：ytsalqp；cdr-l3：lqydnlwt。
140.制备流程参照图4所示，如下为制备方法和检测方法：
141.1)那他珠单抗的生物素化
142.取1mg那他珠单抗置于5ml离心管中，加入60μl 10mg/ml的活化生物素(sulfo-nhs-lc-bintin)，补加0.02m pbs至体积为1ml，室温反应1小时，将反应液取出，以0.02m pbs透析过夜。将生物素化那他珠全长抗体取出，加入0.03％proclin300防腐，4度备用。
143.2)hrp标记那他珠互补决定区(cdrs)
144.氨基酸合成方法合成那他珠单抗的互补决定区，经验证，该合成多肽能与抗那他珠单抗抗体反应。
145.称取5mg hrp置于5ml离心管中，加入1ml纯水溶解，加入1ml naio4溶液(10mg/ml，现用现配)，4度避光反应30min。加入0.02ml乙二醇，室温反应15min。将上述溶液透析后取出。将1mg赛妥珠重链可变区(hcdr)加入上述活化好的溶液中，室温避光反应2小时，加0.2ml nabh4溶液(5mg/ml，现用现配)，混匀，以0.05m cb透析过夜。将标记好的酶标抗体取出，加入等体积甘油，置于-20℃保存备用。
146.3)包被酶标板
147.将cb缓冲液稀释链霉亲和素至1μg/ml，每孔100μl包被微孔板，37℃2h。吸去包被液，用含2％bsa的封闭缓冲液每孔200μl，37℃孵育2小时，拍去封闭液，37度烘干备用。
148.4)包被生物素化那他珠单抗
149.用中性磷酸盐缓冲液稀释生物素化那他珠单抗至1μg/ml，每孔100μl，37℃2h。洗
板3次，用含2％bsa的封闭缓冲液每孔200μl，37℃孵育2小时，拍去封闭液，37度烘干备用。
150.5)把待检血清样本稀释100倍，每孔100μl加入微孔板，37度孵育2小时，洗板4次。
151.6)加入hrp标记那他珠互补决定区(cdrs)，孵育1小时，洗板4次。
152.7)微孔板中加入hrp酶的底物tmb，孵育15分钟，加入终止液hcl溶液终止显色反应，用450nm波长检测od值，与标准品或参考品的od值比较，判断待检样本中抗抗体的含量。
153.实施例5
154.本实施例提供了一种抗维多珠单抗抗体化学发光测定试剂盒及其制备方法。
155.抗维多珠单抗抗体化学发光检测试剂盒包括生物素化维多珠单抗、抗维多珠单抗抗体校准品、抗维多珠单抗抗体质控品、吖啶酯标记的维多珠重链可变区、磁微粒试剂、激发液和清洗液。
156.维多珠重链可变区同实施例1。
157.制备及检测步骤如下：
158.1)维多珠单抗的生物素化
159.取1mg维多珠单抗置于5ml离心管中，加入50μl 10mg/ml的活化生物素(sulfo-nhs-lc-bintin)，补加0.02m pbs至体积为1ml，室温反应1小时，将反应液取出，以0.02m pbs透析过夜。将生物素化维多珠全长抗体取出，加入0.03％proclin300防腐，4度备用。
160.2)吖啶酯标记维多珠重链可变区
161.氨基酸合成方法合成维多珠单抗的重链可变区，经验证，该合成多肽能与抗维多珠单抗抗体反应。
162.取2mg维多珠重链可变区，按抗体：吖啶酯＝1:10～50摩尔比加入已活化的吖啶酯，室温反应30min。将反应液以0.05m cb溶液透析后取出，加入等体积甘油，置于-20℃保存备用。
163.3)检测步骤
164.本方法利用吖啶酯化学发光免疫分析技术-结合生物素-亲和素磁颗粒分离技术实现抗抗体检测。其检测原理如图5：将样本(稀释20倍)和链霉亲和素磁微粒(1)及生物素化维多珠单抗(2)混合，得到链霉亲和素磁珠-生物素化维多珠单抗-样本复合物(3)，洗涤后，加入吖啶酯标记的维多珠重链可变区进行反应后，形成链霉亲和素磁珠-生物素化维多珠单抗-样本-吖啶酯标记维多珠重链可变区复合物。加入发光激发液，测定发光强度，与标准品或参考品的数值比较，判断待检样本中抗抗体的含量。
165.实验例1
166.本实验例对实施例1提供的试剂盒进行定量检测以检验其性能。
167.1.1标准曲线制作
168.1.1.1取抗维多珠抗体校准品一套，具体值见表1。
169.表1
[0170][0171]
1.1.2检测方法
[0172]
取校准品90μl，直接加入层析条中样品窗口；10分钟之后，用时间分辨荧光定量分
析仪定量检测信号值。
[0173]
每个校准品检测2次，取t/c值的平均值。具体结果见表2。
[0174]
表2
[0175][0176][0177]
1.1.3标准曲线制备
[0178]
根据上述检测结果，以浓度值为x轴，以t/c值为y轴，进行线性回归，得到线性方程：y＝0.0095x+0.2589，r2＝0.9928，曲线见图6。
[0179]
1.2精密度测试：
[0180]
1.2.1取制备好的10张层析条，配置一个浓度(100ng/ml)的抗维多珠抗体工作校准品；
[0181]
1.2.2取90μl校准品，直接加入试剂条加样孔中；
[0182]
1.2.3待校准品层析10min之后，用时间分辨荧光定量分析仪进行检测，根据上述线性方程测得10个试剂条的结果，结果如表3，说明本方法的抗维多珠抗体时间分辨荧光免疫层析测定试剂盒精密度良好。
[0183]
表3
[0184][0185]
1.3与其他的方法相比：
[0186]
以维多珠单抗标记微球，以维多珠单抗包被nc膜为方法2；以维多珠fab标记微球，以维多珠fab包被nc膜为方法3。三种方法，除标记抗体和包被抗体不同，其他条件相同，三种结果对比如表4。
[0187]
表4
[0188] 本实施例方法2方法3
检出限＜5ng/ml＜10ng/ml＜20ng/ml检测范围5-500ng/ml10-400ng/ml20-500ng/ml线性r20.99280.98830.9876精密度4.51％15.90％18.82％非特异背景干扰低高低
[0189]
实验例2
[0190]
本实验例对实施例2提供的试剂盒进行定量检测以检验其性能。
[0191]
2.1标准曲线制作
[0192]
2.1.1取抗那他珠单抗抗体校准品一套，具体值见表5。
[0193]
表5
[0194][0195]
2.1.2检测方法
[0196]
取校准品90μl，直接加入层析条中样品窗口；10分钟之后，用胶体金读数仪检测信号值。每个校准品检测2次，取t/c值的平均值。具体结果见表6。
[0197]
表6
[0198][0199]
2.1.3标准曲线制备
[0200]
根据上述检测结果，以浓度值为x轴，以t/c值为y轴，进行线性回归，得到线性方程：y＝0.004x+0.1157，r2＝0.9951，曲线见图7。
[0201]
2.2精密度测试：
[0202]
2.2.1取制备好的10张层析条，配置一个浓度(50ng/ml)的抗那他珠单抗抗体工作校准品；
[0203]
2.2.2取90μl校准品，直接加入试剂条加样孔中；
[0204]
2.2.3待校准品层析10min之后，用胶体金读数仪进行检测，根据上述线性方程测得10个试剂条的结果，结果如表7，说明本方法的抗那他珠单抗抗体胶体金免疫层析测定试剂盒精密度良好。
[0205]
表7
[0206][0207]
2.3与其他的方法相比：
[0208]
以本实施例为对照，以那他珠单抗标记胶体金，以那他珠单抗包被nc膜为方法2；以那他珠单抗fab标记胶体金，以那他珠单抗fab包被nc膜为方法3。三种方法，除标记抗体和包被抗体不同，其他条件相同，结果对比如表8。
[0209]
表8
[0210] 本实施例方法2方法3检出限＜5ng/ml＜10ng/ml＜20ng/ml检测范围5-500ng/ml10-500ng/ml20-400ng/ml线性r20.99510.99010.9874精密度5.99％16.42％18.39％非特异背景干扰低高低
[0211]
实验例3
[0212]
本实验例对实施例3提供的试剂盒进行定量检测以检验其性能。
[0213]
3.1标准曲线制作
[0214]
3.1.1取抗维多珠单抗抗体校准品一套，具体值见表9。
[0215]
表9
[0216][0217]
3.1.2检测方法
[0218]
取校准品70μl，直接加入层析条中样品窗口；10分钟之后，用荧光定量分析仪检测信号值。每个校准品检测2次，取t/c值的平均值。具体结果见表10。
[0219]
表10
[0220]
[0221][0222]
3.1.3标准曲线制备
[0223]
根据上述检测结果，以t/c值为x轴，以浓度值为y轴，进行曲线拟合，得到曲线方程：y＝45.082x
2-14.298x-5.829，r2＝0.9983，曲线见图8。
[0224]
3.2精密度测试：
[0225]
3.2.1取制备好的10张层析条，配置一个浓度(50ng/ml)的抗维多珠单抗抗体工作校准品；
[0226]
3.2.2取70μl校准品，直接加入试剂条加样孔中；
[0227]
3.2.3待校准品层析10min之后，用荧光定量分析仪进行检测，根据上述方程测得10个试剂条的结果，结果如表11，说明本方法的抗维多珠单抗抗体量子点荧光免疫层析测定试剂盒精密度良好。
[0228]
表11
[0229][0230][0231]
3.3与其他的方法相比：
[0232]
以维多珠单抗标记量子点，以维多珠单抗包被nc膜为方法2；以维多珠单抗fab标记量子点，以维多珠单抗fab包被nc膜为方法3。三种方法，除标记抗体和包被抗体不同，其他条件相同，三种结果对比如表12。
[0233]
表12
[0234][0235]
实验例4
[0236]
本实验例对实施例4提供的试剂盒进行定量检测以检验其性能。
[0237]
4.1检测方法
[0238]
4.1.1取抗那他珠单抗抗体校准品(定制)一套，具体值见表13。
[0239]
表13
[0240][0241]
4.1.2检测步骤
[0242]
1)将校准品及质控品，每孔100μl加入微孔板，37度孵育2小时，洗板4次。
[0243]
2)加入hrp标记那他珠单抗互补决定区，孵育1小时，洗板4次。
[0244]
3)微孔板中加入hrp酶的底物tmb，孵育15分钟，加入终止液hcl溶液终止显色反应，用450nm波长检测od值，判断试剂盒性能。具体结果见表14。
[0245]
表14
[0246][0247]
raw data{wavelength:450.0}
[0248] 12345a0.0720.0690.4940.4890.052b0.1260.1210.4720.4670.031c0.2560.2470.4630.468 d0.5870.5920.4760.472 e0.8320.8270.0460.048 f1.4461.4080.0320.059 g2.4892.4410.0370.04 h0.4730.4820.0280.038 [0249]
4.1.3标准曲线
[0250]
根据上述检测结果，以od值为x轴，以浓度值为y轴，进行曲线拟合，得到曲线方程：y＝54.77x2+70.01x-6.2404，r2＝0.9991，曲线见图9。
[0251]
4.2精密度测试：
[0252]
根据检测的精密度质控品的od值，以曲线方程进行计算结果值，结果如表15，说明本方法的抗那他珠单抗抗体酶联免疫测定试剂盒精密度良好。
[0253]
表15
[0254][0255]
4.3与其他的方法相比：
[0256]
以那他珠单抗标记hrp，以那他珠单抗包被微孔板为方法2；以那他珠单抗fab标记hrp，以那他珠单抗fab包被微孔板为方法3。三种方法，除标记抗体和包被抗体不同，其他条件相同，三种结果对比如表16。
[0257]
表16
[0258][0259]
实验例5
[0260]
本实验例对实施例5提供的试剂盒进行定量检测以检验其性能。
[0261]
5.1检测方法
[0262]
5.1.1取抗维多珠单抗抗体校准品一套，具体值见表17。
[0263]
表17
[0264][0265][0266]
5.1.2检测步骤
[0267]
1)分别取20μl校准品、20μl链霉亲和素磁微粒、50μl生物素化维多珠单抗加入微孔中混合，37度孵育15min，清洗3次。
[0268]
2)加入吖啶酯标记维多珠单抗重链可变区，37度孵育15min，清洗3次。
[0269]
3)加入发光激发液，测定发光强度。具体结果见表18。
[0270]
表18
[0271][0272]
5.1.3标准曲线
[0273]
根据上述检测结果，以浓度值的对数值为x轴，以发光值的对数值为y轴，进行进行线性回归，得到线性方程：y＝0.9339x+2.8704，r2＝0.9923，曲线见图10。
[0274]
5.2精密度测试：
[0275]
取20μl精密度质控品、20μl链霉亲和素磁微粒、50μl生物素化维多珠单抗加入微孔中混合，37度孵育15min，清洗3次；加入吖啶酯标记维多珠单抗重链可变区，37度孵育15min，清洗3次；3)加入发光激发液，测定发光强度。根据上述曲线方程，计算结果值。结果如表15，说明本方法的抗维多珠单抗抗体化学发光免疫测定试剂盒精密度良好。具体结果见表19。
[0276]
表19
[0277][0278]
5.3与其他的方法相比：
[0279]
以维多珠单抗标记吖啶酯，以维多珠单抗标记生物素为方法2；以维多珠单抗fab
标记吖啶酯，以维多珠单抗fab标记生物素为方法3。三种方法，除标记吖啶酯的抗体和标记生物素的抗体不同，其他条件相同，三种结果对比如表20。
[0280]
表20
[0281][0282]
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。