一种分析样品中唾液酸含量的高效液相色谱法的制作方法

1.本发明涉及化学物质检测领域，具体涉及一种分析样品中唾液酸含量的高效液相色谱法。


背景技术：

2.双特异性抗体、抗体药物偶联物、糖基工程抗体和纳米抗体等新型工程抗体等新理论新技术不断涌现。抗体药物多通过哺乳动物细胞表达，基因翻译后正确的折叠、空间构象以及修饰决定了抗体药物的正常功能。因此控制翻译后修饰的变异体的种类及数量是抗体药物研发过程面临的巨大挑战之一。抗体药物中糖链的质量占整个抗体分子的2％，对于治疗自体免疫疾病的单克隆抗体，糖链末端的唾液酸修饰的数量可能与其抗炎效果存在强烈的正相关。最常见的是n-乙酰基神经氨酸，唾液酸的物理分析方法很多，有分光光度法、薄层层析法、高效液相色谱法、核磁共振法和高效液相色谱质谱联用技术等。然而，分光光度法的特异性不强，薄层法的重复性差，质谱法的成本高。
3.目前，现有技术例如利用岛津超高效液相色谱仪lc-30a建立了测定抗体中唾液酸n-乙酰神经氨酸(neu5ac)和n-羟乙酰神经氨酸(neu5gc)含量的分析方法(https://www.instrument.com.cn/application/solution-895694.html)。但是该技术中使用的三氟乙酸具有酸解不充分现象或影响衍生化反应的现象，后续检测结果不够准确。
4.因此，亟待研究一种简单、特异性强而且准确度高的高效液相色谱法来分析不同类型抗体中唾液酸含量。


技术实现要素：

5.本发明要解决的技术问题是现有的分析技术中特异性不强、重复性差，成本高等问题，从而提供一种分析样品中唾液酸含量的高效液相色谱法。
6.为解决上述技术问题，本发明提供一种测定蛋白样品中唾液酸的方法，所述方法包括以下步骤：
7.a)将乙酸与所述蛋白样品混合获得混合液，以使所述蛋白样品中的唾液酸释放；优选所述方法还包括：
8.b)将所述混合液进行孵育，获得孵育液。
9.在某一具体实施例中，所述乙酸的浓度为3-5m，所述乙酸与所述蛋白样品的比例为1:1，所述孵育的温度为80℃，所述蛋白样品来自阿达木单抗例如修美乐。
10.在某一具体实施例中，所述乙酸的浓度为4m；所述唾液酸为neu5ac和/或neu5gc。
11.在某一具体实施例中，在所述混合之前还包括：
12.(1)将蛋白样品进行换液处理，所述换液使用缓冲液例如pbs洗涤例如4次，所述换液使用超滤管，获得换液后的蛋白样品。
13.在某一具体实施例中，在所述孵育之后还包括：
14.c)加入dmb溶液，混匀，反应例如2.5h；
15.在某一具体实施例中，所述dmb溶液的浓度为13mm，所述孵育液和所述dmb的比例为1:1，所述c)中反应的条件为避光，温度为50℃。
16.在某一具体实施例中，所述dmb溶液为含有1.5m乙酸，14mm连二亚硫酸钠，0.8m 2-巯基乙醇，13mm dmb。
17.在某一具体实施例中，所述方法中使用高效液相色谱法进行检测，所述高效液相色谱法使用的液相色谱柱的型号为thermo hypersil goldtm aq 250。
18.在某一具体实施例中，所述液相色谱柱的内径为4.6mm。
19.在某一具体实施例中，所述液相色谱柱使用的流动相为7％甲醇，8％乙腈水溶液。
20.在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。
21.本发明所用试剂和原料均市售可得。
22.本发明的积极进步效果在于：
23.本发明采用最优的酸解试剂类型，解决了样品酸解程度不足导致的结果不准确。本发明的方法测到的neu5ac与neu5gc分别在0.0002～0.01g/l和0.0002～0.01g/l浓度范围内线性关系良好，线性相关系数均大于0.999，准确度范围分别在102％～106％与101％～111％之间，已达到解决酸解不充分现象或影响衍生化反应的现象，并有更好的准确度。
附图说明
24.图1为neu5ac与neu5gc标准曲线；图1的a为neu5gc在4m乙酸浓度时的标准曲线，图1的b为neu5ac在4m乙酸浓度时的标准曲线。
25.图2为乙酸条件下，neu5ac与neu5gc不同浓度的标准曲线叠图。
26.图3为修美乐单抗结果图谱。
27.图4为不同浓度(2～6m)乙酸处理条件下neu5ac与neu5gc标准曲线。
28.图5为三氟乙酸条件下，neu5ac与neu5gc不同浓度的标准曲线叠图。
具体实施方式
29.为对本发明的技术内容、特点与功效有更具体的了解，现结合具体实施例，对本发明的技术方案作进一步详细地描述，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。
30.下述实施例中数据均是通过两次平行实验后取平均值得出。
31.实施例1
32.本实施例中高效液相色谱法分析修美乐单抗生物类似药中唾液酸含量，首先利用乙酸处理释放唾液酸，再通过衍生化试剂标记，具体操作步骤如下：
33.步骤1)，取400μg样品至离心管中，再加入pbs补足至400μl。混匀后转移至超滤管，13000rpm，8
±
2℃离心10min。离心后，再用pbs补足体积至刻度400μl，混匀，13000rpm，8
±
2℃离心10min，重复此步骤4次后，加入pbs补足体积至刻度100μl，将超滤管中截留液转至新的离心管中。混匀后使用nanodrop测定蛋白浓度。
34.步骤2)，将25μl 4m的乙酸加入到25μl 1mg/ml标准品(neu5ac与neu5gc)/蛋白样品(修美乐)，混匀，80℃孵育2小时。
35.步骤3)，在上述体系中，加入50μl dmb溶液(1.5m乙酸，14mm连二亚硫酸钠，0.8m 2-巯基乙醇，13mm dmb)，混匀，黑暗条件下50℃孵育2.5h。冷却至室温装瓶待测。
36.步骤4)，制备流动相为7％甲醇，8％乙腈水溶液，安装色谱柱thermo hypersil goldtm aq 250*4.6mm。
37.步骤5)，设置仪器参数：激发波长373nm；发射波长448nm；柱温35
±
2℃；样品室温度8
±
2℃；进样体积20μl；运行模式采用等度模式；流速1.2ml/min；运行时间15minutes。
38.步骤6)，将步骤3)制备的样品上样到自动进样器中
39.步骤7)，处理结果后，使用公式计算唾液酸含量：
[0040][0041][0042]
表1 hplc法检测获得的唾液酸含量
[0043]
产品neu5gc(mol/mol蛋白)neu5ac(mol/mol蛋白)修美乐≤0.092≤0.097
[0044]
结果如图3所示，对样品和唾液酸标准品进行相同的前处理，比较色谱图，可知样品中的neu5gc和neu5ac保留时间与标准品保留时间一致，将样品的峰面积带入neu5gc标准曲线：
[0045]
y＝9.93
×
10
10
x-6.97
×
105[0046]
及neu5ac标准曲线：
[0047]
y＝9.93
×
10
10
x-5.07
×
105[0048]
计算得到样品中唾液酸的浓度，带入唾液酸含量计算公式，可得到表1中的结果。结合图3和表1，可以看出在实施例中，本发明成功地得到了单抗产品修美乐中的唾液酸含量。
[0049]
对比例1不同浓度的酸液对比
[0050]
比较不同浓度(2～6m)乙酸处理条件下，neu5gc与neu5ac的标准曲线的r2，r2越接近1，代表所对应的乙酸浓度有更好的唾液酸标准品线性。
[0051]
根据实施例1中的制备步骤，将换液后的蛋白样品分别和浓度为2m、3m、4m、5m、6m的乙酸混合、孵育，按照下述方法检测：
[0052]
步骤1)，将25μl 2m、3m、4m、5m、6m的乙酸分别加入到25μl 1mg/ml标准品，混匀，80℃孵育2小时。
[0053]
步骤2)，在上述体系中，分别加入50μl dmb溶液(1.5m乙酸，14mm连二亚硫酸钠，0.8m 2-巯基乙醇，13mm dmb)，混匀，黑暗条件下50℃孵育2.5h。冷却至室温装瓶待测。
[0054]
步骤3)，制备流动相为7％甲醇，8％乙腈水溶液，安装色谱柱thermo hypersil goldtm aq 250*4.6mm。
[0055]
步骤4)，设置仪器参数：激发波长373nm；发射波长448nm；柱温35
±
2℃；样品室温度8
±
2℃；进样体积20μl；运行模式采用等度模式；流速1.2ml/min；运行时间15minutes。
[0056]
步骤5)，将步骤4)制备的样品上样到自动进样器中。
[0057]
根据图1(图1的a和图1的b)和图4(图4的a-图4的h)所示，虽然在3～5m浓度乙酸条
件下，neu5gc与neu5ac的标准曲线的r2均接近1，但是在2m浓度乙酸条件下，neu5gc与neu5ac的标准曲线的r2分别为0.977和0.975，小于0.99；在6m浓度乙酸条件下，neu5gc与neu5ac的标准曲线的r2分别为0.977和0.974，小于0.99。由此可见，过高或过低的乙酸浓度，会对标准品的线性产生影响，因此最优的处理条件为4m乙酸，neu5gc与neu5ac的标准曲线的r2均为1.00。
[0058]
对比例2酸液的对比
[0059]
将实施例1的步骤(2)中的乙酸更换为三氟乙酸，其余条件同实施例1，对比三氟乙酸和乙酸的差距。
[0060]
结果如表2和表3所示。
[0061]
表2三氟乙酸处理条件下的回收率
[0062][0063]
*：由于检测时样品浓度稀释了一倍，因此实测浓度为理论加标浓度的约一半为正常值。
[0064]
表3乙酸处理下的回收率
[0065][0066]
*：由于检测时样品浓度稀释了一倍，因此实测浓度为理论加标浓度的约一半为正常值。
[0067]
根据图2及图5所示，在4m乙酸处理条件下，neu5gc与neu5ac两种唾液酸标准品分别在0.0002～0.01g/l和0.0002～0.01g/l浓度范围内的线性均良好，优于三氟乙酸。
[0068]
根据表2和表3可知，在4m乙酸和4m三氟乙酸处理条件下，对于相同的样品，加入不同浓度的标准品，然后分析得到加入不同浓度标准品的回收率。结果见上表，比较发现，三氟乙酸处理条件下，平均回收率为111％，而乙酸处理条件下，平均回收率为105％。由此可知，乙酸处理条件可以得到更好的准确度结果，提高了检测结果的准确性。