一种显微观测衬板的制作方法

1.本发明涉及生物样本冷冻装置领域，具体地涉及一种生物样本玻璃化冷冻载体及其配套使用的显微观测衬板。


背景技术：

2.在人工辅助生殖技术中，将卵子或体外受精后得到的多个胚胎放入-196℃的液氮冻存，以供短期或长期的择期胚胎移植，成为了解决不孕不育的常用方法。玻璃化冷冻生物样本其临床意义在于在冷却剂如液氮中可长期存储，经冷却剂冻存的胚胎或细胞会停止发育并可保存数十年，第二是冻存生物样本在复温后，可复活生物学意义上的胚胎或细胞。
3.当常温材料冻存时，常温材料与极低温冷却剂，如液氮相遇时产生的莱顿弗罗斯特效应，会在冻存材料表面形成阻隔热传导汽膜，并减慢所需冻存材料的降温速度，冷冻过程中生物样本内冰晶化的形成，导致复苏后的生物样本复活率的降低，因此，追求快速冷冻的玻璃化冷冻技术得到发展。
4.目前，为了加快冷冻速率，国内外玻璃化冷冻载体较普遍的都采用开放式，有拉细麦管法、石英毛细管法、cryoloop法、cryotip法等，即将载有样本的冷冻载体直接浸入液氮中。2005年，kuwayama提出了通过最小化溶液体积提高冷却速率的新方法
‑‑
cryotop法等，所包涵的冷冻保护液容量最小化，即将载有样本的冷冻载体直接浸入液氮中。但由于生物样本与液氮直接接触，不能提供生物样本储存的无菌环境，存在交叉污染风险，且液氮对细胞的直接毒性作用也未可预测(covo a,domingo j,perez s,et al.vitrification:an effective new approach to oocyte banking and preserving fertility in cancer patients[j].clin transl oncol,2008,10(5):268-273；封闭式麦管玻璃化冷冻法用于人早期胚胎冷冻效果观察，山东医药2010年底50卷第15期；)，而新近的研究更表明，液氮中的低分子化合物对生物样本具有毒性(y panagiotidis,p vanderzwalmen,yprapas,e kasapi，et，al open versus closed vitrification of blastocysts from an oocyte-donation programme:a prospective randomized study.reproductive biomedicine online,in press,uncorrected proof,mar2013)。专利申请(200710192245.9)公开了一种阻止外源病源性物质污染生物样本的密封型玻璃化冷冻装置，但尽管做到了与冷却剂隔离的封闭体系，但由于需要热塑封闭等各种步骤，该类型的冷冻载体的操作仍显复杂。
[0005]
再者，将冷冻装置置于显微装置下，与培养皿一同观测时，由于冷冻装置本身的高度，无法与培养皿保持在同一水平面上，使得操作人员在切换观察冷冻装置样本和培养皿样本时，需要不断地调节焦距。
[0006]
因此，本领域迫切需要开发一种玻璃化冷冻效率高、操作方便、安全无毒且体积尽可能微小的生物样本密闭式冷冻装置。


技术实现要素：

[0007]
本技术的目的在于提供一种生物样本玻璃化冷冻载体，操作方便，并且体积进一
步微型化，热容量减小，冷冻效率更高。
[0008]
本技术的一方面，公开了一种生物样本玻璃化冷冻载体，包括：本体和密封帽，其中所述本体的近端设置有冷冻样本放置区，所述冷冻样本放置区和所述密封帽底部形成的相互密封的一腔室，所述冷冻样本放置区的底部设置有冷冻样品放置平台，并且向本体内侧凹陷；
[0009]
所述本体设有冷却剂流通通道，且所述密封帽设有与所述冷却剂流通通道相对应的导流孔，使得进行生物样本冷冻时，在所述通道内流通的冷却剂与所述冷冻样本放置区的外表面接触并冷却所述冷冻样本放置区内的生物样本。
[0010]
在一个优选例中，所述冷冻样本放置区的上缘具有环状向外的凸起部，所述凸起部使得所述冷冻样本放置区嵌入所述本体时可固定在本体近端的顶部，并且与所述本体紧密配合。
[0011]
在一个优选例中，所述本体还包括啮合部，所述啮合部位于本体的远端；当所述密封帽与所述本体配合时，所述啮合部用于和密封帽密封啮合，并且使得所述本体完全位于所述密封帽形成的空腔内。
[0012]
在一个优选例中，所述通道包括位于所述啮合部的远端开口以及设于所述本体侧壁的侧开口，且所述的远端开口和所述的侧开口相连通。
[0013]
在一个优选例中，所述远端的内侧壁还具有辅助工装，所述辅助工装用于将所述本体与外部显示仪器部件配合并固定。
[0014]
在一个优选例中，所述的生物样本放置平台直径1-15mm，和/或
[0015]
所述冷冻样本放置区的凹陷深度为0.5-5mm。
[0016]
在一个优选例中，所述载体在放置生物样本后的冷冻速率至少为30000-50000℃/分钟。
[0017]
在一个优选例中，所述本体的材料选自下组：钛合金、铝镁合金、不锈钢；和/或
[0018]
所述密封帽的材料选自高分子材料。
[0019]
在一个优选例中，所述密封帽的顶部设置有持握部，所述持握部设置在密封帽的导流孔的同侧，高度为4-10mm。
[0020]
在一个优选例中，所述密封帽还包括样本信息标记区，所述样本信息标记区至少包括所述密封帽的顶部和一个侧壁，并且适配于粘贴尺寸为a
×
b的标签，其中，6mm≤a≤28mm，6mm≤b≤10mm。
[0021]
本技术的另一方面，公开了一种显微观测衬板，包括:培养皿放置区和冷冻生物样本载体放置区,其中
[0022]
所述培养皿放置区设置有一个或多个培养皿放置位；
[0023]
所述冷冻生物样本载体放置区设置有一个或多个载体放置位；
[0024]
所述培养皿放置位的高度、所述载体放置位的高度相对于显微镜形成相同的调焦距离。
[0025]
在一个优选例中，所述培养皿放置位具有适配于培养皿放置的凹形槽位。
[0026]
在一个优选例中，所述培养皿放置位是中空贯穿的。
[0027]
在一个优选例中，所述载体放置位是包括上部和下部的立柱，所述立柱与玻璃化冷冻载体本体的开口适配。
[0028]
在一个优选例中，所述立柱上部为圆柱体，下部为立方柱体，与玻璃化冷冻载体本体的辅助工装适配。
[0029]
在一个优选例中，所述培养皿放置区和所述冷冻生物样本载体放置区高起的厚度不同,其中
[0030]
所述培养皿放置区的厚度范围为1-3mm；
[0031]
所述冷冻生物样本载体放置区的厚度小于培养皿放置区，厚度范围为0.08-0.20mm。
[0032]
在一个优选例中，所述培养皿放置位和所述载体放置位被配置为使得当装载胚胎、细胞的培养皿放置于凹形槽位上、同时载体适配于立柱上时，培养皿与载体的冷冻样本放置平台在垂直方向上的公差小于0.05mm。
[0033]
在一个优选例中，所述培养皿放置位的个数范围、所述载体放置位的个数范围分别为1-12个。
[0034]
在一个优选例中，所述凹形槽位的直径范围为6cm-12cm。
[0035]
在一个优选例中，显微观测衬板的材料选自高透光材料。本技术至少具有以下技术效果：
[0036]
1.密封保存生物样本，安全无毒：本实用新型的载体用于将生物样本与冷冻液体隔离、密闭保存，安全无污染，减少了冷冻液体对生物样本的潜在毒性危险。
[0037]
2.冷冻速率快，达到高效玻璃化冷冻：采用本实用新型载体可以达到30000-100000℃/分钟的冷冻速率，从而起到快速玻璃化冷冻并避免生物样本冷冻过程中受冰晶破坏的影响。
[0038]
3.操作方便：本实用新型载体采用螺纹紧固或套接、扣接式紧固等密封方式，操作时仅需将生物样本放置于放置区平台后拧紧密封帽，即可放入液氮储存，代替了传统热塑密封的复杂程序。
[0039]
4.安全有效：由于本装置的特殊结构及操作简易，在样本升温后取出如同样本装载一般方便，复温后不易发生生物样本的丢失。
[0040]
5.密封结构进一步优化：本实用新型依靠冷冻样本放置区本身与密封帽实现完全的密封，无需进一步设置例如密封圈等密封部件。
[0041]
6.体积微小：本体需要能够与外部器械或显微仪器部件安装适配，本实用新型载体的本体的辅助工装(即方孔)设置在本体远端的内侧壁上，本体的厚度进一步缩小至少5mm，本体高度缩短，本体的体积更加微小，相比将扳手工装设置在外部的上一代产品相比，其体积和高度各自减少了至少40％，因而其热容量进一步减小，冷冻速率提高。
[0042]
7.样本信息标记区扩大：样本信息标记区位于密封帽上，与导流孔、持握部位置错开，包括密封帽的顶部和至少一个侧壁，也可以包括顶部和两个侧壁，标记区域进一步伸长，可粘贴包括正方形(例如6mmx6mm的二维码)至长条形(28mmx6mm)的各类标签。
[0043]
8.提供配套载体使用的显微观测衬板，使得需要观测的培养皿样本被抬高至与载体样本放置区同样的高度，易于使用同一焦距观测，无需为不同区域观察重新调节显微镜焦距，省时省力。
附图说明
[0044]
图1是根据本技术的载体的右视剖视图；
[0045]
图2是根据本技术的载体的正视剖视图；
[0046]
图3是根据本技术的载体的俯视图；
[0047]
图4是根据本技术的载体的仰视图；
[0048]
图5是根据本技术的载体的立体轴测图；
[0049]
图6是根据本技术的一个实施例的显微观测衬板的俯视图；
[0050]
图7是根据本技术的一个实施例的显微观测衬板的剖面图；
[0051]
图8是根据本技术的一个实施例的显微观测衬板的立体轴测图。
[0052]
附图标记说明:
[0053]
1-本体
[0054]
11-近端
[0055]
110-冷冻样本放置区
[0056]
111-冷冻样品放置平台
[0057]
112-凸部
[0058]
12-远端
[0059]
121-啮合部
[0060]
122-辅助工装
[0061]
14-侧孔
[0062]
15-冷冻液体流通通道
[0063]
2-密封帽
[0064]
201-导流孔
[0065]
21-持握部
[0066]
22-样本信息标记区
[0067]
81-培养皿放置区
[0068]
811-培养皿放置位
[0069]
8110-凹形槽位
[0070]
82-冷冻生物样本载体放置区
[0071]
821-立柱
具体实施方式
[0072]
本发明人经过广泛而深入的研究，提供了一种用于生物样品密闭冷冻保存的载体。试验证明，本发明载体的所设计的冷却剂流通通道、冷却剂导流孔及生物样本放置平台在使生物样本与冷冻液密闭隔离的同时，仍能达到高效的玻璃化冷冻效果，复温后胚胎成活率高，且操作简单。在此基础上，完成了本实用新型。
[0073]
冷冻样品放置平台及放置区
[0074]
本实用新型是一个载体装配体，装配体包括两个部件：本体和密封帽，将装配时本体与密封帽接触的一端定义为“近端”，而另一端则称为“远端”。本体近端设置有一冷冻样本放置区，该冷冻样本放置区是碗型的，上缘具有环状向外的凸起部，凸起部围绕平台外径
缘设置2-4个凸出，凸出接触本体近端通道口，凸起部使得冷冻样本放置区嵌入本体时可固定在本体近端的顶部，并且与本体紧密配合；放置区向着本体内侧凹陷，形成一空腔，空腔的深度为2mm-10mm，空腔底部即为冷冻样本放置平台。冷冻样本放置区是可拆卸的，可通过各种常规的固定连接方式与本体近端顶面固定。冷冻样本放置区与密封帽的内底平面共同形成的一密闭空间，无需密封部件(例如，密封圈)即可实现密封,保障冷冻样本放置区有效隔离生物样本与冷却剂的接触，从而防止冷冻剂中的未知病原体等毒性物质对生物样本的交叉污染与毒害。
[0075]
本实用新型冷冻样本放置区的材料为无毒且可以耐受骤冷与骤热温度变化的医用高分子材料。通常，可用于本实用新型冷冻样品放置平台的材料包括pe、pet、pp。
[0076]
本实用新型的本体材料选自钛合金、铝镁合金、不锈钢。密封帽的材料为医用高分子材料。
[0077]
本实用新型冷冻样品放置平台直径1-15mm，较佳地，为3-12mm，更佳的为4-10mm；最佳地为6-8mm；和/或载体平台的厚度为0.06-0.0.20mm，较佳地，为0.07-0.12mm，更佳地0.08-0.10mm；冷冻样本放置区高度为0.5-5mm，优选的为0.8-2mm。
[0078]
此外，本实用新型生物样本玻璃化冷冻载体的尺寸可以根据所需冷冻的生物样本具体大小及多余冷冻保护剂的移除的操作而改变。
[0079]
冷冻液流通通道
[0080]
可用于本实用新型的冷却剂流通通道包括以下部分：
[0081]
(a)位于本体远端的远端开口；
[0082]
(b)位于本体近端的侧开口；
[0083]
(c)位于密封帽侧壁、与本体近端侧开口位置相对应的导流孔。
[0084]
其中，远端开口、侧开口经由本体中心内部相互连通，且对应于位于所述的密封帽侧壁的导流孔。所述的侧开口位于本体近端，更佳地，所述的侧开口紧贴于冷冻样品放置平台。
[0085]
通常，所述的侧开口和导流孔分别至少为两个，更佳地为四个或更多。
[0086]
在本实用新型中，当密封帽与本体相互闭合密封后，置入冷冻液体中，冷冻液体可经冷冻液流通通道由远端开口-侧开口-导流孔循环交流，如此，冷却剂流动通道可降低leidenfrost效应，使位于冷冻放置平台的组织样本迅速冷却。
[0087]
在本实用新型中，所述本体侧开口直径1-5mm，或3
×
5mm椭圆横向孔，所述密封帽导流孔直径为2-7mm或3
×
6mm的椭圆横向孔。
[0088]
可用于本实用新型的远端开口或本体侧开口或导流孔的立体形状没有特别限制，可以为任何有利于冷冻剂流通的、互相对应匹配的形状，通常，本实用新型中各开口或导流孔的立体形状呈阶梯状、去顶圆柱状。
[0089]
啮合部与辅助工装
[0090]
本实用新型的本体在远端设置有啮合部，啮合部为外螺纹，密封帽的下部具有与之适配的内螺纹。本实用新型中，啮合部的外螺纹公称直径可以为m4至m12，优选地为t形m8-m10外螺纹。当密封帽与本体配合时，啮合部用于和密封帽密封啮合，并且使得本体完全位于密封帽形成的空腔内，即密封帽可以完全地遮盖本体。
[0091]
本体的远端的内侧壁还具有辅助工装。具体地，辅助工装是一规则多边形孔槽，构
成冷冻液流通通道的一部分。由于中通贯穿，光可从该辅助工装通过，该辅助工装可与外部显微仪器或配套部件的使用。例如，当载体中装有生物样本时，将其置于显微镜下观察，光可从辅助工装中穿过，用于样本的观察。在部分实施例中，辅助工装与一显微观测衬板的造型互相适配，将其扣合在显微观测衬板的立柱上，可将其固定；而后将密封帽拧到本体上，在螺旋拧紧时，辅助工装固定了其位置，不造成滑动或偏移，密封帽可封闭到本体上，组成载体。将密封帽螺旋拧松时，辅助工装也固定其位置，不造成滑动或偏移，打开密封帽，从而解除封闭。优选地，孔槽是一方孔，方孔的截面边长2mm-8mm,优选地为6mm。
[0092]
显微观测衬板
[0093]
在一实施例中，还包括一显微观测衬板。衬板包括培养皿放置区和冷冻生物样本载体放置区。培养皿放置区的厚度为1-3mm，设置有一个或多个培养皿放置位。在培养皿放置位具有凹形槽位，凹形槽位适配于放置直径为6-12cm的培养皿，并且是中空贯穿的，用于使下方的显微镜光源的光通过。冷冻生物样本载体放置区厚度小于培养皿放置区，一般地为0.08mm-0.20mm；上设置有一个或多个立柱(即载体放置位)。立柱包括上部和下部，优选地上部为圆柱体，与载体本体上内凹的流道适配，下部为立方柱体，与本体内部流通通道的辅助工装适配并行使密封帽封闭或解封闭的功能。立方柱体的方孔截面边长2mm-8mm,优选地为6mm。立柱的高度为5-8mm。当包括胚胎细胞的培养皿放置于凹形槽位上、同时载体适配于立柱上时，培养皿与载体的冷冻样本放置平台在竖直方向上的公差小于0.05mm,即两个观测平面位于同一平面上。放置于显微观测衬板上的培养皿样本和冷冻生物样本可以用于显微镜的同一焦段观测。
[0094]
培养皿放置位的个数范围、载体放置位的个数范围分别为1-12个。优选地，培养皿放置位、载体放置位分别为4-6个。
[0095]
显微观测衬板使用高透光材料，例如ps,pc,pmma，将来自显微镜光源的光的损耗降到最低。
[0096]
密封帽与样本信息标记区
[0097]
本实用新型的密封帽具有持握部。持握部是一个在密封帽顶部突起的握杆，一体成型在所述密封帽上，高度为4-10mm，较佳地，为5-8mm；优选地设置在密封帽的导流孔的对侧，即相对的侧面(非相邻的侧面)。密封帽上另外两个相邻的侧面是空余的。在一优选例中，密封帽还包括样本信息标记区，样本信息标记区可以覆盖的是密封帽的空余部分，可以是长条形的，因而至少包括所述密封帽的顶部和一个侧壁，并且适配于粘贴尺寸为6mm
×
6mm至6mm
×
28mm的标签。
[0098]
快速冷冻生物样本的方法
[0099]
本实用新型中快速冷冻生物样本的方法，包括步骤：
[0100]
a)提供本实用新型的生物样本玻璃化冷冻载体，载体包括本体和密封帽，并且将所述的生物样本，放置于所述生物样本玻璃化冷冻载体的冷冻样本放置平台上，并在显微观察下移除多余冷冻保护液，从而形成含生物样本的载体本体；
[0101]
b)将步骤a)的含生物样本的载体本体与所述密封帽啮合并拧紧，从而形成含生物样本的密封载体；
[0102]
c)将步骤b)的含生物样本的密封载体在标记区进行样本信息标记或将打印有样本信息的标贴黏贴于密封帽的标记区；
[0103]
d)将步骤c)已标记有生物样本信息的密封载体置入冷却剂中保存。
[0104]
通常，所述的生物样本的密闭式玻璃化冷冻方法还包括对含有生物样本的密封载体进行标记；和/或对冷冻载体进行标记后放置标本并进行密封，从而得到已标记的密封载体。
[0105]
使用本实用新型玻璃化冷冻载体以及快速冷冻生物样本的方法，可达到30000-50000℃/分钟的冷却速率，更佳地，60000-100000℃/分钟的冷却速率，采用载体平台不同材料或大小而获得不同的冷却速率和生物样本玻璃化效果。
[0106]
此外，本实用新型中的载体在应用于实验或诊疗时，需进行消毒灭菌处理后使用，并在无菌环境下操作。
[0107]
材料与外观
[0108]
可用于制备本实用新型生物样本玻璃化冷冻载体的材料为无毒，且可以耐受骤冷与骤热温度变化的高分子材料或金属。
[0109]
在另一优选例中，所述的高分子材料包括pe(聚乙烯)、pp(聚丙烯)；pet(聚对苯二甲酸乙二醇酯)。
[0110]
在另一优选例中，所述的金属包括不锈钢、钛合金、铝镁合金。
[0111]
在另一优选例中，所述的高分子材料或金属为医用高分子材料或金属。
[0112]
在本实用新型中，本体与密封帽以相互扣接或螺纹旋转连接等各种活动套接方式相互扣合密封。通常，所述的扣接或螺纹旋转连接装置可以通过各种常规方法达到密封的效果，如改变螺纹的形态或角度等，保证密闭装置在骤冷骤热过程中的密闭自锁。
[0113]
本实用新型中的本体和密封帽的外观形状没有特别限制，可以为任何互相匹配的柱形外观，如圆柱形、六角柱形，从而便于操作者持握以及在放置胚胎、卵子等生物样本时载体的稳定。此外，本实用新型的本体和密封帽可以采用各种不同色彩，以区分载体用于不同生物样本、组织、细胞等的冻存标识。
[0114]
本实用新型的有益效果：
[0115]
1.密封保存生物样本，安全无毒：本实用新型载体及方法用于将生物样本与冷冻液体隔离、密闭保存，安全无污染，减少了冷冻液体对生物样本的潜在毒性危险以及假设液氮中病菌的交叉污染。
[0116]
2.冷冻速率快，达到高效玻璃化冷冻：采用本实用新型载体以及方法可以达到30000-50000℃/分钟的冷冻速率，视采用载体平台不同材料或大小而获得不同的冷却速率和生物样本玻璃化效果。从而起到快速玻璃化冷冻并避免生物样本冷冻过程中受冰晶破坏的影响。
[0117]
3.操作方便：本实用新型载体采用螺纹紧固或套接、扣接式紧固等密封方式，操作时仅需将生物样本放置于平台后拧紧密封帽，即可放入液氮储存，代替了传统热塑密封的复杂程序。
[0118]
4.安全有效：由于本装置的特殊结构及操作简易，在样本复温后取出如同样本装载一般方便，由于生物样本放置区为凹型，整个降温和升温过程不易发生生物样本的丢失。