一种检测脂代谢异常性高转移乳腺癌的免疫组化染色试剂盒及其应用

1.本发明涉及用于癌症的免疫化学实验物质的制备，具体是一种检测脂代谢异常性高转移乳腺癌的免疫组化染色试剂盒及其应用。


背景技术：

2.乳腺癌占全球女性新发癌症总数的24.5%，替代肺癌成为全球发病率第一的恶性肿瘤。肿瘤的复发和转移是导致患者死亡的直接原因。而脂肪酸异常代谢为肿瘤细胞提供了发生发展的基础，肿瘤的代谢重编程往往与肿瘤细胞的转移、侵袭等恶性行为高度相关。但如何能将脂代谢异常性高转移乳腺癌准确诊断并指导精准治疗目前还是空白，迫切需要研究解决。
3.固醇调节元件结合转录因子1（srebp1）为脂代谢的关键转录因子，受到pi3k-mtorc1-akt信号通路的调节。srebp1的活性可驱动肿瘤细胞的脂质积累，从而导致细胞代谢的重编程。srebp1在不同类型肿瘤中发挥的作用也不同，srebps可以调节3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶a（hmg-coa）还原酶的增加，增加前列腺癌对胆固醇的吸收，而间接促进前列腺癌的进展。srebp1 在结肠癌中高表达，其表达水平与结肠癌的侵袭、转移和血管生成有关。
4.脂肪酸合酶（fasn）是长链脂肪酸从头合成的关键酶，可以将多余的能量以甘油三酯形式储存在脂肪组织中。在肿瘤细胞中，90%的脂肪合成来源于fasn催化脂肪酸从头合成这一过程。fasn通过参与肿瘤细胞膜磷脂的合成、能量供给、合成重要的促癌脂质信号分子，促进肿瘤细胞增殖、侵袭转移等恶性生物学行为。fasn在结直肠癌、乳腺癌、肝癌、骨肉瘤、卵巢癌、肺癌、肾母细胞瘤等恶性肿瘤中的表达水平均显著升高，发挥促癌作用。
5.截止目前，srebp1和fasn在乳腺癌侵袭转移机制中发挥的作用未见报道。因此，检测srebp1和fasn的蛋白表达对脂代谢异常性高转移乳腺癌的诊断、治疗及预后预测都有重要作用。
6.目前为止，尚未由鉴定（筛选）脂代谢异常性高转移乳腺癌的试剂盒。


技术实现要素：

7.本发明就是为了解决脂代谢异常性高转移乳腺癌的诊断问题，而提供的一种检测脂代谢异常性高转移乳腺癌的免疫组化染色试剂盒及其应用。
8.鉴于srebp1编码固醇调节元件结合转录因子1蛋白，是直接激活胆固醇和脂肪酸中关键限速酶的主要转录因子。在高转移乳腺癌组织中高表达。脂肪酸合酶(fasn)是脂肪酸代谢重新编程的关键酶之一，能有效地延长脂肪酸合成16-羰基棕榈酸。fasn能促进肿瘤的增殖、侵袭、迁移和转移，从而加速肿瘤的发展。在高转移乳腺癌组织中高表达。
9.本发明是按以下技术方案实现的：一种检测脂代谢异常性高转移乳腺癌的免疫组化染色试剂盒，该试剂盒主要包括脂代谢相关转录因子srebp1和其下游分子脂肪酸合酶fasn的两种蛋白免疫组化抗体。
10.所述的一种检测脂代谢异常性高转移乳腺癌的免疫组化染色试剂盒，其所述两种蛋白免疫组化抗体分别是人源srebp1、fasn单克隆抗体。
11.srebp1、fasn两种蛋白免疫组化抗体在制备检测脂代谢异常性高转移乳腺癌的免疫组化染色试剂盒中的应用，其具有促癌作用的srebp1和fasn组合蛋白分子促进乳腺癌细胞的代谢重编程，在高转移的乳腺癌组织中其蛋白高表达，用于筛选出脂代谢异常性高转移乳腺癌。
12.所述的srebp1、fasn两种蛋白免疫组化抗体在制备检测脂代谢异常性高转移乳腺癌的免疫组化染色试剂盒中的应用，其组合蛋白分子srebp1、fasn的蛋白表达水平为脂代谢异常性高转移乳腺癌的诊断、治疗及预后预测提供极其重要的依据。
13.这样设计的本发明，通过联合检测srebp1、fasn的蛋白表达水平，对乳腺癌组织中的脂代谢水平进行检测分析，筛选出脂代谢异常性高转移乳腺癌，为肿瘤的精准诊治及预后预测提供重要依据。
附图说明
14.图1是高转移乳腺癌的单细胞转录组测序图谱及fasn随拟时间轨迹变化图；图2是高转移乳腺癌空间转录组测序图及fasn在高转移癌亚群中表达图；图3是７个impc亚群的共同高表达基因为srebf1示意图；图4是乳腺癌组织中srebp1和fasn的免疫组化检测图；图5是高转移乳腺癌中srebp1和fasn表达与预后之间的相关性示意图；图6是tcga数据库中srebf１和fasn表达量之间的相关性示意图。
具体实施方式
15.下面通过对高转移乳腺癌患者的肿瘤组织样本进行免疫组化检测的具体实例对本发明做进一步说明。
16.1）待检测肿瘤组织：将患者手术切除的肿瘤组织，按病理诊断用常规固定、取材、脱水、包埋、he染色，及连续切片（4~6微米厚/张）10张，用于脂代谢异常性高转移乳腺癌的免疫组化检测。参照图1，显示高转移乳腺癌患者肿瘤组织单细胞转录组测序的结果。图1是高转移乳腺癌的单细胞转录组测序图谱及fasn随拟时间轨迹变化图，图1（左）为高转移乳腺癌的单细胞转录图谱，包括8个细胞亚群，其中总体包括肿瘤细胞群、间质细胞群和免疫细胞群，而肿瘤细胞群中高转移乳腺癌细胞包括两个内部亚群。通过对高转移乳腺癌内部亚群的拟时间轨迹分析发现，fasn是高转移乳腺癌拟时间分化节点处的差异表达基因。据此，筛选出了fasn这一脂代谢关键分子。
17.图2是高转移乳腺癌空间转录组测序图及fasn在高转移癌亚群中表达图，显示在高转移乳腺癌的空间转录组测序中，鉴定出的高转移乳腺癌亚群中fasn的表达明显高于其他细胞亚群。与高转移乳腺癌的单细胞转录组测序结果对应，进一步确证了高转移乳腺癌中fasn发挥的重要作用。
18.图3是７个impc亚群的共同高表达基因为srebf1示意图，显示高，转移乳腺癌的空间转录组测序分析结果，7个高转移乳腺癌亚群共同高表达srebp1，srebp1恰好是fasn的上
游转录因子，可调节肿瘤中的脂代谢水平，从而对肿瘤的增殖、侵袭、转移等发挥作用。
19.2）脂代谢异常性高转移乳腺癌免疫组化检测试剂盒鉴于srebp1编码固醇调节元件结合转录因子1蛋白，是直接激活胆固醇和脂肪酸中关键限速酶的主要转录因子。在高转移乳腺癌组织中高表达。脂肪酸合酶(fasn)是脂肪酸代谢重新编程的关键酶之一，能有效地延长脂肪酸合成16-羰基棕榈酸。fasn能促进肿瘤的增殖、侵袭、迁移和转移，从而加速肿瘤的发展。在高转移乳腺癌组织中高表达。
20.该试剂盒包括：用于对肿瘤组织中的srebp1、fasn蛋白的表达程度进行检测的人源srebp1、fasn单克隆抗体、免疫组化检测试剂。其中，两种蛋白免疫组化的抗体的订购公司及货号分别为：srebp1 （abcam, ab191857）见基因序列表1、fasn（abcam, ab128870）见基因序列表2。
21.试剂盒中的免疫组化检测试剂包括：二甲苯、乙醇、3％h2o2、封闭用正常山羊血清工作液、抗体稀释液、生物素标记二抗工作液、dab显色试剂、辣根过氧化物酶标记链卵白素工作液、苏木素、pbs以及edta抗原修复液。
22.试剂盒的免疫组化检测步骤如下：（a）将制备好的石蜡玻片烤片（60℃，2小时），然后将玻片放于60℃温箱中过夜。
23.（b）二甲苯脱蜡，20分钟浸泡一次，共三次约60分钟，并用（100%、95%、80%、75%）梯度酒精水化；（c）蒸馏水将玻片洗3 次，再用pbs 缓冲液洗一次；（d）将装有适量edta抗原修复液的高压锅加热至修复液沸腾，将切片放入并确保全部组织被液体没过，将锅盖盖严，高压锅开始喷气时开始计时，2分30秒后停止加热，打开锅盖、室温放置、待切片自然冷却；（e）先用蒸馏水洗切片3次，再用pbs洗1次；（f) 玻片置入3%过氧化氢中浸泡10 min，以阻断内源性过氧化物酶的活性，清水洗净后再用pbs 洗1次；（g）取出切片并轻轻擦去组织周围水分，在组织上滴加山羊血清置于室温下封闭30 分钟，液体要盖过组织，避免出现非特异性染色；（h) 弃去血清，不用冲洗，用pbs为阴性对照，直接在组织上滴加稀释好的一抗，放于湿盒中，将湿盒放入4 ℃冰箱孵育过夜；（i）将湿盒取出后，置于室温复温约60分钟；（j）pbs冲洗3次，每次5分钟；（k）用吸水纸轻轻擦去组织周围水分，在组织上滴加二抗后置于湿盒中37℃温箱孵育30 分钟；（l）pbs 冲洗3次，每次5分钟；（m）用吸水纸擦去组织周围水分，在组织上滴加辣根过氧化物酶后置于湿盒中37℃温箱孵育30分钟；（n）pbs 冲洗3次，每次5分钟；（o）用吸水纸擦去组织周围水分，在组织上滴加新鲜配制并避光保存的dab（1：20），置室温下显色1~3分钟，显微镜下观察显色结果，一旦阳性对照充分显色，即可用流水多次冲洗玻片以终止显色；
（p）苏木素复染至3分钟，清水将多余的苏木素洗净，玻片置于盐酸水溶液中数秒进行分化，自来水冲洗，再放入氨水中数秒返蓝，自来水冲洗干净；（q）按80%、95%、100%的酒精浓度梯度进行脱水，之后放入二甲苯中，每次10分钟，进行 2 次通透。之后用中性树胶进行封片。
24.3）联合检测评估srebp1、fasn两种蛋白的表达表1表1显示肿瘤细胞的srebp1、fasn蛋白的高表达与肿瘤细胞的淋巴结分期正相关。并显示被检测出有脂代谢异常特征的肿瘤组织，其转移能力强、患者的预后差。
25.srebp1蛋白免疫组化结果评估标准：肿瘤细胞核呈褐色的为表达阳性肿瘤细胞。染色强度和评分为深褐色（3分=强着色），深棕色（2分=中等强度着色），浅棕色（1分=弱着色），无着色（0分=无着色）；肿瘤的阳性细胞百分比分为》75%（4分），51~75％（3分），26~50%（2分），1%~25％（1分），0%（0分）。按强度x百分比进行统计学分析，两个分值乘积≥6，则srebp1蛋白表达定义为高表达；若两个分数乘积《6，则prdm16蛋白表达定义为低表达，图4是乳腺癌组织中srebp1和fasn的免疫组化检测图，参见图4，显示srebp1在高转移肿瘤细胞高表达。
26.fasn蛋白表达的免疫组化结果评估标准：肿瘤细胞质表达为阳性肿瘤细胞。肿瘤的阳性细胞染色强度分为深褐色（3分=强着色），深棕色（2分=中等强度着色），浅棕色（1分=弱着色），无着色（0分=无色）；肿瘤的阳性细胞百分比分为》 50％（3分），25~50%（2分），1~25%（1分），0%（0分）。按强度x百分比进行统计学分析，两个分值乘积》6，则fasn蛋白表达定义为是高表达组；两个分值乘积≤6，则fasn蛋白表达定义为低表达组，参见图4，显示fasn在高转移肿瘤细胞高表达。
27.4）筛选脂代谢异常性高转移乳腺癌srebp1、fasn两种蛋白免疫组化的抗体在制备检测脂代谢异常性高转移乳腺癌的免疫组化染色试剂盒中的应用，脂代谢关键分子srebp1和fasn在脂代谢异常性高转移乳腺癌的肿瘤细胞中蛋白高表达，从而筛选脂代谢异常性高转移乳腺癌。
28.表2
表2显示按以上两种蛋白表达的免疫组化结果评估标准，筛选出srebp1和fasn同时高表达的乳腺癌组织。
29.并显示被检测出有脂代谢异常特征的肿瘤组织，其转移能力强、患者的预后差。
30.图5是高转移乳腺癌中srebp1和fasn表达与预后之间的相关性示意图，图5显示脂代谢关键分子（srebp1、fasn）的蛋白表达水平与肿瘤患者生存时间的关系。srebp1、fasn蛋白表达越高，患者的生存时间越短。
31.图6是tcga数据库中srebf１和fasn表达量之间的相关性示意图，参见图6，tcga数据库显示，srebp1和fasn的表达呈显著正相关。
32.srebp1、fasn两种蛋白免疫组化的抗体在制备检测肿瘤转移种子细胞的免疫组化染色试剂盒中的应用，蛋白分子srebp1、fasn组合的蛋白表达水平为高转移肿瘤细胞的诊断、治疗及预后预测提供极其重要的依据。
33.根据上述实验结果，我们可以得出结论，利用本发明公开的免疫组化法联合检测srebp1、fasn的蛋白表达的试剂盒，应用于脂代谢异常性高转移乳腺癌的鉴定，即srebp1、fasn同时高表达的特性，可为临床制定精准治疗方案及患者的预后预测提供直接依据。