一种区分外泌体来源的方法与流程

1.本发明属于生物分析技术领域，尤其是涉及一种区分外泌体来源的方法。


背景技术：

2.外泌体行业作为一个新兴领域，需要多种方法对其进行鉴定表征，目前外泌体的鉴定手段主要有电子显微镜、纳米粒子追踪分析仪（nta）、western blot等，但是这些仪器设备昂贵，其检测方法与仪器操作过程复杂。这些表征技术虽然可以定性外泌体，但是不能分辨来源不同的外泌体。


技术实现要素：

3.为解决上述技术问题，本发明提供一种区分外泌体来源的方法。
4.本发明采用的技术方案是：一种区分外泌体来源的方法，对外泌体酶解形成含有不同肽段的混合物，对混合物进行肽图分析，与肽图图谱比较后可知其来源。
5.优选地，通过胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、胃蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、羧肽酶或蛋白酶k对外泌体酶解。
6.优选地，对外泌体样本进行浓缩或稀释，使样本蛋白浓度为1mg/ml，用1%碳酸氢铵溶液分别充分透析换液；按1:50（mg/mg）的比例加入胰蛋白酶，37℃水浴酶解16-24h；终止反应后，离心取上清液用于肽图分析。
7.优选地，按1:10的比例加入50%乙酸溶液终止反应。
8.优选地，通过色谱进行肽图分析。
9.优选地，以advancebio peptide map 为色谱柱，设定柱温为30℃；以0.1%三氟乙酸的水溶液作为流动相a液，以0.1%三氟乙酸的乙腈溶液作为流动相b液，流速为每分钟0.5ml，梯度洗脱70分钟，a液从100%-30%，b液从0-70%，检测波长为214nm。
10.优选地，先取已知来源的外泌体酶解后进行肽图分析，形成肽图图谱；再取未知来源的外泌体进行相同的处理，形成的肽图与肽图图谱进行比对，则能够得知其来源。
11.优选地，对比肽图与肽图图谱的特征峰。
12.使用区分外泌体来源的方法检测含有外泌体的药物或化妆品成分的应用。
13.本发明具有的优点和积极效果是：能够快速高效的对未知来源的外泌体进行鉴定，检测成本低廉，检测手段简单，且检测灵敏度高；本发明能够用于药物或化妆品成分检测，通过对外泌体来源的检测，准确判断其成分。
附图说明
14.图1是本发明实施例1中293细胞外泌体肽图；
图2是本发明实施例2中293细胞外泌体肽图重复图；图3是本发明实施例1中间充质干细胞外泌体肽图；图4是本发明实施例2中间充质干细胞外泌体肽图重复图；图5是本发明实施例1中牛奶外泌体肽图；图6是本发明实施例2中牛奶外泌体肽图重复图；图7 是本发明实施例2中293细胞外泌体、间充质干细胞外泌体和牛奶外泌体肽图图谱；图8是本发明实施例2中293细胞外泌体、间充质干细胞外泌体和牛奶外泌体肽图特征峰示意图；图9是本发明实施例3中未知样本肽图图谱；图10是本发明实施例4中牛奶外泌体肽图；图11是本发明实施例4中间充质干细胞外泌体肽图；图12是本发明实施例4中293细胞外泌体肽图；图13是本发明实施例3中293细胞外泌体、间充质干细胞外泌体和牛奶外泌体肽图图谱；图14是本发明实施例5中未知样本肽图图谱。
具体实施方式
15.下面结合附图对本发明的实施例做出说明。
16.本发明公开一种区分外泌体来源的方法，根据外泌体自身的特性，不同来源的外泌体本身含有的蛋白并不完全相同，经过酶解后，外泌体蛋白会形成含有多种肽段的混合物，根据不同来源外泌体酶解后形成的肽段会有部分差异，进行肽图分析，最后得到不同种类外泌体相应的肽图图谱，根据肽图图谱对外泌体来源进行鉴定分析。具体分析方法为，先取已知来源的外泌体酶解后进行肽图分析，形成肽图图谱；再取未知来源的外泌体进行相同的处理，形成的肽图与肽图图谱进行比对，对比肽图与肽图图谱的特征峰，根据肽图的特征峰情况，通过比对能够得知其来源。本发明某些实施例中可使用胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、胃蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、羧肽酶或蛋白酶k对外泌体进行酶解。
17.以通过胰蛋白酶对外泌体酶解为例；首先对外泌体样本进行浓缩或稀释，使样本蛋白浓度为1mg/ml，用1%碳酸氢铵溶液分别充分透析换液；再按1:50（mg/mg）的比例加入胰蛋白酶，37℃水浴酶解16-24h；按1:10的比例加入50%乙酸溶液终止反应，离心取上清液，得到的上清液通过色谱进行肽图分析。
18.本发明方法能够通过检测成品药物或成品化妆品中的成分，通过检测其中含有的外泌体的来源，能够对其成分来源做出判断。
19.下面结合附图对本发明方案做出说明，其中，未具体说明操作步骤的实验方法，均按照相应商品说明书进行，实施例中所用到的仪器、试剂、耗材如无特殊说明，均可从商业公司购买得到，其中，本发明某些实施例中所使用的293细胞为expi 293。
20.实施例1：1.1 外泌体酶解：分别取牛奶外泌体样本、间充质干细胞外泌体样本和293细胞外泌体样本，分别浓
缩样本，至蛋白浓度为1mg/ml，用1%碳酸氢铵溶液分别充分透析换液，按1:50（mg/mg）的比例加入胰蛋白酶溶液到供试品的溶液中，于37℃水浴中酶解-16-24h，然后按1:10的比例加入50%乙酸溶液终止反应，上下颠倒混匀，以每分钟12,000g
×
10min离心，取出上清液，备用。
21.1.2 肽图分析：色谱条件：仪器使用agilent 1260 液相色谱，色谱柱选择advancebio peptide map，柱温设定为30℃，备用样品放在4℃的样品管理器中；以0.1%三氟乙酸的水溶液作为流动相a液，以0.1%三氟乙酸的乙腈溶液作为流动相b液，流速为每分钟0.5ml，梯度洗脱70分钟（a液从100%-30%，b液从0-70%），检测波长为214nm。
22.分别得到如图1所示的293细胞外泌体肽图，如图3所示的间充质干细胞外泌体肽图和如图5所示的牛奶外泌体肽图图谱。
23.实施例2：根据上述实验过程另取牛奶外泌体样本、间充质干细胞外泌体样本和293细胞外泌体样本进行重复实验，得到的图谱制成重复图，分别如图2、图4和图6所示，通过比对能够看出，这几种外泌体的肽图图谱形状和图谱重复性均非常好，适合用作肽图图谱。
24.图7为293细胞外泌体、间充质干细胞外泌体和牛奶外泌体肽图图谱对比结果，能够看出不同来源的外泌体肽图具有明显差异；如图8所示是293细胞外泌体、间充质干细胞外泌体和牛奶外泌体肽图特征峰，不同来源的外泌体其特征峰所在位置也是不同的。
25.实施例3：取一未知样品，按照实施例1中步骤依次进行酶解和肽图分析，测得结果如图9所示。通过比对能够看出，图9中48min有一个和已知牛奶外泌体肽图（图5）一样的峰，其他位置没有特征峰，所以可知未知样本为牛奶外泌体。
26.实施例4：4.1 外泌体酶解：分别取牛奶外泌体样本、间充质干细胞外泌体样本和293细胞外泌体样本，分别浓缩样本，至蛋白浓度为1mg/ml，加蛋白酶k（蛋白酶k的工作浓度为50μg/ml-100μg/ml）到供试品的溶液中，于37℃水浴中酶解1h，上下颠倒混匀，以每分钟12,000g
×
10min离心，取出上清液，备用。
27.4.2 肽图分析：色谱条件：仪器使用agilent 1260 液相色谱，色谱柱选择advancebio peptide map，柱温设定为30℃，备用样品放在4℃的样品管理器中；以0.1%三氟乙酸的水溶液作为流动相a液，以0.1%三氟乙酸的乙腈溶液作为流动相b液，流速为每分钟0.5ml，梯度洗脱70分钟（a液从100%-30%，b液从0-70%），检测波长为214nm。
28.分别得到如图10所示的milk外泌体肽图，如图11所示的间充质干细胞外泌体肽图和如图12所示的293细胞外泌体肽图图谱。
29.图13为293细胞外泌体、间充质干细胞外泌体和牛奶外泌体肽图图谱对比结果，能够看出不同来源的外泌体肽图具有明显差异。
30.实施例5：取一未知样品，按照实施例4中步骤依次进行酶解和肽图分析，测得结果如图14所
示。通过比对能够看出，图14中，在10-20min之间有4个峰和已知间充质干细胞外泌体肽图（图11）一样的峰，其他位置没有特征峰，所以可知未知样本为间充质干细胞外泌体。
31.以上对本发明的实施例进行了详细说明，但所述内容仅为本发明的较佳实施例，不能被认为用于限定本发明的实施范围。凡依本发明申请范围所作的均等变化与改进等，均应仍归属于本发明的专利涵盖范围之内。