一种基于核酸适配体修饰的石墨烯电子生物传感器、制备方法及其应用

1.本发明属于体外诊断技术领域，具体为一种基于核酸适配体修饰的石墨烯电子生物传感器、制备方法及其应用。


背景技术：

2.自石墨烯在实验室被发现，其作为传感器的应用一直被研究中。石墨烯可以被金属电极连接，成为晶体管或者电子传感器形式。在这些电子器件中，二维材料沟道暴露在外部，当有外部蛋白，多肽，激素小分子与其表面修饰的核酸适配体特异性结合的时候，基于二维沟道材料表面电荷的变化和核酸适配体构象的改变，石墨烯沟道的a.)电子迁移率 和/或 b.)阈值电压产生影响，这些电子器件的电学信号如电阻率/电导率/跨导等发生变化。用这种方法，可以通过对电子信号的测量来量化二维材料表面生化分子的变化和性质。
3.在实验室里，通常利用机械剥离单晶形成的不规则二维材料，作为沟道，沉积不规则的电极制作成电子器件，然后用科研电表进行单个器件的测量。这种方法速度慢，难以商业使用。


技术实现要素：

4.针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种基于核酸适配体修饰的石墨烯电子生物传感器、制备方法及其应用，本发明把规则的二维电子器件高度集成，并集中测量；本发明利用核酸适配体作为捕获分子，能快速检测临床样本中类固醇激素分子浓度。
5.本发明的技术方案具体介绍如下。本发明提供一种基于核酸适配体修饰的用于激素类分子检测的石墨烯电子生物传感器的制备方法，其包括：在硅/二氧化硅衬底上沉积金属电极；在沉积了金属电极的衬底上转移石墨烯并在特定位置刻蚀出沟道；根据待检测类固醇激素分子来选择和制备核酸适配体；将核酸适配体，聚乙二醇和乙醇胺，通过中间连接体依次化学修饰到石墨烯沟道材料表面；制备的具体步骤如下：（1）在衬底上沉积金属电极的粘附层以及金属电极，作为源极，漏极和栅极；（2）在沉积金属的衬底上用湿法转移方法转移石墨烯，通过光刻和刻蚀等半导体工艺方法，在衬底的特定位置固定石墨烯，形成石墨烯沟道；（3）将上述器件置于管式炉，在保护性气体下进行退火，去除杂质；（4）通过指数富集系统进化配体方法，筛选并制备出能与目标类固醇激素分子特异性结合的核酸适配体；（5）通过非共价键-pi-pi堆叠方法，将溶解在有机溶剂中的中间连接体修饰到石墨烯沟道表面；（6）将5’端修饰了氨基-nh2的核酸适配体溶解在缓冲液中，通过与中间连接体的官能团如羧基-cooh脱水键合，化学修饰到石墨烯沟道表面，作为捕获分子；
（7）将一端修饰了氨基-nh2的聚乙二醇，通过与中间连接体的官能团如羧基-cooh脱水键合，修饰到石墨烯沟道表面；（8）用乙醇胺的氨基端与剩余未被修饰的中间连接体的官能团键合，将中间连接体失活，以防止其他生物分子的非特异性结合，即制得基于核酸适配体修饰的石墨烯电子生物传感器。
6.本发明中，步骤（1）中，衬底可以为本领域常用耐高温衬底，如玻璃衬底、蓝宝石衬底、石英衬底、硅衬底、硅/二氧化硅等。
7.本发明中，步骤（1）中，所述金属电极的粘附层材料为ti、ni、cr、hf中的一种，或其中几种的组合。步骤（1）中，所述金属电极材料为ag、au或pt。
8.本发明中，步骤（1）中，所述金属粘附层以及金属电极采用光刻或者硬掩膜的方法形成。包括：在金属前驱体层上做出电极所需图形的掩膜；通过物理气相沉积、电子束蒸发或者磁控溅射淀积金属电极。优选的，所述掩膜可以使用光刻工艺，通过曝光、显影等手段将光刻胶曝光成所需的图形；或者使用硬掩膜手段，将含有电极图形的硬掩膜紧贴在前驱体层上。优选的，所述淀积金属方法可以使用物理气相沉积、电子束蒸发或者磁控溅射。
9.本发明中，步骤（2）中，所述石墨烯采用化学气相沉积形成，从其金属衬底剥离并转移至目标衬底。
10.本发明中，步骤（2）中，所述的石墨烯材料为一个原子层或以上厚度；优选的，石墨烯材料为1-10原子层。
11.本发明中，步骤（2）中，形成的石墨烯沟道为一个以上，和金属电极连接。
12.本发明中，步骤（1）和步骤（2）次序可以交换；金属电极可以在二维电子材料上方或者下方，与二维电子材料接触；不影响其他步骤。
13.本发明中，步骤（3）中，所述的保护性气体为一定比例的氢气/氩气混合气体（优选的，氢气：氩气的体积比=1：50 ~ 1：5）。
14.本发明中，步骤（4）中，所述的类固醇激素分子包括皮质醇，醛固酮，可的松，孕烯醇酮，脱氢表雄酮，脱氧皮质酮，17-羟基-孕酮，孕酮，雄烯二酮等肾上腺激素等。
15.本发明中，步骤（5）中，所述的中间连接体包括芘丁酸或1-芘丁酸琥珀酰亚胺酯等，所述的有机溶剂二甲基甲酰胺，二甲基亚砜，n-甲基吡咯烷酮，乙醇等。
16.本发明中，步骤（6）中，所述的缓冲液，包括磷酸盐缓冲液，三羟甲基氨基甲烷tris缓冲液，te(tris-edta)缓冲液等。
17.本发明中，步骤（7）中，所述的聚乙二醇包括不同的分子量大小，可以是一种分子量大小如10kda，也可以是多种分子量大小的组合如10kda + 20kda，5kda + 10kda + 20kda等。该聚合物的修饰可增加德拜长度，从而提高传感器检测的灵敏度。
18.本发明还提供一种根据上述制备方法制得的基于核酸适配体修饰的石墨烯电子生物传感器。
19.进一步的，本发明还提供一种上述石墨烯电子生物传感器在检测临床类固醇激素分子浓度中的应用。其通过场效应电学信号如电流，电压，或/和电容传感体外检测临床样本中类固醇激素分子的浓度；临床样本选自血清，血浆，唾液，尿液，汗液及其稀释液中的一种；类固醇激素分子选自皮质醇，醛固酮，可的松，孕烯醇酮，脱氢表雄酮，脱氧皮质酮，17-羟基-孕酮，孕酮和雄烯二酮中任一种。
20.和现有技术相比，本发明的有益效果在于：本发明中，核酸适配体作为捕获分子，可以特异性结合生物标志物-肾上腺类固醇激素分子。同时，石墨烯作为一种外界敏感材料，可以将生物识别进行传导，可用于包括液体在内的多种传感和体外诊断领域。
21.本发明的电子生物传感器可以快速直接检测临床样本，可以广泛地应用于各类疾病生物标志物的浓度检测。
22.根据本发明，可以大规模制造核酸适配体修饰的石墨烯电子生物传感器，用于体外快速检测临床样本中类固醇激素分子的浓度。
附图说明
23.图1是衬底上形成电极后的示意图。
24.图2是形成石墨烯电子沟道材料的示意图。
25.图3是形成石墨烯沟道表面修饰中间连接体的示意图。
26.图4是核酸适配体通过中间连接体，连接到石墨烯沟道表面的示意图。
27.图5是聚乙二醇通过中间连接体，连接到石墨烯沟道表面的示意图。
28.图6是乙醇胺通过中间连接体，连接到石墨烯沟道表面的示意图。
29.图7是待检测类固醇激素分子结合到核酸适配体的示意图。
30.图8是与类固醇激素分子-醛固酮，特异性结合的核酸适配体的二级结构的示意图。
31.图9是包括皮质醇，醛固酮，可的松，孕烯醇酮，脱氢表雄酮，脱氧皮质酮等在内的类固醇激素分子的化学结构的示意图。
32.图中标号：1001：硅衬底，1002：二氧化硅，1003：金属电极，1004：石墨烯二维（电子）材料，1005：中间连接体，1006：核酸适配体，1007：聚乙二醇，1008：乙醇胺，1009：类固醇激素分子。
具体实施方式
33.下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出，其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的材料或具有相同或类似功能的方法。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能解释为对本发明的限制。为了简化本发明的公开，下文中对特定例子的材料和方法进行描述。当然，它们仅仅为示例，并且目的不在于限制本发明。此外，本发明提供了的各种特定的工艺和材料的例子，但是本领域普通技术人员可以意识到其他工艺的可应用于性和/或其他材料的使用。
34.以下，根据所附附图针对本发明方式的一例进行说明。
35.如图1所示，本实施例中选用硅/二氧化硅晶元作为衬底，其中硅标识为1001，在硅上的二氧化硅标识为1002。利用光刻、刻蚀等半导体工艺在衬底上形成金属电极，金属电极标记为1003。金属电极包括1-5nm厚的粘附层材料，此例中为ti，和15-500nm厚的金属电极，材料为pt。一对金属电极接触石墨烯沟道，另外一对电极不接触石墨烯。图1整体标记为101。
36.如图2所示，在衬底上的特定位置沉积一层二维电子材料，标识为1004。在此列中
二维材料优选为石墨烯，石墨烯可以通过化学气相沉积的办法生长，然后转移到衬底上。此后再通过光刻、刻蚀等半导体工艺在衬底上形成沟道尺寸。在此例中，石墨烯沟道长宽在1微米-500微米之间。图2整体标记为102。
37.如图3所示，将溶解在有机溶剂中的中间连接体如1-芘丁酸琥珀酰亚胺酯，通过非共价键pi
ꢀ‑ꢀ
pi相互作用，连接到石墨烯沟道表面。中间连接体标记为1005。图3整体标记为103。
38.如图4所示，将5’端修饰氨基的核酸适配体，通过与中间连接体键合方式，连接到石墨烯沟道表面。核酸适配体标记为1006。图4整体标记为104。
39.如图5所示，将一端修饰氨基的聚乙二醇，通过与中间连接体键合方式，连接到石墨烯沟道表面。聚乙二醇标记为1007。图5整体标记为105。
40.如图6所示，将乙醇胺和剩余的中间连接体结合使其失活。乙醇胺标记为1008。图6整体标记为106。
41.如图7所示，临床样本中类固醇激素小分子如皮质醇，与核酸适配体特异性结合，引起电学信号变化，从而检测出其浓度。类固醇激素小分子标记为1009。图7整体标记为107。
42.如图8所示，与醛固酮特异性结合的核酸适配体的二级结构，其序列为5
’‑
ctc tcg gga cga cag ata gtt gtt ctt agc gat gtt cag cgt tgt cgt ccc-3’。核酸适配体标记为1006。图8整体标记为108。
43.如图9所示，包括皮质醇，醛固酮，可的松，孕烯醇酮，脱氢表雄酮，脱氧皮质酮等在内的类固醇激素小分子的化学结构。类固醇激素分子标记为1009。图9整体标记为109。
44.以上为完成该核酸适配体电子生物传感器的一种方法举例。