脱蜡液及其应用的制作方法

1.本发明涉及病理学技术领域，具体涉及一种脱蜡液及其应用。


背景技术：

2.苏木素(hematoxylin)和伊红(eosin)联合主要用于对细胞组织进行染色，简称he染色法，其为石蜡切片技术里常用的染色法之一。细胞中的细胞核是由酸性物质组成，它与碱性染料(苏木素)的亲和力较强；细胞浆则相反，它所含的碱性物质与酸性染料(伊红)的亲和力较大，因此细胞或组织切片经苏木素-伊红染色液染色后，细胞核被苏木素染成鲜明的蓝紫色，细胞浆、肌纤维、胶元纤维等呈不同程度的红色。he染色法是组织学、胚胎学、病理学教学与科研中最基本的染色方法，应用及其广泛。
3.苏木素-伊红染色法中的操作步骤，常见主要包括：脱蜡
‑‑‑
水化
‑‑‑
苏木素染色
‑‑‑
分化
‑‑‑
蓝化
‑‑‑
伊红染色
‑‑‑
脱水
‑‑‑
透明
‑‑‑
封片；待染色石蜡切片必须把切片上支撑组织的石蜡去除，这个过程称为脱蜡，脱蜡必须干净，否则会导致切片着色不均，点状或片状不着色，核浆对比不清。目前最常用的石蜡切片的脱蜡液主要是二甲苯，二甲苯也是病理制片过程中传统的组织透明剂，透明效果好，但易使组织收缩变脆、变硬，进而使切片困难。另外，二甲苯是一种高毒挥发性溶液，具有强烈刺激性气味的神经毒素，对长期接触的人员生理系统具有特殊伤害，产生靶器官效应，可出现眼及上呼吸道明显的刺激症状、眼结膜及咽充血、头晕、恶心、四肢无力、意识模糊等症状，对病理工作人员的身体健康产生严重危害；二甲苯挥发到空气中还易造成环境污染，且苯系物分解难度大，治理成本也更高。为此，寻找二甲苯的替代品已经成为当前亟待解决的问题。


技术实现要素：

4.基于此，有必要针对上述问题，提供一种脱蜡液，采用该脱蜡液进行组织脱蜡，可以完全避免使用二甲苯，从而避免技术人员身体受到伤害、减轻环境污染和节省后续清理二甲苯的开支。
5.一种脱蜡液，包括脱蜡液i和脱蜡液ii，所述脱蜡液i由质量份比为2～4:7的油酸甲酯：矿物油组成，所述脱蜡液ii由质量份比为2～4:1的乙醇：环己酮组成。
6.上述脱蜡液，由环保安全的成分组成，既能与乙醇相溶，又能溶解石蜡，其中油酸甲酯和矿物油组成的脱蜡液i，能够较好的溶解组织切片中的石蜡，具有较佳的脱蜡效果，且同时兼顾了残留成分能够较好的与脱蜡液ii中的环已酮和乙醇相溶，从而能够在不影响组织形态的前提下，被脱蜡液ii进行置换，而脱蜡液ii由乙醇和环已酮组成，其中的环己酮，一方面可避免乙醇对组织产生过度脱水的作用，另一方也能够与脱蜡液i的成分更为融合，而乙醇的存在增加了脱蜡液ii的极性，提高了脱蜡液ii整体成分与后续染色过程中的各成分的相融性，避免溶剂物化性质变化过快导致对组织的不利影响。最终，通过脱蜡液i和脱蜡液ii的配合，达到既环保，脱蜡效果与二甲苯相当、甚至更好的目的。
7.在其中一个实施例中，所述脱蜡液i由质量份比为3:7的油酸甲酯：矿物油组成，所
述脱蜡液ii由质量份比为3:1的乙醇：环己酮组成。
8.本发明还提供一种脱蜡液在病理学组织脱蜡染色中的应用。
9.在其中一个实施例中，所述染色为苏木素-伊红染色。
10.本发明还提供一种苏木素-伊红染色方法，包括以下步骤：
11.(1)取组织切片，采用上述的脱蜡液ⅰ和脱蜡液ⅱ，依次分别脱蜡，冲洗；
12.(2)苏木素染色，冲洗；
13.(3)盐酸酒精分化，冲洗；
14.(4)返蓝；
15.(5)伊红染色，冲洗；
16.(6)烤片：在65
±
5℃烤片1～3min；
17.(7)透明；
18.(8)封片。
19.上述染色方法整个过程不使用二甲苯，避免技术人员身体受到伤害、减轻环境污染和节约二甲苯净化成本。
20.并且，本发明采用上述脱蜡液进行组织染色，用时比传统方法中以二甲苯脱蜡时间短，全过程用时较短，有效提高苏木素-伊红染色(he染色)效率。同时，在透明处理之前，65
±
5℃烤片1～3min，加温可以取得理想的透明效果，而且相比二甲苯方法需要用润湿后封片，本发明由于采用了烤片过程的加温处理，之后可以直接封片，可以取得理想的透明效果和后续封片效果。
21.在传统方法中，由于透明和封片过程使用二甲苯，而二甲苯挥发快易引起组织干裂，该方法完全替代二甲苯，从而避免了组织干裂的问题。
22.在其中一些实施例中，所述步骤(1)中，所述脱蜡时间均为5
±
1min，脱蜡后直接采用水冲洗。在脱蜡后直接用水冲洗切片，省去了传统二甲苯方法脱蜡后的醇洗步骤，进一步缩短了组织的整体染色时间。
23.在其中一些实施例中，所述步骤(2)中苏木素染色5～6分钟；所述步骤(5)中伊红染色30秒～1分钟。具体可根据苏木素和伊红的染色情况，适当增加或减少染色时间。
24.在其中一些实施例中，所述步骤(3)中，所述盐酸酒精按照以下方法配制：将36wt％-38wt％浓盐酸与75％的乙醇按照体积比为0.5～1:99混合，即得。
25.在其中一些实施例中，所述步骤(4)中，采用氨水溶液进行返蓝，所述氨水溶液按照以下方法配制：将质量体积浓度为25％的氨水与水按照体积比为0.5～0.8:99混合，即得。可以理解的，也可以使用温水或自来水进行冲洗返蓝。
26.在其中一些实施例中，所述步骤(7)中，采用松节油进行透明处理1～3min；所述步骤(8)中，以中性树胶直接封片。
27.与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
28.本发明的脱蜡液，由环保安全成分组成，既能与乙醇相溶，又能溶解石蜡，脱蜡效果与二甲苯相当。
29.将上述脱蜡液应用于病理检测的组织脱蜡过程时，可以避免技术人员身体受到二甲苯的伤害、减轻环境污染和节约二甲苯净化成本。
30.本发明的苏木素-伊红染色方法，一方面采用了上述脱蜡液，具有绿色环保安全的
优势，另一方面改变了染色步骤，脱蜡后直接用水冲洗切片，省去了传统二甲苯方法脱蜡后的醇洗步骤，全过程用时较常规方法短，有效提高了苏木素-伊红染色(he染色)效率。
31.另外，传统方法在透明和封片过程使用二甲苯，因二甲苯挥发快易引起组织干裂，该方法完全替代二甲苯，当将此脱蜡液与无二甲苯封片处理过程配合使用，如本发明的苏木素-伊红染色方法，可以避免组织干裂的问题。
32.采用本发明的苏木素-伊红染色方法制备的病理切片，染色后在显微镜下能够观察到染色鲜明、结构清晰的细胞结构，与二甲苯脱蜡处理得到的结果基本一样，对医生阅片及诊断结果无影响，还避免了可能出现的组织干裂问题。
附图说明
33.图1中a、b分别为本发明实施例4方法与对比例1方法处理制得的阑尾组织标本切片的he染色样本(放大倍数：10
×
10)；
34.图2中a、b分别为本发明实施例4方法与对比例1方法处理制得的子宫肌瘤标本切片的he染色样本(放大倍数：10
×
10)；
35.图3中a、b分别为本发明实施例4方法与对比例1方法处理制得的子宫内膜标本切片的he染色样本(放大倍数：10
×
10)；
36.图4中a、b分别为本发明实施例4方法与对比例1方法处理制得的前列腺切除标本切片的he染色样本(放大倍数：10
×
10)；
37.图5中a、b、c分别为本发明实施例1-3中脱蜡液参照实施例4方法处理制得的甲状腺切除标本切片的he染色样本(放大倍数：10
×
10)；
38.图6中a、b分别为本发明实施例4方法与实施例5方法处理制得的甲状腺切除标本切片的he染色样本(放大倍数：10
×
10)；
39.图7中a、b分别为本发明实施例4方法与对比例2方法处理制得的甲状腺标本切片的he染色样本(放大倍数：10
×
10)。
具体实施方式
40.为了便于理解本发明，下面将参照相关附图对本发明进行更全面的描述。附图中给出了本发明的较佳实施例。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。
41.除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
42.以下实施例所用试剂，除有特别说明，均为市售可得；以下实施例所用方法，除有特别说明，均为常规方法可实现。
43.油酸甲酯：购自苏州丰倍生物科技有限公司，型号为1107。
44.矿物油：购自solarbiom(北京索莱宝科技有限公司)，型号为8040。
45.0.1％盐酸乙醇：：将36wt％-38wt％浓盐酸与75％的乙醇按照体积比为0.5～1:99
混合，即得。
46.0.5％氨水：将质量体积浓度为25％的氨水与水按照体积比为0.5～0.8:99混合，即得。
47.实施例1
48.一种脱蜡液，包括脱蜡液i由质量份比为3:7的油酸甲酯：矿物油组成，脱蜡液ii由质量份比为3:1的乙醇：环己酮组成。
49.实施例2
50.一种脱蜡液，包括脱蜡液i由质量份比为2:7的油酸甲酯：矿物油组成，脱蜡液ii由质量份比为2:1的乙醇：环己酮组成。
51.实施例3
52.一种脱蜡液，包括脱蜡液i由质量份比为4:7的油酸甲酯：矿物油组成，脱蜡液ii由质量份比为4:1的乙醇：环己酮组成。
53.实施例4
54.一种染色为苏木素-伊红染色方法，包括以下步骤：
55.(1)取组织切片，采用实施例1中脱蜡液i和脱蜡液ii，依次分别脱蜡5分钟，冲洗。
56.(2)苏木素染色5分钟，冲洗。
57.(3)0.1％盐酸乙醇分化2秒，冲洗，显微镜下观察。
58.(4)0.5％氨水返蓝2秒。
59.(5)伊红染色1分钟，冲洗。
60.(6)65℃烤箱烤片2分钟。
61.(7)松节油透明剂透明2分钟
62.(8)中性树胶封片。
63.实施例5
64.一种染色为苏木素-伊红染色方法，包括以下步骤：
65.(1)取组织切片，采用实施例1中脱蜡液i和脱蜡液ii，依次分别脱蜡5分钟，冲洗。
66.(2)苏木素染色5分钟，冲洗。
67.(3)0.1％盐酸乙醇分化2秒，冲洗，显微镜下观察。
68.(4)0.5％氨水返蓝2秒。
69.(5)伊红染色1分钟，冲洗。
70.(6)85％、95％、95％乙醇各脱水10秒，100％乙醇分三次脱水，每次1分钟。
71.(7)松节油透明剂透明2分钟
72.(8)中性树胶封片。
73.对比例1
74.一种染色为苏木素-伊红染色(he染色)方法，所述染色试剂为西格玛原材料配置试剂，乙醇等有机溶剂均为市售，染色方法包括以下步骤：
75.(1)取组织切片，二甲苯脱蜡液脱蜡三次，每次5分钟。
76.(2)100％乙醇洗涤两次，每次1分钟，95％、85％、75％乙醇各洗涤1分钟，然后水冲洗。
77.(3)苏木素染色5分钟，冲洗。
78.(4)0.1％盐酸酒精分化2秒(镜下控制)，冲洗。
79.(5)0.5％氨水返蓝2秒。
80.(6)伊红染色1分钟，冲洗。
81.(7)85％、95％、95％乙醇各脱水10秒，100％乙醇脱水三次，每次1分钟。
82.(8)二甲苯透明三次，每次1分钟。
83.(9)二甲苯润湿中性树胶封片。
84.对比例2
85.一种脱蜡液，与实施例1基本相同，区别在于，脱蜡液i由油酸甲酯组成，脱蜡液ii由乙醇组成。
86.实验例1
87.将采用实施例4方法制得的各组织病理切片的染色样本，与采用对比例1方法制得的各组织病理切片的染色样本，同时置于显微镜下观察，各实验观察结果如图1-4和下表1：
88.表1.与传统方法染色效果对比
89.[0090][0091]
由上表1可知，实施例1的脱蜡液应用在苏木素-伊红染色(he染色)的染色方法(实施例4)对组织染色效果与现有常规二甲苯进行苏木素-伊红染色(he染色)的染色方法(对比例1)的染色效果相当，对大标本、穿刺标本等标本的脱蜡、透明效果一致。
[0092]
但是与对比例1相比，实施例1中的方法未使用常规物质二甲苯，避免了技术人员身体受到损害以及环境污染问题，而且，经过改良的染色方法，染色时间短，能有效提高染色效率。本发明染色方法通过改变脱蜡的处理方式，以及染色后透明过程的处理方式，可以在保证染色结果准确的同时达到无添加二甲苯，同时染色时间缩短，有效提高染色效率的优点。
[0093]
实施例2
[0094]
本实施例对比实施例2和3中不同配方组成的脱蜡液，对染色效果的影响。具体采用实施例2和3的脱蜡液，参照实施例4的方法进行染色为苏木素-伊红染色。结果如图5和下表2所示。
[0095]
表2.脱蜡液成分比例调整对染色效果的影响
[0096][0097]
由上表2和图5可知，实施例2和3的脱蜡液应用在苏木素-伊红染色(he染色)的染色方法对组织染色效果，还能基本达到预期，能够用于后续病理检视，但由于调整了脱蜡液成分比例，其染色效果较实施例1的脱蜡液有所降低。
[0098]
实验例3
[0099]
将采用实施例4方法制得的各组织病理切片的染色样本，与采用实施例5方法制得的各组织病理切片的染色样本，同时置于显微镜下观察，各实验观察结果如图6及下表3：
[0100]
表3.对于染色步骤调整对染色效果的影响
[0101][0102]
由上表3和图6可知，实施例4的苏木素-伊红染色(he染色)方法，省略了以梯度乙醇脱水过程，伊红染色后直接烤片，对组织染色效果与现有常规梯度乙醇脱水的染色方法(实施例5)的染色效果相当，对大标本、穿刺标本等标本的脱蜡、透明效果一致。
[0103]
但节约了时间，降低了操作复杂性，具有较好的染色效果。
[0104]
实验例4
[0105]
将采用实施例4方法制得的各组织病理切片的染色样本，与采用对比例2脱蜡剂，
参照实施例4方法制得的各组织病理切片的染色样本，同时置于显微镜下观察，各实验观察结果如图7及下表4：
[0106]
表4.脱蜡液成分调整对染色效果的影响
[0107][0108][0109]
由上表4和图7可知，对比例2的脱蜡液应用在苏木素-伊红染色(he染色)方法中，对组织染色效果大大降低，已不能达到预期要，无法用于后续病理检视。
[0110]
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实
施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
[0111]
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。