一种荧光免疫检测心肌多联试剂盒及其制备方法与流程

1.本技术涉及生物监测技术领域，具体而言，涉及一种荧光免疫检测心肌多联试剂盒及其制备方法。


背景技术：

2.肌钙蛋白l(ctnl)，肌红蛋白(myo)和肌酸激酶同工酶(ck-mb)均与心肌细胞受损情况有关，超敏c反应蛋白(hscrp)是由肝脏合成的一种全身性炎症反应急性期的非特异性标志物，是心血管事件最强有力的预测因子之一。b型利钠肽(bnp)是由心房和心室内的心肌细胞在受到刺激时，分泌的一种氨基酸物质，是目前临床工作中，最常见的心衰生物标志物之一。d-二聚体是最简单的纤维蛋白降解产物，d-二聚体水平升高说明体内存在高凝状态和继发性的纤维蛋白溶解亢进。因此，对这几项指标的联合检测，对于心血管疾病的诊断、疗效评估和预后判断具有重要的意义。
3.目前市面上的一些荧光免疫检测心肌试剂盒多是承载单独检测卡，一次只能检测一种指标，多种指标需要分批检测，耗费人员多，所需时间长。


技术实现要素：

4.本技术的目的在于提供一种荧光免疫检测心肌多联试剂盒，可对肌钙蛋白l(ctnl)/肌红蛋白(myo)/肌酸激酶同工酶(ck-mb)/超敏c反应蛋白(hscrp)/b型利钠肽(bnp)/d－二聚体(d-dimer)联合快速精确检测，满足定性定量分析需求，该试剂盒配合仪器可同时对多个项目进行检测。
5.本技术的另一目的在于提供一种荧光免疫检测心肌多联试剂盒的制备方法，该制备方法工艺简单，成本低，检测结果精准可靠。
6.本技术解决其技术问题是采用以下技术方案来实现的。
7.一方面，本技术实施例提供一种荧光免疫检测心肌多联试剂盒，包括：外壳、层析缓冲液以及设置于上述外壳上的多个检测卡；
8.上述外壳内设置至少三个卡槽，上述检测卡与上述卡槽一一对应；
9.上述检测卡包括底板以及搭接于上述底板上的滤血垫、喷金垫、检测垫和吸水垫；
10.上述喷金垫上喷涂有荧光微球-抗体偶联结合物，上述检测垫上设有检测带和质控带，上述检测带包被预设抗体；上述质控带包被生物素化-bsa
11.上述抗体为：肌钙蛋白l抗体、肌红蛋白抗体、肌酸激酶同工酶抗体、超敏、c反应蛋白抗体、b型利钠肽抗体、d－二聚体抗体中的至少三种。
12.另一方面，本技术实施例提供一种荧光免疫检测心肌多联试剂盒的制备方法，其制备步骤如下：
13.对荧光微球进行活化，活化后在其表面偶联预设抗体，用链霉亲和素进行修饰得到荧光微球-抗体偶联结合物，将上述荧光微球-抗体偶联结合物喷涂在玻璃纤维膜上，干燥备用；
14.使用硝酸纤维素膜作为检测垫层析试纸，分别在膜条前端包被检测抗体作为检测带t线，在膜条后端包被生物素化-bsa作为质控带c线，抗体包被划线后干燥，烘烤备用；
15.将滤血垫、喷金垫、检测垫和吸水垫依次粘合在底板上，层压严实，随后将层压完成的膜条裁切得到检测卡，再将检测卡匹配到上述外壳上的卡槽内；
16.最后将制备的层析缓冲液和装配好的检测卡装盒，得到试剂盒。
17.相对于现有技术，本技术的实施例至少具有如下优点或有益效果：
18.1、本技术基于荧光免疫层析法，同时结合生物素-链霉亲和素标记技术，提供了一种高灵敏度待测抗原检测卡及其制备方法。生物素-链霉亲和素系统具有高特异性、高灵敏度、高稳定性的特点，使各种示踪免疫分析的特异性和灵敏度进一步提高。
19.2、本技术提供的一种荧光免疫检测心肌多联试剂盒可一次性检测心血管六项指标，耗时短，15min内即可获得检测结果，并获得各项指标的定量浓度，为心血管疾病的临床诊断提供数据支持。
附图说明
20.为了更清楚地说明本技术实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本技术的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
21.图1为本技术实施例一种荧光免疫检测心肌多联试剂盒的加样面；
22.图2为本技术实施例一种荧光免疫检测心肌多联试剂盒的结果观测面；
23.图3为本技术实施例荧光免疫检测心肌多联试剂盒中检测卡的结构示意图；
24.图标：100-外壳，110-加样区，120-混合槽，140-二维码，200-检测卡，201-滤血垫，202-喷金垫，203-检测垫，204-吸水垫，205-检测带，206-质控带，207-底板，210-标记区。
具体实施方式
25.为使本技术实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
26.需要说明的是，在不冲突的情况下，本技术中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。下面将参考具体实施例来详细说明本技术。
27.本技术提供了一种荧光免疫检测心肌多联试剂盒，包括：外壳、层析缓冲液以及设置于上述外壳上的多个检测卡；
28.上述外壳内设置至少三个卡槽，上述检测卡与上述卡槽一一对应；
29.上述检测卡包括底板以及搭接于上述底板上的滤血垫、喷金垫、检测垫和吸水垫；
30.上述喷金垫上喷涂有荧光微球-抗体偶联结合物，上述检测垫上设有检测带和质控带，上述检测带包被预设抗体；上述质控带包被生物素化-bsa；
31.上述抗体为：肌钙蛋白l抗体、肌红蛋白抗体、肌酸激酶同工酶抗体、超敏、c反应蛋白抗体、b型利钠肽抗体、d－二聚体抗体中的至少三种。
32.需要说明的是，在本技术的一些实施例中，实现上述检测目的时，其中荧光微球偶联复合物和质控带上包被的物质可以用以下方式进行等同替换：
[0033]ⅰ、荧光微球偶联复合物的抗体采用哺乳动物属种抗体，比如：鼠抗，质控带包被对应二抗，比如：兔抗鼠igg；
[0034]ⅱ、荧光微球偶联复合物的抗体采用非哺乳动物属种抗体，比如：igy，质控带包被对应二抗，比如：抗igy抗体；
[0035]ⅲ、荧光微球偶联复合物采用dnp(dinitrophenyl，1,3-二硝基苯)与抗体偶联微球，质控带包被bsa-dnp。
[0036]
本技术的多联试剂盒可一次性检测多种心血管相关指标，耗时短，操作简单，携带方便。
[0037]
在本技术的实施例中，上述外壳上设置有加样区，上述加样区与上述滤血垫连通，方便加样。
[0038]
在本技术的实施例中，上述外壳上设置有混合槽，方便将样品和层析缓冲液放入其中进行稀释。
[0039]
在本技术的实施例中，上述荧光微球-抗体偶联结合物中含有链霉亲和素。亲和素与酶标生物素可以形成亲和素-生物素-过氧化物酶复合物，再与生物素化的抗体接触时，可以将微量抗原的信号放大成千上万倍，以便于检测。
[0040]
在本技术的实施例中，上述层析缓冲液包括以下成分：0.1～0.2mm磷酸盐缓冲液，体积百分比为0.1～0.5％的吐温-20，体积百分比为0.1～0.2％的proclin300防腐剂。
[0041]
本技术还提供了荧光免疫检测心肌多联试剂盒的制备方法，其制备步骤如下：
[0042]
对荧光微球进行活化，活化后在其表面偶联预设抗体，用链霉亲和素进行修饰得到荧光微球-抗体偶联结合物，将上述荧光微球-抗体偶联结合物喷涂在玻璃纤维膜上，干燥备用；
[0043]
使用硝酸纤维素膜作为检测垫层析试纸，分别在膜条前端包被检测抗体作为检测带t线，在膜条后端包被生物素化-bsa作为质控带c线，抗体包被划线后干燥，烘烤备用；
[0044]
将滤血垫、喷金垫、检测垫和吸水垫依次粘合在底板上，层压严实，随后将层压完成的膜条裁切得到检测卡，再将检测卡匹配到上述外壳上的卡槽内；
[0045]
最后将制备的层析缓冲液和装配好的检测卡装盒，得到试剂盒。
[0046]
在本技术的实施例中，上述荧光微球-抗体偶联结合物的保存液成分包括：浓度为0.1～1mm的磷酸盐缓冲液，体积百分比为0.01～4％的吐温-20，体积百分比为0.05～0.1％的防腐剂和质量百分比为0.1～0.5％的蛋白。
[0047]
在本技术的实施例中，上述荧光微球-抗体偶联结合物喷涂浓度为1.0～1.2mg/ml，该范围是依据本生产车间常用标准设定。
[0048]
在本技术的实施例中，上述检测垫的干燥具体是在20～30℃下晾干1h，上述烘烤步骤具体是在37℃下烘烤12h，然后在60℃下烘烤72h。使检测垫充分干燥，减少微生物存活几率，延长保质时间。
[0049]
作为一个总的发明构思，本技术还提供一种荧光免疫检测心肌多联试剂盒在心血管指标浓度检测中的应用，该方法操作简单，耗时短，可一次性得到多个检测指标的定量浓度，可为医生的临床诊断提供支持。
[0050]
以下结合实施例对本技术的特征和性能作进一步的详细描述。
[0051]
实施例1
[0052]
本实施例提供一种荧光免疫检测心肌多联试剂盒及其制备方法。
[0053]
如图1所示，本实施例提供的一种荧光免疫检测心肌多联试剂盒中的检测试剂卡如图所示，包括：外壳100和6个检测不同指标的检测卡200，6个检测卡200分隔设置在外壳100的卡槽内；如图3所示，检测卡包括顺次搭接在底板207上的滤血垫201、喷金垫202、检测垫203和吸水垫204；喷金垫202喷涂荧光微球-抗体偶联结合物，荧光微球-抗体偶联结合物包括荧光微球，以及偶联在荧光微球上的链霉亲和素和预设抗体；检测垫203设有检测带205和质控带206，检测带205包被有待测指标的抗体，质控带206固定有生物素化-bsa。
[0054]
再参照图1，滤血垫201处还设有加样区110。滤血垫201与加样区110连通，方便加样。
[0055]
在本实施例中，外壳100设有两个用于混合样品的混合槽120。把样品和层析缓冲液加入混合槽120即可将其混匀。外壳100设有用于标记不同检测指标的标记区210。不同指标所用的抗体或抗原不同，为了避免混淆出现错误，在外壳100上设置颜色标记或文字标记，方便实验人员识别和加样。
[0056]
如图2所示，在本实施例中，外壳上还设有二维码140，通过扫描二维码可得到各项指标的标准曲线信息，根据标准曲线可计算各项指标的浓度，实现定量检测。需要说明的是，为了减小批内差异，不同批次的多联试剂盒的标准曲线不同，每制作一批多联试剂盒均需要制作六个指标的标准曲线。
[0057]
试剂盒的工作原理：取一定量的样本用层析缓冲液稀释后，将稀释后的层析液滴定加样区110，稀释后的层析液中混杂的血细胞会过滤在滤血垫201上，血清稀释液经毛细作用沿着纤维空隙流动，先经过喷金垫202与微球混合，并带着微球一块沿检测垫203的空隙流动，先后流经检测带205t线和质控带206c线，最后吸水垫204吸收。在整个血清稀释液的流动过程中，血清稀释液先与微球接触后产生第一次免疫反应，血清中的待检测抗原会与微球上检测抗体a结合；当混合有微球的血清稀释液流经检测带205t线时，结合在微球上的抗原与检测带205上的检测抗体b结合，这样与抗原结合的微球会被固定在检测带205t线上；随着混合有微球的血清稀释液流继续流动经过质控带206c线时，没有与抗原结合的微球通过链霉亲和素与质控带206c线上的生物素化-bsa产生第三次免疫反应，将微球结合在质控带c线。
[0058]
本实施例检测6项心肌指标，分别为：肌钙蛋白l(ctnl)，肌红蛋白(myo)，肌酸激酶同工酶(ck-mb)，超敏c反应蛋白(hscrp)，b型利钠肽(bnp)和d－二聚体(d-dimer)。
[0059]
另外，本实施例还提供一种荧光免疫检测心肌多联试剂盒的制备方法，包括以下步骤：
[0060]
一、滤血垫的制备：
[0061]
滤血垫处理液的配制(100ml)：0.6g三羟甲基氨基甲烷(tris-base)，0.1g二水合乙二胺四乙酸二钠(edta na2·
2h2o)，1g牛血清白蛋白(bsa)，0.5g酪蛋白，5g海藻糖，2.5ml 0.01m pbs缓冲液，0.8ml吐温-20。
[0062]
加入适量纯化水溶解，定容至100ml，再用稀盐酸或氢氧化钠调整ph至8.5，混匀。将一张滤血膜放在干净的托盘中，倒入滤血垫处理液，浸没滤血膜，于水平摇床震荡浸泡
30min，取出滤血膜，将处理完成的滤血膜置于37度生化培养箱中干燥24h，干燥完成后回收滤血膜备用。
[0063]
二、喷金垫的制备：
[0064]
(1)所需的试剂：
[0065]
①
聚苯乙烯荧光微球：1.05g/cm3，固体含量0.5％，直径160nm；
②
50mm edc(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐)10ml；
③
25mm sulfo-nhs(n-羟基丁二酰亚胺)，10ml；
④
0.1m mes buffer，ph 5.0；
⑤
10mm盐酸羟胺ph＝7.4；
⑥1×
pbs 10mm，ph＝7.4；
⑦
封闭液：1
×
pbs，0.05％tween-20，1％bsa；
⑧
层析缓冲液：1
×
pbs，0.1％tween-20，2mm edta，ph＝7.4，proclin300，0.1％；
⑨
微球保存液：1
×
pbs，0.02％tween-20，0.05％nan3，0.1％bsa；
⑩
抗体稀释液：1
×
pbs；
[0066]
(2)所需的设备：
[0067]
离心机；反转摇床；切条机；点膜仪；ph计；
[0068]
(3)制备流程：
[0069]
使用红色荧光微球作为荧光标志物，先使用edc、nhs对荧光微球活化表面羧基，活化后在荧光微球上偶联检测抗体。将偶联抗体后的微球喷涂在玻璃纤维膜(喷金垫)上干燥后备用。
[0070]
喷金垫处理液(100ml)的配制：称量1g bsa、6g蔗糖、1g pvp-k30加入超纯水中溶解，再量取1ml吐温20加入混合液中，搅拌均匀，定容至100ml；将玻璃纤维膜放在干净的托盘中，倒入处理液，于水平摇床震荡浸泡30min；将处理完成的喷金垫置于37℃生化培养箱中干燥24h，回收备用。
[0071]
将得到的荧光微球-抗体偶联结合物使用三维平面点膜喷金仪的喷金功能，设置参数，将荧光微球-抗体偶联结合物喷在处理好的喷金垫上；将喷好荧光微球-抗体偶联结合物的喷金垫放置在37℃的生化培养箱中烘烤24小时。将烤好的已喷金垫子装在铝箔袋中，加上干燥剂，放在4℃冰箱备用。
[0072]
其中荧光微球-抗体偶联结合物的制备详细步骤如下：
[0073]
首先，吸取500μl荧光微球于2ml离心管中，12000rpm
×
20min；弃上清，加入500μl 0.1m mes，使用200μl枪头悬浮纳米颗粒，超声振荡1min；12000rpm
×
20min；重复第2步；随后弃上清，向沉淀中加入400μl 0.1m mes，重新悬浮纳米颗粒，超声振荡1min；分别加入100μledc和nhs溶液，使用摇床(大转速)室温温育1h；12000rpm
×
20min，弃上清，向沉淀中加入500μl 1
×
pbs重悬，低温超声振荡1min，12000rpm
×
5min；弃上清，向沉淀中加入500μl 1
×
pbs重悬，低温超声振荡1min，12000rpm
×
5min；弃上清，向沉淀中加入500μl 1
×
pbs重悬，超声振荡1min，加入对应数量链霉亲和素修饰过的抗体，并加入质量分数为0.4％的peg8000，摇床翻转孵育8h；抗体加入量如表1所示；12000rpm
×
20min，弃上清，向沉淀中加入500μl10mm盐酸羟胺，摇床翻转温育1h；12000rpm
×
20min，弃上清，放入4℃保存；加入125μl封闭液，重悬纳米颗粒，摇床翻转温育1h；12000rpm
×
20min，弃上清，向沉淀中加入125μl保存液重悬，4℃保存。
[0074]
表1荧光微球-抗体偶联结合物制备所需抗体含量
[0075][0076]
三、检测垫的制备：
[0077]
使用硝酸纤维素膜作为检测垫的免疫层析试纸条，使用三维平面点膜喷金仪的划膜功能，分别在膜条前端包被检测抗体作为检测带t线，在膜条后端包被生物素化-bsa作为质控带c线。在距离一端检测卡约1.2cm处喷涂t线，t线后约0.7cm处喷涂c线，喷涂的体积和质量按表2的设计进行，干燥1h；将包被完成的硝酸纤维素膜条在37℃条件下烘烤过夜。随后，将干燥好的检测垫收起，用铝箔袋装好，加入干燥剂，封口后再放置60℃生化培养箱中烤72h；拿出烤好的检测垫，放在4℃冰箱备用。
[0078]
表2抗体及生物素化-bsa在检测带和质控带上的划线量
[0079][0080]
四、层析缓冲液的制备(100ml)：
[0081]
向玻璃容器中加入0.1ml tween-20，0.1ml proclin300，2mm edta，再加入1
×
pbs溶液搅拌溶解，用稀盐酸或氢氧化钠将ph调节为7.4。
[0082]
五、组装：
[0083]
依次将滤血垫201、喷金垫202、检测垫203、吸水垫204黏贴在底板207上，层压严实。
[0084]
层压完成后的膜条，按规格裁切成合适的小段，其中检测卡的规格为2.5cm
×
0.5cm，吸水垫的规格为2cm
×
0.5cm，样品垫(血垫)的大小为1.2cm
×
0.5cm，安装在外壳卡槽中，制作成检测试剂卡。
[0085]
最后将层析缓冲液和检测试剂卡包装成盒。
[0086]
六、标准曲线的制备：
[0087]
对试剂盒进行测试：层析参数：血清/血浆50μl，全血75μl，缓冲液150μl，加样量75μl，层析时间15min。
[0088]
将待测样品和层析缓冲液在混合槽中混匀，随后加入加样区反应一段时间后开始层析。计时，时间到后扫描，读数。
[0089]
通过光学设备测量检测带t线与质控带c线的荧光强度，分别反映了结合抗原的微球量和未结合抗原的微球量。
[0090]
利用已知抗原浓度的样本进行层析，测量出不同浓度下的检测带t线与质控带c线的荧光强度的对比值，制作出标准曲线公式。
[0091]
成品检测卡在使用时，通过测量未知浓度样本层析后检测卡上检测带t线与质控带c线的荧光强度的对比值，再代入标准曲线公式即可计算出样本浓度。
[0092]
结果评价标准：优先考虑浓度与比值之间的相关关系，以r2为评价标准，r2越大越好。
[0093]
实施例2
[0094]
本实施例与实施例1基本相同，不同点在于封闭液、保存液、喷金垫处理液以及层析缓冲液的配方改变：
[0095]
表3封闭液的配方
[0096][0097]
表4保存液的配方
[0098][0099]
表5喷金垫处理液的配方
[0100][0101]
表6层析缓冲液的配方
[0102][0103]
实施例3
[0104]
本实施例与实施例1基本相同，不同点在于荧光微球-抗体偶联结合物制备抗体含量和检测垫t线和c线上划线量的改变：均采用1.1mg/ml。
[0105]
实施例4
[0106]
本实施例与实施例1基本相同，不同点在于荧光微球-抗体偶联结合物制备抗体含量和检测垫t线和c线上划线量的改变：均采用1.2mg/ml。
[0107]
综上所述，本技术实施例的荧光免疫检测心肌多联试剂盒具有可同时获得多项指标检测结果，效率高，成本低的特点。另外，本技术实施例的荧光免疫检测心肌多联试剂盒的制备方法工艺简单，成本低。
[0108]
以上所描述的实施例是本技术一部分实施例，而不是全部的实施例。本技术的实施例的详细描述并非旨在限制要求保护的本技术的范围，而是仅仅表示本技术的选定实施例。基于本技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本技术保护的范围。