单个精子活性氧和精子线粒体膜电位检测系统的制作方法

1.本发明涉及精子分析技术领域，尤其涉及一种单个精子活性氧和精子线粒体膜电位检测系统。


背景技术：

2.活性氧（reactive oxygen species, ros）是有机体在有氧代谢过程中产生的一类含氧物质，主要包括超氧阴离子(o2·
ꢀ‑
)、过氧化氢(h2o2)、羟自由基(
· oh)、活性氮类(no等)，氧化能力极强，对于精子而言具有两面性，少量、持续的活性氧刺激有利于精子发挥正常的生理功能，如细胞信号转导、激素的产生、精子获能、顶体反应以及精子活力等，但过量的活性氧将引起精子氧化应激，损伤精子的氧化防御系统，并对精子产生潜在毒性，造成精子膜的脂质过氧化及精子内蛋白质的过氧化、精子dna的损伤、精子的线粒体损伤等，严重影响精子的功能。活性氧介导的氧化应激对精子的损伤作用已被认为是男性不育的重要原因之一，因此，检测男性精液和精子中活性氧水平是诊断和辅助治疗男性不育的重要手段。
3.线粒体是细胞中的能量生产单元，其产生的能量物质atp可为精子运动提供动力，几乎整个精子代谢所需的能量也均由线粒体提供，因此线粒体的功能状态对于精子的运动和存活具有重要意义。线粒体在产生能量时，会将电化学势能储存于线粒体内膜，在内膜两侧，若质子及其他离子浓度的不对称分布就会形成线粒体膜电位（mmp），正常的mmp是维持线粒体进行氧化磷酸化、产生三磷酸腺苷的先决条件，对于维持细胞正常的生理功能至关重要，研究发现多种细胞在不同因子作用下发生凋亡时均伴有mmp的下降。在生殖细胞领域，线粒体mmp的正常水平反映了精子线粒体atp能量代谢情况良好，mmp的改变或丧失将预示着精子运动所需要的atp能量合成出现障碍，也是精子细胞发生凋亡的早期信号，已有多项研究通过对mmp的检测来评价精子的功能。
4.目前，精子活性氧检测方法主要有化学发光法和荧光探针法，精子线粒体膜电位检测主要使用的是荧光探针法。
5.精子活性氧化学发光法检测过程中使用鲁米诺或光泽精作为化学发光探针，探针和精液中的活性氧反应后会被降解而发光，使用化学发光仪（luminometer）可以定量检测精子细胞活性氧的生成，具有高度的灵敏度和特异性，但该种技术更适合精液总体（精子和精液）活性氧水平的评价，不适合单个精子内活性氧水平的检测。单个精子内活性氧水平的检测可以排除检测过程中较大背景干扰，反映精子与精子细胞之间的差异，相较于精液总体活性氧评价更有指导意义，更客观评价精子质量。
6.荧光探针法使用透膜过性荧光染色剂对精子进行染色后，使用流式细胞仪进行检测，其中精子活性氧检测使用的是dcfh-da探针，穿透精子细胞膜后，可被活性氧氧化为dcf，可受激产生绿色荧光，精子线粒体膜电位使用的是jc-1荧光探针，可线粒体的基质中聚集形成聚合物，受激后产生红色荧光。但流式细胞仪在检测过程中存在以下弊端：1）依赖于鞘液液滴包裹单个精子进行荧光水平的检测，鞘液液滴的流动剪切力可能会使得精子产
生氧化应激，造成荧光检测不准确；2）有起始上样量的需求，样品损耗量大，精子样品通常还会做别的检测，如果患者精子数量稀少，不适合上机检测；3）流式细胞仪检测的是流动的单个液滴，单个液滴中包裹精子，如果单个液滴在流动过程中偏离焦平面，收集的散射荧光就会有误差，造成检测数据不准确；4）样品制备复杂，仪器需要校准，操作难度大。
7.综上所述，现有检测技术均无法准确定量检测单个精子内活性氧或线粒体膜电位的水平，主要原因是精子尺寸太小，通常只有5μm直径，缺少直接针对单个精子进行荧光激发的激发光探头，本系统采用了激发光探头和光子级别光学检测模块，实现了单个精子活性氧和精子线粒体膜电位水平的检测，是生殖细胞检测技术领域一大空白。


技术实现要素：

8.本发明需要解决的技术问题是提供一种单个精子活性氧和精子线粒体膜电位检测系统，采用激发光探头和光子级别光学检测模块来实现单个精子活性氧和精子线粒体膜电位水平的检测。
9.为解决上述技术问题，本发明所采取的技术方案如下。
10.单个精子活性氧和精子线粒体膜电位检测系统，包括相配装的壳体和舱门，所述壳体内设置有放置盛装精液器皿的样品池，样品池的上方设置有能够激发器皿内目标精子荧光的激发机构，样品池的下方设置有对激发后的目标精子进行荧光收集的检测机构，壳体内设置有控制检测机构和激发机构工作的控制器。
11.上述单个精子活性氧和精子线粒体膜电位检测系统，所述样品池固定设置在壳体的中部，样品池的中部开设有通孔，所述器皿以覆盖通孔方式放置在样品池上。
12.上述单个精子活性氧和精子线粒体膜电位检测系统，所述激发机构包括通过连接线连接的激发光源和激发光探头，其中激发光源通过固定在壳体上部的隔板定位，激发光探头通过探头夹具夹持；激发光源的受控端连接控制器的输出端。
13.上述单个精子活性氧和精子线粒体膜电位检测系统，所述壳体的底部固定设置有步进电机模块，探头夹具设置在步进电机模块的输出端，步进电机模块的受控端与控制器的输出端连接，以在步进电机模块带动下改变探头夹具和激发光探头的位置。
14.上述单个精子活性氧和精子线粒体膜电位检测系统，所述检测机构包括设置在样品池下方的光学检测模块，光学检测模块的输出端通过数据线连接控制器的输入端。
15.上述单个精子活性氧和精子线粒体膜电位检测系统，所述检测机构还包括固定设置在壳体底部的光路切换装置，光路切换装置的顶部设置有物镜，物镜位于样品池的下方、并正对通孔位置；所述光学检测模块设置在光路切换装置的一侧，光路切换装置的另一侧设置有ccd相机，所述光路切换装置的受控端连接控制器的输出端，ccd相机的输出端通过数据线连接控制器的输入端。
16.上述单个精子活性氧和精子线粒体膜电位检测系统，位于器皿正上方和隔板下方的壳体内通过支架固定设置有明场光源，明场光源的受控端连接控制器的输出端。
17.上述单个精子活性氧和精子线粒体膜电位检测系统，所述壳体和舱门均为避光壳体。
18.上述单个精子活性氧和精子线粒体膜电位检测系统，所述激发光源为led单波长激发光源。
19.上述单个精子活性氧和精子线粒体膜电位检测系统，所述壳体的外部设置有与控制器输出端连接、方便查看检测结果的显示器；所述壳体的底部四脚位置分别设置有减震垫片。
20.由于采用了以上技术方案，本发明所取得技术进步如下。
21.本发明通过ccd相机视野完成精子的自动识别和标注，结合步进电机模块和光学检测模块的自动控制，将激发光探头逐次定位到单个精子附近，并完成荧光激发和荧光信号的采集，实现了多个单精子的自动化检测，提高了单个精子活性氧和线粒体膜电位的检测效率以及检测精度。
附图说明
22.图1为本发明的结构示意图；其中：1.壳体，2.隔板，3.控制器，4.激发光源，5.连接线，6.探头夹具，7.光路切换装置，8.光学检测模块，9.ccd相机，10.物镜，11.样品池，12.器皿，13.明场光源，14.步进电机模块，15.激发光探头，16.显示器，17.舱门，18.减震垫片。
具体实施方式
23.下面将结合附图和具体实施方式对本发明进行进一步详细说明。
24.单个精子活性氧和精子线粒体膜电位检测系统，其结构如图1所示，包括相配装的壳体1和舱门7，壳体1和舱门7封闭后形成检测空腔。本发明中，壳体1和舱门17均为避光壳体，可阻挡外界环境光对单精子检测的干扰，提高检测精度。
25.壳体1内设置有样品池11，用于放置盛装精液的器皿12；样品池11固定设置在壳体的中部，样品池的中部开设有通孔，器皿12以覆盖通孔方式放置在样品池上。
26.样品池11的上方设置有激发机构，能够激发器皿内经过活性氧或线粒体膜电位染色的目标精子的荧光；样品池11的下方设置有检测机构，用于收集荧光、对激发后的精子进行活性氧或线粒体膜电位的检测；壳体内设置有控制器3，协调控制检测机构和激发机构工作；壳体的外部设置有显示器16，显示器与控制器输出端连接，以方便作业人员查看检测结果。
27.激发机构包括步进电机模块14、激发光源4、激发光探头15和探头夹具6，激发光源4和激发光探头15通过连接线5连接，激发光探头15通过探头夹具6夹持。
28.壳体上部固定设置有隔板2，控制器3和激发光源4均固定设置在隔板上，激发光源4的受控端连接控制器3的输出端。
29.步进电机模块14固定设置在壳体的底部，可沿着x、y、z三个方向进行移动，每个方向的移动精度均为50nm。探头夹具6设置在步进电机模块14的输出端，步进电机模块14的受控端与控制器的输出端连接，控制器控制步进电机模块14动作，以改变探头夹具6和激发光探头15的位置，方便精准针对多个精子逐一进行荧光激发。
30.本实施例中，激发光源4为led单波长激发光源，用于单个精子的高效率荧光激发，产生的激发光波长1为490nm，用于单精子活性氧的荧光激发；产生的激发波长2为585nm，用于单精子线粒体膜电位的荧光激发；激发光源4在控制器指令下输出特定波长的激发光。
31.检测机构包括光路切换装置7、光学检测模块8、ccd相机9和物镜10，光路切换装置
7、光学检测模块8、ccd相机9和物镜10均设置在样品池11的下方。
32.光路切换装置7固定设置在壳体的底部，物镜10设置在光路切换装置7的顶部，且物镜10位于样品池的下方，并正对通孔位置，便于采集器皿内图像和荧光信息；光学检测模块8设置在光路切换装置7的一侧，ccd相机9设置在光路切换装置7的另一侧；光路切换装置7的受控端连接控制器的输出端，ccd相机9和光学检测模块8的输出端分别通过数据线连接控制器3的输入端。
33.其中，光路切换装置7可以将进入物镜的光进行方位转换，使精子成像过程中的明场光进入ccd相机9，使精子检测过程中的荧光进入光学检测模块8；光学检测模块8用于荧光信号采集，感光灵敏度为到光子级别，感光灵敏度最小为50个光子，感光波段230nm~700nm；ccd相机采集精子分布状态后送入控制器，控制器可将ccd相机视野中的精子进行自动识别和标注，方便控制激发机构逐次定位到单个精子附近并完成荧光信号采集，实现多个单精子的自动化检测。本实施例中，述物镜10包含4
×
、10
×
、20
×
、40
×
和60
×
物镜镜头。
34.本发明为提高ccd相机的清晰度，在位于器皿正上方和隔板下方的壳体内通过支架固定设置了明场光源13，明场光源13的受控端连接控制器3的输出端，控制器来控制明场光源的亮灭。同时，为减少震动造成的激发光探头机械损伤和检测波动，在壳体的底部四脚位置分别设置有减震垫片18。
35.本发明的工作流程如下所述。
36.首先，使用dcfh-da精子活性氧染色试剂对精子进行活性氧荧光染色，使用精子线粒体膜电位染色试剂jc-1对精子进行线粒体膜电位荧光染色，分别制成精子悬液，各自滴加到器皿12中。
37.其次，调节物镜10焦距，在精子成像过程中，明场光源13开启，激发光源4关闭，进入物镜10的明场光被转换进入ccd相机，视野中看到精子分布；通过显示器16观察ccd相机9视野中的精子，使精子清晰显示，控制器3可以根据ccd相机9视野自动识别和标注单精子位置。
38.然后，控制器3控制步进电机模块14和光学检测模块8协调作业，将激发光探头15逐次定位到单个精子附近，完成荧光激发和荧光信号采集，实现多个单精子的自动化检测，得到平均荧光值a。在单精子检测过程中，明场光源13关闭，激发光源4开启，进入物镜10的荧光被转换进入光学检测模块8进行检测。
39.荧光值a将代表受检测样品中精子活性氧水平或精子线粒体膜电位水平，如果荧光值异常，即精子活性氧水平高于正常阈值或精子线粒体膜电位低于正常阈值，则说明该样品中的精子是异常状态，建议在医院进行其他临床指标的检查。
40.如上，本发明通过设置激发光探头，实现了单个精子的荧光激发，避免了精液和其它精子对检测造成干扰，可以准确、灵敏的针对单个精子进行活性氧和线粒体膜电位的检测；通过设置避光壳体，减少了外界杂光对单个精子检测造成干扰；通过壳体的底部四脚位置设置有减震垫片，减少震动造成的激发光探头损伤和检测波动；通过设置光子级别感光灵敏度的光学检测模块，用于单个精子产生荧光的信号采集，提高了单个精子活性氧和线粒体膜电位检测的分辨率；通过设置纳米精度的步进电机模块，实现了激发光探头的精确位置控制，使激发光探头可稳定触及单个精子附近，避免了位置偏差造成的单个精子荧光激发偏差；通过设置光路切换装置，实现了精子观察和单精子检测的双向光路控制，避免了
成像过程对检测造成影响。
41.综合本发明与其他精子检测技术，可以发现本发明具有以下优势。
42.其一，背景干扰小，如工作流程中描述，能够针对单个精子进行荧光激发，检测过程中不会受到精液或其他精子的荧光干扰，每一次检测探头都是定位于单个精子，不会产生背景误差，也没有流体剪切力的影响，不会在检测过程中造成精子的氧化应激，大大提高了检测精度，保证了精子的质量。
43.其二，本发明分辨率高，通常的流式细胞分析仪无法灵敏检测精子与精子之间真实的荧光差异，最终得到的结果是统计超过荧光阈值的精子数，本发明检测是单个精子的真实荧光值，最终得到的结果是多个单精子平均化后的荧光值，不仅可以灵敏检测不同质量单精子之间的差异，也可以准确评价不同样品中精子活性氧水平或线粒体膜电位的高低。
44.其三，本发明样品需求量小，流式细胞仪和化学发光仪对精子数量都有很高要求，临床上重度少精患者精子数量很少，无法进行流式分析或化学发光分析，也不利于其它精子检验项目的样品预留，本发明没有特殊的制样需求，可最大限度保留样品量。
45.以上实施例仅用于说明本发明的技术方案进行说明，本领域的技术人员应当理解，本发明权利要求范围之内，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换。