1.本发明涉及生物
技术领域：
：，具体涉及一种法夫酵母代谢产物的分析方法。
背景技术：
：：2.法夫酵母是phaffia属的微生物，是一种极其重要的工业菌株，能够合成多种具备生物活性的天然产物。法夫酵母所产虾青素、脂肪酸、岩藻黄质、叶黄素等在食品保健、医疗、美容等方面具有较高的利用价值。3.代谢物的定性一直是代谢组学的一大难点，由于法夫酵母代谢物复杂，传统微生物代谢数据库样本较少，导致法夫酵母代谢物定性不准确以及假阳性较高。技术实现要素：4.为了解决上述问题，本发明提出一种法夫酵母代谢产物的分析方法，该方法提高了检测的靶向性，克服了一般方法分析定性不精准的缺点，提高了检测灵敏度，无需同位素示踪，操作简单，适用性广泛。5.为了实现上述目的，本发明的实施例在一方面提出了一种法夫酵母代谢产物的分析方法，其包括以下步骤：6.(1)从法夫酵母发酵液中提取代谢物作为样品；7.(2)对样品进行液相色谱-电喷雾电离-三重四级杆飞行时间质谱联用检测，获得质谱数据；8.(3)在ms-dial选择液质代谢组学数据库进行下载；9.(4)通过ms-dial对步骤(2)的质谱数据进行分析，获得总离子峰图；10.(5)将步骤(4)的总离子峰图与步骤(3)的数据库进行鉴定法夫酵母代谢产物。11.根据本发明实施例的一种法夫酵母代谢产物的分析方法，该方法使用lc-qtof-ms液质联用技术进行质谱，再将质谱数据转入ms-dial软件，选择allpublicms/ms数据库对数据，通过质谱数据与数据库匹配进行分析，提高了检测的靶向性，克服了一般方法分析定性不精准的缺点；同时根据特异子离子的丰度对代谢物进行定量检测，极大提高了检测灵敏度，为研究法夫酵母天然活性代谢产物提供新思路新方法。12.另外，根据本发明上述实施例提出的一种法夫酵母代谢产物的分析方法，还可以具有如下附加的技术特征：13.可选地，步骤(5)中，通过总离子峰图中的质谱峰和保留时间与数据库进行匹配鉴定法夫酵母代谢产物。14.可选地，步骤(2)中，液相色谱的操作条件是：进样量5～10μl，柱温25～35℃，流速0.2～0.4ml/min；色谱流动相a：0.1％甲酸水，b：乙腈；色谱梯度洗脱程序如下：0～1min，90％a；1～3min，a从90％线性变化至50％；3～6min，a从50％线性变化至10％；6～9min，a维持在10％；9～11min，a从10％线性变化至50％；11～12min，a从50％线性变化至90％。15.可选地，步骤(2)中，电喷雾电离是采用正离子模式和负离子模式进行检测。16.可选地，步骤(2)中，esi源条件为：毛细管电压：3～3.30kv；采样锥：40；震源偏移：80；源温度：100℃；脱溶剂温度：250～300℃；气帘气流量：50l/h；脱溶剂气流量：59850l/h；正离子扫描m/范围：50～1200da；负离子扫描m/z范围：50～1200da。17.可选地，还包括步骤(6)使用l-谷氨酸、咪唑、葡萄糖、蔗糖标准品对仪器和软件校准。18.本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。附图说明19.图1为根据本发明实施例的法夫酵母代谢物在甲酸水(0.01％甲酸)做流动相以正离子、灵敏度模式检测条件下的总离子流图；20.图2为根据本发明实施例的法夫酵母代谢物在甲酸水(0.01％甲酸)做流动相以负离子、灵敏度模式检测条件下的总离子流图；21.图3为根据本发明实施例的法夫酵母代谢物在负离子模式下通过ms-dial软件处理的总离子峰图；22.图4为根据本发明实施例的法夫酵母代谢物在正离子模式下通过ms-dial软件处理的总离子峰图；23.图5为根据本发明实施例的负离子模式法夫酵母代谢物质谱数据与ms-dial负离子数据库比对定性物质；24.图6为根据本发明实施例的正离子模式法夫酵母代谢物质谱数据与ms-dial正离子数据库比对定性物质；25.图7为根据本发明实施例的l-谷氨酸标品质谱图；26.图8为根据本发明实施例的咪唑标品质谱图；27.图9为根据本发明实施例的葡萄糖标品质谱图；28.图10为根据本发明实施例的蔗糖标品质谱图。具体实施方式29.以下通过特定的具体实例说明本发明的技术方案。应理解，本发明提到的一个或多个方法步骤并不排斥在所述组合步骤前后还存在其他方法步骤或在这些明确提到的步骤之间还可以插入其他方法步骤；还应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。而且，除非另有说明，各方法步骤的编号仅为鉴别各方法步骤的便利工具，而非为限制各方法步骤的排列次序或限定本发明可实施的范围，其相对关系的改变或调整，在无实质变更技术内容的情况下，当亦视为本发明可实施的范畴。30.为了更好的理解上述技术方案，下面更详细地描述本发明的示例性实施例。虽然显示了本发明的示例性实施例，然而应当理解，可以以各种形式实现本发明而不应被这里阐述的实施例所限制。相反，提供这些实施例是为了能够更透彻地理解本发明，并且能够将本发明的范围完整的传达给本领域的技术人员。31.本发明采用的试材皆为普通市售品，皆可于市场购得。32.发酵培养基：葡萄糖20g/l,磷酸二氢钾1.0～1.5g/l，氯化钠0.1～0.3g/l，七水硫酸镁0.5～0.8g/l，二水氯化钙0.1～0.3g/l，酵母粉0.2～0.4g/l，ph＝6。33.下面参考具体实施例，对本发明进行描述，需要说明的是，这些实施例仅仅是描述性的，而不以任何方式限制本发明。34.实施例35.代谢物提取：36.jmu-mvp14法夫酵母菌株以9％的接种量至发酵培养基中发酵5天后，经离心液氮研磨后，称取80mg～100mg，加入200μl预冷水和800μl预冷的甲醇/乙腈(1:1，v/v)，混匀，冰浴中超声60min，-20℃孵育1h沉淀蛋白，16000g、4℃离心20min，取上清。上清在高速真空浓缩离心机挥干，获得样品。37.样品检测：38.质谱检测时，向上述挥干获得的样品加入500μl的试剂，试剂为乙腈(默克，1.00029.2500)、甲醇(默克，1.06035.2500)。39.质谱：i-classplus/xevog0-xstof(waters)；色谱：acquityuplcclass1；超高效液相色谱仪(waters)；色谱柱:be527(waters)；试剂：乙腈(默克，1.00029.2500)、甲酸(阿拉丁，f301957)。分别使用正离子模式和灵敏度模式组合，负离子模式和灵敏度模式组合进行质谱分析。40.每1组2个待测样本，每组1个重复。本实施例进行质量控制，同时制备了1个qc样本，qc样本为所有样品等量混合的样本。qc样本用于平衡色谱-质谱系统及测定仪器状态，并用于整个实验过程中系统稳定性的评价。41.使用液相色谱-电喷雾电离-三重四级杆飞行时间质谱联用技术，仪器配置为：超高效液相色谱作为分离系统；电喷雾电离系统作为离子源；三重四级杆质谱仪作为检测器。42.使用液相色谱分离系统的具体参数如下：超高效液相色谱中进样量5～10μl，柱温25～35℃，流速0.2～0.4ml/min；色谱流动相a：0.1％甲酸水，b：乙腈；色谱梯度洗脱程序如下：0～1min，90％a；1～3min，a从90％线性变化至50％；3～6min，a从50％线性变化至10％；6～9min，a维持在10％；9～11min，a从10％线性变化至50％；11～12min，a从50％线性变化至90％。43.每份样本分别采用电喷雾电离(esi)进行正离子和负离子模式检测。样品经uplc分离后用qtof-ms质谱仪进行质谱分析。其esi源条件如下：毛细管电压：3～3.30kv；采样锥：40；震源偏移：80；源温度：100℃；脱溶剂温度：250～300℃；气帘气流量：50l/h；脱溶剂气流量：59850l/h。tofms正离子扫描m/z范围：50～1200da，tofms负离子扫描m/z范围：50～1200da，tofms扫描累计时间0.1～0.5s/spectra,productionscanaccumulationtime0.03s/spectra。44.结果如图1和图2，图1为法夫酵母代谢物在甲酸水(0.01％甲酸)做流动相以正离子、灵敏度模式检测条件下的总离子流图。图2为法夫酵母代谢物在甲酸水(0.01％甲酸)做流动相以负离子、灵敏度模式检测条件下的总离子流图。45.样品数据分析：46.(1)通过waters的q-tof-ms液质联用得到的raw格式的质谱数据进行格式转化。首先将质谱数据导入msconvert软件转为mzml格式，再把得到的mzml格式数据导入reifycsanalysisbasefileconverter软件将mzml格式转为abf格式数据。47.(2)在ms-dial选择液质代谢组学数据库进行下载，本实施例下载了allpublicms/ms(13,303uniquecompounds)positive，allpublicms/ms(12,879uniquecompounds)negative数据库用于后续分析。48.(3)通过ms-dial4.7对步骤(1)得到的abf格式数据进行分析。点击newproject把转化格式后的数据导入ms-dial，根据质谱类型和质谱条件选择对应选项，waters得到的质谱数据datetype(ms1)/datetype(ms/ms)选项应选择centroiddate并选择正负离子模式。点击next后进入analysisfilepaths界面把abf格式数据导入，根据样品类型可以分别选择blank、standar、qc、sample，点击next进入analysisparametersetting界面。在datecollection界面选择质谱条件，把一级质谱误差范围设为0.01da，二级质谱误差范围设为0.025da，扫描时间排除溶剂出峰时间和污染峰后设为0.6～12min，一级质谱和二级质谱扫描范围根据样品情况设为50～1200da。根据样品处理方法、流动相、色谱柱等因素在adduct界面选择样品数据可能存在的加合物类型，本实施例根据样品处理情况，正离子模式选择了m+h+、m+nh3、m+ch3oh+h+、m+na+加合物形式，负离子模式选择了m-h、m-h2o-h、m+h-h2o加合物形式。alignment选项选择参考对齐质量控制qc样本数据，保留时间误差设为0.05min，一级质谱误差0.015da。输入需要排除的溶剂离子峰和污染离子峰，在peakdetection选项中最小峰高选择1000amplitude，质量切片宽度选择0.1da，smoothingmethod选择linearweightedmovingaverage，平滑水平选择3scan，最小峰宽选择5scan。在identification选项中选择步骤(2)所下载的数据库导入，同时将保留时间误差设为100min，一级质谱的精确度设为0.01da，二级质谱的精确度设为0.05da，识别分数截止值设为70％。49.(4)通过步骤(3)得到与数据库对比结果，通过peakspotviewer窗口可发现扫描出来的所有物质的离子峰以及出峰时间、荷质比等。选择alignmentnavigator选项点击showiontable显示所有鉴定出来的物质，包含每个物质的出峰时间、荷质比、加合物类型、误差等。50.结果如图3和图4，图3为法夫酵母代谢物在负离子模式下通过ms-dial软件处理的总离子峰图，图4为法夫酵母代谢物在正离子模式下通过ms-dial软件处理的总离子峰图。51.(5)通过与数据库的出峰时间、质荷比和特征峰进行分析比对，根据软件的打分结果来最终确认定性的准确度。52.结果如图5和图6，图5为通过负离子模式法夫酵母代谢物质谱数据与ms-dial负离子数据库比对定性到的1036种物质；图6为通过正离子模式法夫酵母代谢物质谱数据与ms-dial负离子数据库比对定性到的1622种物质。53.结果如表1所示，通过ms-dial软件数据库鉴定的关键法夫酵母代谢物。54.(6)最后通过使用l-谷氨酸、咪唑、葡萄糖、蔗糖标准品在在甲酸水(0.01％甲酸)、乙腈做流动相以正负离子模式进行校准来防止谱峰飘移，精度下降等问题从而提高数据的可靠性。55.如图7-图10，图7为l-谷氨酸标品质谱图，图8为咪唑标品质谱图，图9为葡萄糖标品质谱图，图10为蔗糖标品质谱图。56.表1通过ms-dial软件数据库鉴定的关键法夫酵母代谢物[0057][0058][0059][0060]在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不应理解为必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例进行接合和组合。[0061]尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。当前第1页12当前第1页12