一种芬太尼类药物头发标准物质的制备方法及应用与流程

1.本发明属于分析化学技术领域，尤其涉及一种头发样本中9种芬太尼类药物标准物质的制备方法及应用。


背景技术：

2.芬太尼作为麻醉辅助用药，因其具有起效快，持续时间短，镇痛作用强等特点，自上个世纪60年代以来，被广泛地应用于外科手术中。作为一种阿片类药物，芬太尼可以激活人体内的阿片受体，具有兴奋和刺激作用，有较强的成瘾性和耐受性。正是由于其具有类似海洛因的作用，使作为药品的芬太尼却在一些国家被用于吸毒，芬太尼滥用现象也随之出现。芬太尼的滥用不仅会对人体造成伤害，甚至会导致死亡，成人致死剂量仅为几毫克。
3.生物检测中，头发作为一种非常规的生物检材，具有采集方便，容易保存，不易造假，检测窗口长和无损非侵入性等特点。与血液和尿液检测相比，头发检测的主要优势在于检测窗口更宽，根据所分析的毛干的长度，检测窗口为几周至几个月，长期的吸毒史可以通过头发分析来追溯。与其他生物样品相比，药物进入头发后不会被人体内的化学物质所分解，所沉积的药物非常稳定，可以在更长的时间后进行检测。一般以毛发样品中吗啡、甲基苯丙胺、氯胺酮的检测含量阈值为参考(0.2ng
·
mg-1
)。
4.头发样本中芬太尼类药物及其代谢物存在着含量低，药物提取困难，头发成分复杂等特点，常用检测方法主要有gc-ms/ms和lc-ms/ms等。
5.但又存在国际标准物质数据库(comar)和国家标准物质资源共享平台都未找到芬太尼类药物标准物质的登记，缺少用于检测的标准物质，导致检测结果的可靠性、准确性和溯源性得不到保障的技术问题。


技术实现要素：

6.为了解决以上技术问题，本发明提供一种头发样本中芬太尼类药物标准物质的制备方法及应用，满足法医和临床实验室对芬太尼类药物标准物质的需求，制备方法简单，定值方法灵敏度高、准确度好和特异性强，可作为毛发中芬太尼类药物基体标准物质的定值方法，用于标准物质的研制，应用于法医滥用药物检测和实验室质量控制。
7.解决以上技术问题的一种头发样本中芬太尼类药物标准物质的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：
8.(1)采集未有违禁药物使用史的成人头发样本，将采集的头发样本使用纯水、色谱级甲醇各洗涤3次，室温下干燥后剪切成2cm小段。
9.(2)浸泡溶液制备：称量乙酰芬太尼，异丁酰芬太尼，对氟芬太尼，奥芬太尼，硫代芬太尼，4-氟丁酰芬太尼，四氢呋喃芬太尼，芬太尼和去甲基芬太尼9种芬太尼类药物置于容器中，加入蒸馏水和二甲基亚砜溶液，超声使之混合均匀，为药物-二甲基亚砜溶液。
10.(3)将空白的人体头发样本放入浸泡溶液中，浸泡一段时间后，将头发样本取出，使用足够体积的甲醇充分清洗。
11.(4)洗涤后的头发样本在真空干燥箱中干燥，干燥温度23-26℃，干燥时间45-52h；干燥后的头发样本使用球磨机研磨粉碎成深褐色粉末，粒径《5mm。
12.(5)粉碎后的头发样本在真空干燥箱中干燥23-25h，经混和仪混合23-25h，混匀后装瓶；
13.(6)制备好的芬太尼类药物头发标准物质置于20-30℃下避光保存。
14.所述步骤(2)中采用gc-ms/ms对乙酰芬太尼，异丁酰芬太尼，对氟芬太尼，奥芬太尼，硫代芬太尼，4-氟丁酰芬太尼，四氢呋喃芬太尼，芬太尼和去甲基芬太尼这9种芬太尼类药物纯品原料进行定性分析，采用hplc-dad法对9种芬太尼类药物纯品原料进行纯度确定。
15.定性分析：确定原料为目标化合物；纯度分析：对原料进行筛选，避免因原料纯度过低而导致无法进行后续的定值分析；纯度分析的结果会影响制备头发标准物质中相关药物的定值结果。定性分析和纯度分析在制备标准物质时进行。可在制备标准物质前，先对原料进行定性分析和纯度检验。
16.本发明中浸泡溶液中，乙酰芬太尼，异丁酰芬太尼，对氟芬太尼，奥芬太尼，硫代芬太尼，4-氟丁酰芬太尼，四氢呋喃芬太尼和芬太尼的每种浓度不低于2mg/l，去甲芬太尼的浓度不低于1mg/l。
17.所述步骤(2)中芬太尼类药物、水和二甲基亚砜溶液的用量质量比为0.3：5：5。
18.所述水为蒸馏水。
19.所述二甲基亚砜溶液中含0.02mol/l盐酸。
20.所述步骤(3)中头发标准物质制备浸泡时间的选择：在头发标准物质制备过程中采用由密到疏的原则，在6个不同的时间点分别取样，使用lc-ms/ms进行分析。
21.所述步骤(3)中当头发中的药物浓度达到最大值时，取出头发样本，使用足够体积的甲醇充分清洗，以去除外部污染，以最后一次清洗液检测结果呈阴性为准。
22.所述步骤(3)中浸泡一段时间为7-25天，优化方案中浸泡时间为24天。
23.本发明中采用单因素变量法考察不同提取方式、不同提取溶剂、不同提取时间、不同的液料比和不同的盐酸酸度对药物提取量的影响，初步确定合理的实验各因素与水平。
24.本发明中一种头发样本中芬太尼类药物标准物质的应用，步骤如下：
25.(1)提取头发标准物质中9种芬太尼类物质；
26.(2)建立二次多项回归方程模型，确立头发样品最佳前处理条件；二次多项回归方程为：药物浓度(ng
·
mg-1
)＝6.56-0.08a+0.11b+0.15c-0.02d-0.013ab-0.045ac-0.076bc+0.042bd-0.031cd-0.33a
2-0.08b
2-0.088c
2-0.096d2，其中提取温度(a)、提取时间(b)、液料比(c)和甲醇/盐酸(d)；建立回归方程式是在样品前处理的步骤中。
27.响应面分析法是利用合理的实验设计方法结合实验得到一定的数据，采用多元二次回归方程来拟合因素与响应值之间的函数关系，通过对回归方程的分析来寻求最优工艺参数，解决多变量问题的一种统计方法。回归方程模型的建立是为了寻找头发样本的最佳前处理条件。
28.(3)提取液在40℃下氮气蒸发至干，残留物用甲醇复溶，15000xg下离心5min；
29.氮吹主要是起到将样品快速富集浓缩的作用。另一方面，药物提取液中含有盐酸，对质谱不友好。氮气吹干后，使用甲醇复溶，有利于保护质谱系统。氮吹可以保持样品的纯净，达到纯化的目的。
30.(4)取上清液经0.22μm微孔滤膜过滤；
31.(5)对过滤液进样分析：定性或定量分析，制备的头发标准物质中目标物的两对mrm离子对的色谱峰，保留时间与对照品溶液中相应化合物的色谱峰保留时间比较，若rsd《3.0％，则符合定性分析的要求，说明阳性结果正确可靠，制备的头发标准物质中含有9种芬太尼类药物。制备的头发标准物质中为全部含有9种芬太尼类药物。
32.所述步骤(1)中提取为有机溶剂超声提取，提取温度为30℃～60℃、提取时间为10min～120min、液料比为25～250：1ml
·
g-1
的盐酸酸度，即甲醇：hcl＝1:1～30:1。
33.优化方案中提取溶剂提取温度40℃，提取时间75min，液料比250：1(ml
·
g-1
)，甲醇：盐酸＝15：1。
34.提取温度，提取时间，液料比和甲醇：盐酸会影响提取药物的浓度。详见实施例3和附图14-22。采用优化好的前处理方法，在该条件下，头发样本中的药物浓度最高，提取回收率》90％。
35.所述步骤(4)中：
36.(1)定性：将检测样品(需要检测的目标头发(如吸毒者的头发))、头发标准物质与空白样品(无药物滥用史的人体头发)经过相同的前处理操作后，吸取样品提取液进样分析。采用gc-ms/ms或(和)lc-ms/ms进行定性分析。
37.gc-ms/ms法中，采用scan模式，根据保留时间和特征离子相结合进行定性分析。若检测样品中存在与头发标准物质相同的特征离子为2个及以上，保留时间rsd小于3.0％，而空白样本中只检测到内标物，未检测出特征离子，则说明检测样品中含有芬太尼类药物。
38.lc-ms/ms法，采用mrm模式，若检测样品中存在与头发标准物质相同的mrm离子对为2对或2对以上，保留时间rsd小于3.0％，而空白样品只检测出内标物的mrm离子对，未检出目标物mrm离子对，说明检测样品中含有芬太尼类药物。
39.采用gc-ms/ms和lc-ms/ms对制备的头发标准物质进行定性分析为了确保制备的头发标准物质中含有目标药物。因为在浸泡和清洗过程中药物可能未沉积到头发中或者沉积在头发中的药物结合较疏松，在清洗过程中被洗掉。
40.(2)定量：将检测样品与头发标准物质经过相同的前处理后，采用gc-ms/ms或/和lc-ms/ms进行定量分析。
41.gc-ms/ms法中，采用sim模式，根据检测样品与头发标准物质中目标物与内标物定量离子对的峰面积比值，采用单点校正法计算出检测样品中芬太尼类药物的质量浓度。(c＝a
×
c1/a1；c：检测样品中目标物的质量浓度，单位为ng
·
mg-1
；a：检测样品中目标物与内标物的峰面积比值；c1：头发标准物质中目标物的质量浓度，单位为ng
·
mg-1
；a1：头发标准物质中目标物与内标物的峰面积比值。lc-ms/ms法中，采用mrm模式，根据检测样品与头发标准物质中目标物与内标物定量离子对的峰面积比值，采用单点校正法计算出检测样品中芬太尼类药物的质量浓度。
42.本发明中制备的头发标准物质可以做定性或定量分析，可以两者都做或者只用作定性分析目的或定量分析目的。在定量分析检测样品时，与纯度标准物质相比，头发标准物质可以减少样品前处理过程和仪器检测过程中引入的误差，提高检测结果的准确度。
43.本发明所优化的样品前处理方法，相比于传统方法中在酸性条件下孵育、使用甲醇水解、或使用己烷/乙酸乙酯(1:1)进行液-液萃取，再使用spe或lle进行纯化，样品前处
理过程简便快捷，易于操作。而且建立的gc-ms/ms和lc-ms/ms定值方法，其灵敏度高、准确度好、特异性强，可作为毛发中芬太尼类药物基体标准物质的定值方法，用于标准物质的研制，应用于法医滥用药物检测和实验室质量控制。所研制的芬太尼类药物相关标准物质，可为法庭科学滥用药物检测量值溯源提供参考，满足法医滥用药物检测和实验室质量控制的需要。
附图说明
44.图1为本发明中9种芬太尼类药物结构式
45.图2为本发明中去甲基芬太尼纯品原料gc-ms/ms质谱图
46.图3为本发明中乙酰芬太尼纯品原料gc-ms/ms质谱图
47.图4为本发明中异丁酰芬太尼纯品原料gc-ms/ms质谱图
48.图5为本发明中对氟芬太尼纯品原料gc-ms/ms质谱图
49.图6为本发明中奥芬太尼纯品原料gc-ms/ms质谱图
50.图7为本发明中硫代芬太尼纯品原料gc-ms/ms质谱图
51.图8为本发明中4-氟丁酰芬太尼纯品原料gc-ms/ms质谱图
52.图9为本发明中四氢呋喃芬太尼纯品原料gc-ms/ms质谱图
53.图10.芬太尼纯品原料gc-ms/ms质谱图
54.图11为本发明中不同的浸泡时间下头发中9种芬太尼类药物的含量
55.图12为本发明中头发标准物质的制备过程(a：采集；b:清洗；c：剪切；d浸泡；e：干燥；f：粉碎；g：混合；h：分装)
56.图13为本发明中不同的提取方法对药物浓度的影响
57.图14为本发明中不同提取溶剂对药物浓度的影响
58.图15为本发明中不同提取温度、提取时间对药物浓度的影响
59.图16为本发明中不同液料比和盐酸酸度对药物浓度的影响
60.图17为本发明中提取时间和提取温度对药物浓度影响的响应面图
61.图18为本发明中提取温度和液料比对药物浓度影响的响应面图
62.图19为本发明中提取温度和甲醇：盐酸对药物浓度影响的响应面图
63.图20为本发明中提取时间和液料比对药物浓度影响的响应面图
64.图21为本发明中提取时间和甲醇：盐酸对药物浓度影响的响应面图
65.图22为本发明中液料比和甲醇：盐酸对药物浓度影响的响应面图
66.图23为本发明中不同流动相中芬太尼色谱图
67.图24为本发明中gc-ms/ms中scan模式下芬太尼类药物色谱图(出峰顺序为从左到右依次为去甲基芬太尼、乙酰芬太尼、对氟芬太尼、异丁酰芬太尼、芬太尼、芬太尼-d5、硫代芬太尼、4-氟丁酰芬太尼、奥芬太尼、四氢呋喃芬太尼)
68.图25为本发明中lc-ms/ms中空白头发样本总离子流图
69.图26为本发明中lc-ms/ms中第4次清洗液总离子流图
70.图27为本发明中lc-ms/ms中9种芬太尼类纯品原料溶液总离子流图(出峰顺序为从左到右依次为去甲基芬太尼、乙酰芬太尼、奥芬太尼、四氢呋喃芬太尼、硫代芬太尼、芬太尼、芬太尼-d5、对氟芬太尼、异丁酰芬太尼、4-氟丁酰芬太尼)
71.图28为本发明中lc-ms/ms中头发标准物质总离子流图
72.图29为本发明中lc-ms/ms中头发标准物质mrm色谱图
具体实施方式
73.下面结合具体实施方式对本发明做进一步的阐述：
74.以下是实验中所用的仪器、试剂和样品信息。液质联用仪tqswaters，美国；气质联用仪7890a-7000，agilent，美国；超声波清洗机branson 8510，danbury，美国；氮吹仪n-evap 112，organomation,，美国；超纯水机milli-q，millipore，美国；电热恒温鼓风干燥箱dgg-9123ad，上海森信实验仪器有限公司；真空干燥箱mmm，德国；多用途冷冻离心机cf16rxii，hitachi公司，日本；电子天平xp205，mettler toledo公司，瑞士。
75.色谱纯甲醇，merck kgaa，德国；色谱纯乙腈，merck kgaa，德国；分析纯盐酸，北京化学试剂研究所有限责任公司，中国；二甲基亚砜》99.5％，honeywell，美国；色谱纯甲酸，honeywell，美国；色谱纯乙酸铵，honeywell，美国；
76.去甲基芬太尼，c
14h20
n2o，232.3，1609-66-1；乙酰芬太尼，c
21h26
n2o，322.4，3258-84-2；奥芬太尼，c
22h27
fn2o2，370.5，101343-69-5；硫代芬太尼，c
20h26
n2os，342.5，1165-22-6；芬太尼c
22h28
n2o，336.5，437-38-7；对氟芬太尼c
22h27
fn2o，354.5，90736-23-5；异丁酰芬太尼c
23h30
n2o，350.5，119618-70-1；4-氟丁酰芬太尼，c
23h29
fn2o，368.5，244195-32-2；四氢呋喃芬太尼，c
24h30
n2o2，378.5，2142571-01-3。
77.本发明中一种头发样本中芬太尼类药物标准物质的制备方法，步骤如下：
78.(1)采集未有违禁药物使用史的成人头发样本，将采集的头发样本使用纯水、色谱级甲醇各洗涤3次，室温下干燥后剪切成2cm小段。
79.(2)浸泡溶液制备：称量乙酰芬太尼，异丁酰芬太尼，对氟芬太尼，奥芬太尼，硫代芬太尼，4-氟丁酰芬太尼，四氢呋喃芬太尼，芬太尼和去甲基芬太尼9种芬太尼类药物置于容器中，加入蒸馏水和二甲基亚砜溶液，超声使之混合均匀，为药物-二甲基亚砜溶液。
80.采用gc-ms/ms对乙酰芬太尼，异丁酰芬太尼，对氟芬太尼，奥芬太尼，硫代芬太尼，4-氟丁酰芬太尼，四氢呋喃芬太尼，芬太尼和去甲基芬太尼这9种芬太尼类药物纯品原料进行定性分析，采用hplc-dad法对9种芬太尼类药物纯品原料进行纯度确定。
81.定性分析：确定原料为目标化合物；纯度分析：对原料进行筛选，避免因原料纯度过低而导致无法进行后续的定值分析；纯度分析的结果会影响制备头发标准物质中相关药物的定值结果。定性分析和纯度分析在制备标准物质时进行。可在制备标准物质前，先对原料进行定性分析和纯度检验。
82.浸泡溶液中，乙酰芬太尼，异丁酰芬太尼，对氟芬太尼，奥芬太尼，硫代芬太尼，4-氟丁酰芬太尼，四氢呋喃芬太尼和芬太尼的每种浓度不低于2mg/l，去甲芬太尼的浓度不低于1mg/l。芬太尼类药物、水和二甲基亚砜溶液的用量质量比为0.3：5：5。水为蒸馏水。二甲基亚砜溶液中含0.02mol/l盐酸。
83.(3)将空白的人体头发样本放入浸泡溶液中，浸泡一段时间后，将头发样本取出，使用足够体积的甲醇充分清洗。浸泡一段时间为7-25天，优化方案中浸泡时间为24天。头发标准物质制备浸泡时间的选择：在头发标准物质制备过程中采用由密到疏的原则，在6个不同的时间点分别取样，使用lc-ms/ms进行分析。当头发中的药物浓度达到最大值时，取出头
发样本，使用足够体积的甲醇充分清洗，以去除外部污染，以最后一次清洗液检测结果呈阴性为准。
84.(4)洗涤后的头发样本在真空干燥箱中干燥，干燥温度23-26℃，干燥时间45-52h；干燥后的头发样本使用球磨机研磨粉碎成深褐色粉末，粒径《5mm。
85.(5)粉碎后的头发样本在真空干燥箱中干燥23-25h，经混和仪混合23-25h，混匀后装瓶；
86.(6)制备好的芬太尼类药物头发标准物质置于20-30℃下避光保存。
87.另外，本发明中一种头发样本中芬太尼类药物标准物质的应用，步骤如下：
88.(1)提取头发标准物质中9种芬太尼类物质；提取为有机溶剂超声提取，提取温度为30℃～60℃、提取时间为10min～120min、液料比为25～250：1ml
·
g-1的盐酸酸度，即甲醇：hcl＝1:1～30:1。
89.进一步具体的，提取溶剂提取温度40℃，提取时间75min，液料比250：1(ml
·
g-1)，甲醇：盐酸＝15：1。提取温度，提取时间，液料比和甲醇：盐酸会影响提取药物的浓度。详见实施例3和附图14-22。采用优化好的前处理方法，在该条件下，头发样本中的药物浓度最高，提取回收率》90％。
90.(2)建立二次多项回归方程模型，确立头发样品最佳前处理条件；二次多项回归方程为：药物浓度(ng
·
mg-1)＝6.56-0.08a+0.11b+0.15c-0.02d-0.013ab-0.045ac-0.076bc+0.042bd-0.031cd-0.33a2-0.08b2-0.088c2-0.096d2，其中提取温度(a)、提取时间(b)、液料比(c)和甲醇/盐酸(d)；建立回归方程式是在样品前处理的步骤中。
91.响应面分析法是利用合理的实验设计方法结合实验得到一定的数据，采用多元二次回归方程来拟合因素与响应值之间的函数关系，通过对回归方程的分析来寻求最优工艺参数，解决多变量问题的一种统计方法。回归方程模型的建立是为了寻找头发样本的最佳前处理条件。
92.(3)提取液在40℃下氮气蒸发至干，残留物用甲醇复溶，15000xg下离心5min；
93.氮吹主要是起到将样品快速富集浓缩的作用。另一方面，药物提取液中含有盐酸，对质谱不友好。氮气吹干后，使用甲醇复溶，有利于保护质谱系统。氮吹可以保持样品的纯净，达到纯化的目的。
94.(4)取上清液经0.22μm微孔滤膜过滤；
95.(5)对过滤液进样分析：定性或定量分析，制备的头发标准物质中目标物的两对mrm离子对的色谱峰，保留时间与对照品溶液中相应化合物的色谱峰保留时间比较，若rsd《3.0％，则符合定性分析的要求，说明阳性结果正确可靠，制备的头发标准物质中含有9种芬太尼类药物。制备的头发标准物质中为全部含有9种芬太尼类药物。
96.其中：(1)定性：将检测样品(需要检测的目标头发(如吸毒者的头发))、头发标准物质与空白样品(无药物滥用史的人体头发)经过相同的前处理操作后，吸取样品提取液进样分析。采用gc-ms/ms或(和)lc-ms/ms进行定性分析。
97.gc-ms/ms法中，采用scan模式提取特征离子，根据保留时间和特征离子相结合进行定性分析，若检测样品中存在与头发标准物质相同的特征离子为2个及以上，保留时间rsd小于3.0％，而空白样本中只检测到内标物，未检测出特征离子，则说明检测样品中含有芬太尼类药物。
98.lc-ms/ms法，采用mrm模式，若检测样品中存在与头发标准物质相同的mrm离子对为2对或2对以上，保留时间rsd小于3.0％，而空白样品只检测出内标物的mrm离子对，未检出目标物mrm离子对，说明检测样品中含有芬太尼类药物。
99.采用gc-ms/ms和lc-ms/ms对制备的头发标准物质进行定性分析为了确保制备的头发标准物质中含有目标药物。因为在浸泡和清洗过程中药物可能未沉积到头发中或者沉积在头发中的药物结合较疏松，在清洗过程中被洗掉。
100.(2)定量：将检测样品与头发标准物质经过相同的前处理后，采用gc-ms/ms或/和lc-ms/ms进行定量分析。
101.gc-ms/ms法中，采用sim模式，根据检测样品与头发标准物质中目标物与内标物定量离子对的峰面积比值，采用单点校正法计算出检测样品中芬太尼类药物的质量浓度。(c＝a
×
c1/a1；c：检测样品中目标物的质量浓度，单位为ng
·
mg-1；a：检测样品中目标物与内标物的峰面积比值；c1：头发标准物质中目标物的质量浓度，单位为ng
·
mg-1；a1：头发标准物质中目标物与内标物的峰面积比值。lc-ms/ms法中，采用mrm模式，根据检测样品与头发标准物质中目标物与内标物定量离子对的峰面积比值，采用单点校正法计算出检测样品中芬太尼类药物的质量浓度。
102.具体的用以下实施例来进一步说明：
103.实施例1
104.芬太尼类药物纯品原料的定性分析和纯度确定。
105.乙酰芬太尼，异丁酰芬太尼，对氟芬太尼，奥芬太尼，硫代芬太尼，4-氟丁酰芬太尼，四氢呋喃芬太尼，芬太尼和去甲基芬太尼这9种芬太尼类药物纯品原料由公安部物证鉴定中心提供，经真空包装密封储存于4℃冰箱中。依据重量法，使用甲醇为溶剂，配制高浓度的单一标准溶液，置于冰箱中冷藏保存。在实验过程中，依据分析要求，使用甲醇稀释至所需浓度。
106.采用gc-ms/ms对9种芬太尼类药物纯品原料进行定性分析。仪器：安捷伦7890a-7000三重四级杆气质联用仪；色谱柱：db-5ms色谱柱(30m
×
0.25mm
×
0.25μm)；进样口温度：280℃；柱温：180℃(1min)-10℃/min-300℃(8min)；载气为氦气，纯度≥99.999％，流量:1.0ml/min；样品浓度：5ppm溶于甲醇，进样量1μl；分流进样，分流比：5:1；溶剂延迟时间3min。电子轰击电离源(ei)；电子能量70ev；离子源温度：230℃；接口温度：250℃；scan模式，扫描范围：m/z 50～450。其中去甲基芬太尼、乙酰芬太尼、对氟芬太尼、4-氟丁酰芬太尼、异丁酰芬太尼、芬太尼、硫代芬太尼、奥芬太尼的质谱图可与nist标准谱库相匹配，匹配率≥80％。但是在nist标准谱库中未检索到四氢呋喃芬太尼的标准质谱图，导致样品质谱图无法通过谱库匹配进行定性分析。通过谱图解析可知，四氢呋喃芬太尼质谱图中存在m/z 287，m/z 189和m/z 146的特征离子峰。其中m/z 287的离子丰度较高，是四氢呋喃芬太尼在ei源的轰击下，结构中的哌啶环n原子失去π电子形成游离基中心，诱导相邻碳原子发生α断裂，丢失卓鎓离子(m-91)而形成的特征离子。
107.采用hplc-dad法对9种芬太尼类药物纯品原料进行纯度确定。仪器：安捷伦1200高效液相色谱仪；色谱柱：zorbax bonus-rp色谱柱(4.6
×
250mm，5μm)；流速：1.0ml/min；柱温：30℃；进样量：2μl；流动相：0.02％氨水：乙腈梯度洗脱30min；检测波长：210nm。采用峰面积归一化法进行纯度检测。去甲基芬太尼纯度99.73％，乙酰芬太尼纯度99.80％，异丁酰
芬太尼纯度99.82％，对氟芬太尼纯度99.60％，奥芬太尼纯度99.29％，硫代芬太尼纯度99.62％，4-氟丁酰芬太尼纯度99.61％，四氢呋喃芬太尼纯度99.86％，芬太尼纯度99.80％。9种芬太尼类药物纯品原料的纯度均》99％。如图1-图10中所示。
108.表1 hplc梯度洗脱程序表
[0109][0110]
实施例2
[0111]
头发标准物质的制备。
[0112]
称量约30mg乙酰芬太尼，异丁酰芬太尼，对氟芬太尼，奥芬太尼，硫代芬太尼，4-氟丁酰芬太尼，四氢呋喃芬太尼，芬太尼和去甲基芬太尼9种芬太尼类药物置于1000ml瓶中。加入500ml蒸馏水，500ml二甲基亚砜溶液(含0.02mol/l盐酸)，超声5min使之混合均匀，冷却后将40g头发浸泡其中，室温下避光放置。在头发标准物质制备过程中分别于浸泡后的第7天、第15天、第20天、第22天、第24天、第25天取一部分样本使用lc-ms/ms进行分析。结果表明，在7-22天内，药物的含量随浸泡时间的增加而增加，当浸泡时间达到24天时，进入头发中的药物浓度最高。浸泡24天后，倒出浸泡液，头发用色谱级甲醇充分洗涤4次，保留第4次清洗液。清洗干净的头发标准物质按要求进行干燥、粉碎、混匀、装瓶。一共制备了200瓶头发标准物质，每瓶约100mg。制备好的芬太尼类药物头发标准物质置于25
±
5℃下避光保存。如图11-图12中所示。
[0113]
实施例3
[0114]
采用单因素实验结合响应面分析法优化头发样本的前处理过程。单因素实验方式为常规方式。
[0115]
在本实例中，结合9种芬太尼类药物的结构特点(如图1)，探讨了超高速离心(15000xg离心20min)和有机溶剂超声提取(甲醇超声提取20min)两种提取方法对药物浓度的影响，结果表明与超高速离心相比，超声提取，药物浓度较大。
[0116]
采用单因素变量法考察了不同的提取溶剂(甲醇、乙腈、酸化甲醇)对药物浓度的影响，结果表明，酸化甲醇超声提取，药物浓度最大，确定采用酸化甲醇进行超声提取。
[0117]
采用单因素变量法考察不同提取温度，不同提取时间，不同的液料比和不同的盐酸酸度对药物浓度的影响，初步确定了合理的实验各因素与水平，如表1和表2中内容。
[0118]
实验发现，头发中的药物浓度随着提取温度的增加而逐渐增加，当提取温度在40～50℃时，提取的药物浓度达到最大值，推测高温可能会破坏头发的结构，使头发中的其他物质一起溶出，竞争抑制了药物的提取。头发中的药物浓度随提取时间的增加而增加，当提取时间达到50min时，提取的药物浓度趋向稳定。提取溶剂的增加，有利于头发与溶剂充分接触，当提取溶剂达到4ml时，药物浓度基本不变。此外，盐酸的酸度也会影响药物的浓度，当甲醇：盐酸(v/v＝15:1)时，药物浓度达到最大值。
[0119]
在单因素实验的基础上，采用box-behnken设计-响应面法对样品前处理方法进行
了优化。响应面分析法，全称响应曲面设计方法(response surface methodology，rsm)，是利用合理的试验设计方法并通过实验得到一定数据，采用多元二次回归方程来拟合因素与响应值之间的函数关系，通过对回归方程的分析来寻求最优工艺参数，解决多变量问题的一种统计方法。
[0120]
与单因素变量法和正交实验相比，rsm考虑了实验过程中各因素间的相互作用和随机误差，可以对实验中的各个水平进行连续分析，可以有效地减少实验次数，提高实验效率。利用design-expert10软件，设计了四因素三水平实验，以头发中的药物浓度为评价依据，以提取温度(30℃～60℃)、提取时间(10min～120min)、液料比(25～250ml
·
g-1
)和甲醇/盐酸(甲醇：hcl＝1:1～30:1)为自变量，探讨头发中9种芬太尼类药物的最佳提取条件。拟合得到的药物浓度(ng
·
mg-1
)与提取温度(a)、提取时间(b)、液料比(c)和甲醇/盐酸(d)之间的二次多项回归方程为：药物浓度(ng
·
mg-1
)＝6.56-0.08a+0.11b+0.15c-0.02d-0.013ab-0.045ac-0.076bc+0.042bd-0.031cd-0.33a
2-0.08b
2-0.088c
2-0.096d2。
[0121]
所建立的模型中，f＝6.97，p＝0.0004《0.05，说明该模型具有显著性差异，准确可靠。由f检验可知，影响药物浓度的主要因素为提取时间》液料比》提取温度》甲醇/盐酸。
[0122]
响应面分析法是采用多元二次回归方程来拟合因素与响应值之间的函数关系，通过对回归方程的分析来寻求最优工艺参数，解决多变量问题的一种统计方法。回归方程模型的建立是为了寻找头发样本的最佳前处理条件，所以建立回归方程是必要的。
[0123]
利用design expert 10.0软件计算可知，制备的头发标准物质中9种芬太尼类物质的最佳提取方法为：提取溶剂：甲醇：盐酸(15：1)，液料比250：1(ml
·
g-1
)，提取温度40℃，提取时间75min。在该条件下，头发中芬太尼的浓度最大预测值为6.651ng
·
mg-1
。提取液在40℃下氮气蒸发至干，残留物用1200μl甲醇复溶，15000xg下离心5min，取上清液经0.22μm微孔滤膜过滤后进样分析。如图13-图22所示。
[0124]
表2 box-behnken设计响应面的分析因子和水平
[0125][0126]
表3响应面实验设计及结果
[0127][0128][0129]
实施例4
[0130]
头发标准物质的定性分析。
[0131]
本发明在单因素实验的基础上，采用box-behnken设计-响应面法对样品前处理方法进行优化。利用design-expert10软件，设计四因素三水平实验，以头发中的药物浓度为评价依据，以提取温度(30℃～60℃)、提取时间(10min～120min)、液料比(25～250ml
·
g-1
)
tm uplc hss t3(100mm
×
2.1mm，1.8μm，waters公司)；流动相a：10mmol/l乙酸铵(含0.1％甲酸)；流动相b：乙腈，梯度洗脱；流速：0.2ml/min；柱温：30℃；进样量：2μl；离子源：电喷雾电离-正离子模式(esi
+
)，温度：150℃；检测方式：多反应监测(mrm)；毛细管电压：1.52kv；脱溶剂气温度：600℃；脱溶剂气流速：800l/h；锥孔气流速：150l/h；结果表明，空白头发样本提取液和第4次清洗液只检测出了添加的内标物芬太尼-d5，未检测出9种芬太尼类化合物，制备的候选头发标准物质中检测出了9种芬太尼类化合物，排除了外部干扰。将制备的头发标准物质中目标物的两对定性离子对的色谱峰，保留时间与标准溶液中相应化合物的色谱峰保留时间比较，rsd均小于0.5％，符合定性分析的要求。说明阳性结果正确可靠，制备的头发标准物质中含有9种芬太尼类化合物。如图23-图29中所示。
[0138]
表5 lc-ms/ms梯度洗脱程序表
[0139][0140][0141]
表6 lc-ms/ms芬太尼类药物质谱参数
[0142][0143][0144]
*：定量离子
[0145]
表7对照品溶液与头发标准物质的保留时间表(lc-ms/ms)
[0146][0147]
实施例5
[0148]
芬太尼类药物头发标准物质的均匀性检验。
[0149]
采用lc-ms/ms和gc-ms/ms法对制备的头发标准物质进行均匀性检验。根据jjg 1343—2012《标准物质定值的通用原则及统计学原理》的要求，对制备的头发标准物质进行均匀性检验。从分装好的头发标准物质中随机抽取规定数目的样品瓶，采用lc-ms/ms和gc-ms/ms法测定每份样品中9种芬太尼类药物的含量，每个样品测定3次。采用f检验法判断标准物质的均匀性，若计算得到的f
测得值
小于f
0.05(组间自由度，组内自由度)
，则判断其均匀性合格。具体的步骤为从分装的200瓶头发样样品中随机抽取11瓶，每瓶各取3份样品，每个样品测定3次。将9种芬太尼类药物的定量结果与f
0.05(10,22)
＝2.30进行比较。若f测得值小于f
0.05(10,22)
＝2.30，则说明制备的头发标准物质均匀性良好。
[0150]
gc-ms/ms定量分析方法：在以上相同条件下，采用选择离子监测模式(sim)进行定量分析。第1组监测，5.5min-6.5min，监测m/z 120，159，175，83；第2组监测，11.5min-13.5min，监测m/z 231，146，188，279，176，280，245，146，93，189，280，263，164，220，259，189，277，207，250，151，194；第3组监测，15min-16min，监测m/z 287，189，146，158。芬太尼类药物的定量离子为：去甲基芬太尼：m/z 83；乙酰芬太尼：m/z 231；异丁酰芬太尼：m/z 259；对氟芬太尼：m/z 263；奥芬太尼：m/z 279；硫代芬太尼：m/z 146；，4-氟丁酰芬太尼：m/z 164；四氢呋喃芬太尼：m/z 287；芬太尼：m/z 245。采用内标工作曲线法进行定量分析，准确称取制备的头发标准物质(约100mg)，加入等量的芬太尼-d5内标溶液(5.0ng
·
mg-1
，100μl)，按以上步骤进行前处理，采用gc-ms/ms进行分析，每份样品测定3次。根据各样品中目标物与内标定量离子对的峰面积比值，按照公式计算出制备的头发标准物质中目标物的质量浓度。lc-ms/ms定量分析方法：在测定条件下，采用多反应监测模式(mrm)进行定量分析。根据内标工作曲线法进行定量分析，准确称取制备的头发标准物质(约20mg)，加入等量的芬太尼-d5内标溶液(1.0ng
·
mg-1
，100μl)，按上述方法进行前处理，采用lc-ms/ms进行分析，每份样品测定3次。根据各样品中目标物与内标定量离子对的峰面积比值，按照公式计算出
制备的头发标准物质中目标物的质量浓度。
[0151]
结果表明，gc-ms/ms中，9种芬太尼类药物的f
测得值
《f
0.05(10,22)
＝2.30；lc-ms/ms中，9种芬太尼类药物的f
测得值
《f
0.05(10,22)
＝2.30，制备的头发标准物质均匀性符合要求。
[0152]
表8 9种芬太尼类药物均匀性检验结果
[0153][0154][0155]
实施例6
[0156]
芬太尼类药物头发标准物质的定值分析。
[0157]
芬太尼类药物头发标准物质中9种芬太尼类化合物含量的定值由单一实验室采用lc-ms/ms和gc-ms/ms 2种方法对各化合物的含量进行定值。由均匀性检验结果可知，制备的头发标准物质中9种芬太尼类药物的含量为：1.491-6.459ng
·
mg-1
。
[0158]
实施例7
[0159]
芬太尼类药物头发标准物质的稳定性检验。
[0160]
芬太尼类药物头发标准物质的稳定性检验包括60℃避光14天短期稳定性实验和25℃
±
5℃避光12个月长期稳定性检验。以检测时间为自变量，以头发标准物质中9种芬太尼类药物的含量为因变量进行线性回归，计算拟合直线的斜率(b1)、截距(b0)、标准偏差(s)和斜率不确定度s
(b1)
。若b1《t
·s(b1)
，表明直线斜率不显著，制备的头发标准物质稳定性良好。
[0161]
短期稳定性实验：在高温条件(60℃)下考察制备的标准物质的短期稳定性。使用lc-ms/ms考察制备的头发标准物质于0、1、3、5、7、14天内的稳定性。每次随机抽取3瓶样品，
每个瓶子取一个子样(约20mg)，进行前处理，采用lc-ms/ms进行分析，每个样品测定3次，计算平均值，把3个瓶子的测量结果平均值作为检测结果。
[0162]
长期稳定性实验：在常温储存条件(25℃
±
5℃)下考察标准物质的长期稳定性，使用lc-ms/ms考察制备的头发标准物质在0、1、2、3、5、12个月内的稳定性。
[0163]
实施例8
[0164]
gc-ms/ms法方法学验证
[0165]
检出限和定量限：在空白头发中加入一系列低浓度的9种芬太尼类药物混标溶液，进行gc-ms/ms分析，通过3倍信噪比和10倍信噪比确定检测限(limit ofdetection，lod)和定量限(limit ofquantitation，loq)，9种药物的检测限和定量限如下表。结果表明，gc-ms/ms法中，当9种芬太尼类药物的浓度为0.02～0.05ng
·
mg-1
时，s/n值》3，各个化合物的特征离子峰值明显；当9种芬太尼类药物的浓度为0.08～0.20ng
·
mg-1
时，s/n值》10，符合定量分析要求。
[0166]
线性与范围：预先配制一系列浓度不同的标准溶液，向标准溶液加入等量的芬太尼-d5内标溶液，组成混合标准溶液进行分析。每个浓度水平平行测定3次，以目标物与内标定量离子对的峰面积比(y)为纵坐标、目标物质量浓度(x)为横坐标进行线性回归，绘制标准曲线。结果表明，gc-ms/ms中，9种芬太尼类药物在0.5～5.0ng
·
mg-1
浓度范围内线性关系良好，相关系数》0.999，在标准曲线的最低浓度点时，9种药物的信噪比》80，符合定量分析的要求。
[0167]
日内和日间精密度实验：制备头发提取液，采用gc-ms/ms进行定量分析，连续进样测定6次，计算日内精密度。结果表明，rsds《2.0％(n＝6)。连续测定5天，日间精密度为rsds《3.0％(n＝30)，说明建立的gc-ms/ms方法重复性良好，符合分析要求。
[0168]
稳定性实验：将头发提取液在室温下储存，并在制备后的不同时间(1、24、48、72、96小时)进样，评估样品的稳定性。结果表明，rsds《15％，芬太尼类药物头发提取液在室温下96小时内具有良好的稳定性。
[0169]
回收率和基质效应：准确称取9份空白头发样本(每份约100mg)，按照低(1ng
·
mg-1
)、中(2ng
·
mg-1
)、高浓度水平(3ng
·
mg-1
)，分别加入芬太尼类药物，使用loctrl、medctrl和hictrl(n＝3)确定回收率。采用gc-ms/ms进行定量分析，每个样品重复测定3次，记录峰面积值，按照回归方程，计算不同浓度下的回收率。结果表明，9种芬太尼类药物的回收率在86.92％～121.8％范围内，rsds≤3.0％(n＝9)。
[0170]
通过分析低、高浓度的标准溶液在空白头发基质和纯甲醇溶液中得到的峰面积之比来评价基质效应。(me％＝(a/b-1)*100％，a：样品在头发基质中的峰面积；b：样品在甲醇中的峰面积；meis％＝(c/d-1)*100％，c：内标在头发基质中的峰面积；d：内标在甲醇中的峰面积)。结果表明，gc-ms/ms中基质效应小于15％，rsd《10％，符合分析要求。
[0171]
表9芬太尼类药物的lod和loq值(gc-ms/ms)
[0172][0173]
表10芬太尼类药物的线性与范围(gc-ms/ms)
[0174][0175]
表11芬太尼类药物的重复性实验结果(gc-ms/ms)
[0176][0177]
表12芬太尼类药物的稳定性实验结果(gc-ms/ms)
[0178][0179]
表13芬太尼类药物的回收率与基质效应(gc-ms/ms)
[0180]
[0181][0182]
实施例9
[0183]
lc-ms/ms法方法学验证
[0184]
检出限和定量限：通过3倍信噪比和10倍信噪比确定检测限和定量限。结果表明，lc-ms/ms中，9种芬太尼类药物的检测限为0.05～0.10pg
·
mg-1
，定量限为0.25～0.50pg
·
mg-1
，表明仪器灵敏度较好。该方法的检出限远低于《涉毒人员毛发样本检测规范》中规定的阈值，符合毛发中毒品的检测要求。
[0185]
线性与范围：预先配制一系列浓度不同的6种标准溶液，向标准溶液加入等量的芬太尼-d5内标溶液，组成混合标准溶液进行分析，采用内标工作曲线法进行定量分析。结果表明，lc-ms/ms中，芬太尼类物质在3.0～220.0pg
·
mg-1
浓度范围内线性关系良好，相关系数》0.999，符合分析要求。
[0186]
日内和日间精密度实验：采用lc-ms/ms进行定量分析，连续进样测定6次，计算日内精密度。结果表明，rsds《5.0％(n＝6)。连续测定5天，日间精密度为rsds《9.0％(n＝30)，说明建立的lc-ms/ms方法重复性良好，符合分析要求。
[0187]
稳定性实验：将头发提取液在室温下储存，并在制备后的不同时间(1、24、48、72、96小时)进样，评估样品的稳定性。结果表明，rsds《9.0％，芬太尼类药物头发提取液在室温下96小时内具有良好的稳定性。
[0188]
回收率和基质效应：准确称取9份空白头发样本(每份约20mg)，按照低(10pg
·
mg-1
)、中(50pg
·
mg-1
)、高浓度水平(100pg
·
mg-1
)，分别加入芬太尼类药物，每个浓度平行配制3份。使用loctrl、medctrl和hictrl(n＝3)确定回收率。采用lc-ms/ms进行分析，按照回归方程，计算不同浓度下的回收率。结果表明，9种芬太尼类药物的回收率在84.02％～112.2％范围内，rsds≤3.0％(n＝9)。基质效应小于15％，rsd《15％，符合分析要求。通过分析低、高浓度的标准溶液在空白头发基质和纯甲醇溶液中得到的峰面积之比来评价基质效应。结果表明，lc-ms/ms中基质效应《15％，rsd《10％，符合分析要求。
[0189]
表14芬太尼类药物的lod和loq值(lc-ms/ms)
[0190][0191]
表15芬太尼类药物的线性与范围(lc-ms/ms)
[0192][0193][0194]
表16芬太尼类药物的重复性实验结果(lc-ms/ms)
[0195][0196]
表17芬太尼类药物的稳定性实验结果(lc-ms/ms)
[0197][0198]
表18芬太尼类药物的回收率与基质效应(lc-ms/ms)
[0199]
[0200][0201]
实施例10
[0202]
头发标准物质中9种芬太尼类药物含量定值结果的不确定度评定。
[0203]
不确定度分量来自hplc-dad法纯度测定不确定度、gc-ms/ms法定值不确定度、lc-ms/ms法定值不确定度、标准物质均匀性引入的不确定度、标准物质稳定性引入的不确定度。对头发标准物质中9种芬太尼类药物的不确定度分量分别进行评定，计算标准不确定度和扩展不确定度。
[0204]
上述实施/试验例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。