一种育苗生产中裙带菜幼体发育过程的精准观察方法与流程

1.本发明涉及裙带菜养殖技术领域，具体涉及一种育苗生产中裙带菜幼体发育过程的精准观察方法。


背景技术：

2.裙带菜(undaria pinnatifida w.f.r suringar,1873)，又称和布、若布，属褐藻门(phaeophyta)、褐藻纲(phaeophyceae)、海带目(laminariales)、翅藻科(alariaceae)、裙带菜属(undaria)藻类。裙带菜被民间称誉为长寿菜，营养丰富，经济价值高，同时裙带菜栽培对维护近海海域生态健康具有关键作用。裙带菜是我国三大养殖经济海藻之一，养殖年产量约20万吨干品。目前裙带菜种苗培育方法为全人工育苗。育苗生产中，裙带菜繁殖器官孢子囊在育苗池中释放游孢子。用显微镜检测育苗池海水中游孢子密度，100倍镜下每视野达到100个～200个游孢子时，将裙带菜孢子囊网袋取出，随即将苗种帘平铺于池水中，同时将载玻片悬吊于池水中。100倍显微镜下，载玻片上胚孢子密度达到60-120个/视野时，将苗种帘移到其它育苗池中，进入育苗管理。
3.育苗管理过程中，每天剪取苗帘绳小段，显微镜或解剖镜下观察胚孢子或胚孢子发育成的配子体或幼孢子体的状态，并据此进行育苗管理，包括光照强度、营养盐使用量、流水量调节等。但显微镜下观察苗帘绳上的裙带菜幼体时，由于苗帘绳不透明且表面粗糙不平，处于胚孢子或配子体期的裙带菜幼体附着在苗帘绳上，难以清晰观察，只能对裙带菜幼体的发育情况粗略判断；而解剖镜放大倍数不够，只适合观察发育到幼孢子体期个体较大的裙带菜幼体，不适合观察前期幼体的状态和发育程度。同时，每天观察后的苗帘绳都废弃掉，次日剪取新苗帘绳观察，因此每天观察的都是不同的胚孢子、配子体或幼孢子体。所以生产中难以对裙带菜幼体胚孢子和配子体阶段的发育情况准确把握。
4.准确观察胚孢子逐步发育成配子体、继而发育成卵囊或精囊、释放生殖细胞的过程和达到某一发育节点的时间，对把控育苗管理过程、适时调整育苗光照和施肥等条件，保证育苗成功具有重要生产意义。因此，裙带菜人工育苗生产中急需精准观察幼体发育过程的方法。


技术实现要素：

5.针对上述现有技术，本发明的目的是提供一种育苗生产中裙带菜幼体发育过程的精准观察方法。本发明通过将游孢子液添加到盖有载玻片的血球计数板中，使有限个游孢子进入计数池中发育为胚孢子，利用血球计数板、计数池及计数池内大方格的网格对胚孢子定位并进行编号后，将血球计数板悬吊于育苗池中，可用显微镜持续准确观察编号的胚孢子的生长发育情况。根据胚孢子的生长发育情况确定育苗生产的光照、营养盐、流水等条件。
6.为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
7.本发明的第一方面，提供一种育苗生产中裙带菜幼体发育过程的精准观察方法，
包括以下步骤：
8.(1)取育苗生产中的裙带菜游孢子液，用消毒海水稀释摇匀，5min中内注入盖有盖玻片的血球计数板的计数池中；
9.(2)在计数池中游孢子发育为胚孢子后，显微镜观察，用血球计数板号、计数池号及计数池内大方格的网格位置给胚孢子定位并进行编号；取下盖玻片，将血球计数板悬吊于与血球计数板上胚孢子同一批次的裙带菜幼体的池水中，每天观察血球计数板上标记的裙带菜幼体的发育状态和发育阶段，并据此进行生产管理。
10.本发明所用血球计数板购自上海市求精生化试剂仪器有限公司，型号规格为xb-k-25，0.10mm，1/400mm2。
11.优选的，步骤(1)中，所述游孢子液的浓度达到100
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显微镜下每视野100个～200个游孢子时，用煮沸并冷却后的砂滤海水稀释游孢子液。
12.优选的，步骤(1)中，所述消毒海水稀释的倍数为10～20倍。
13.优选的，步骤(2)中，所述游孢子发育为胚孢子的培养为：将血球计数板在低于1000lx、气温16-18℃环境中平置1-2小时。
14.优选的，步骤(2)中，每个育苗池中悬挂2个血球计数板。
15.本发明的第二方面，提供上述精准观察方法在裙带菜育苗生产中的应用。
16.本发明的有益效果：
17.本发明解决了育苗生产中裙带菜幼体前期发育状态难以准确观察的问题。常规育苗管理过程中，每天剪取苗帘绳小段，显微镜或解剖镜下观察胚孢子或胚孢子发育成的配子体或幼孢子体的状态，并据此进行育苗管理，包括光照强度、营养盐使用量、流水量调节等。但显微镜下观察苗帘绳上的裙带菜幼体时，由于苗帘绳不透明且表面粗糙不平，处于胚孢子或配子体期的裙带菜幼体附着在苗帘绳上，难以清晰观察，只能对裙带菜幼体的发育情况粗略判断；而解剖镜放大倍数不够，只适合观察发育到幼孢子体期个体较大的裙带菜幼体，不适合观察前期幼体的状态和发育程度。同时，每天观察后的苗帘绳都废弃掉，次日剪取新苗帘绳观察，因此每天观察的都是不同的胚孢子、配子体或幼孢子体。所以生产中难以对裙带菜幼体胚孢子和配子体阶段的发育情况准确把握，因此难以对裙带菜育苗生产进行精准管理。本发明中血球计数板上定位的裙带菜幼体与生产中苗帘绳上的裙带菜幼体为一个批次，且在相同条件下生长发育，因此生长发育同步，可代表裙带菜苗种帘上的裙带菜幼体。血球计数板上定位的裙带菜幼体便于在育苗期持续显微镜下准确观察，可为育苗管理提高精确信息。
18.(2)本发明中，裙带菜胚孢子在血球计数板计数池的网格面上附着，附着点多位于网格线上，胚孢子及后续发育成的配子体和孢子体在血球计数板上稳固不易脱落，便于长期持续观察。
19.(3)本发明的方法简单有效，高效的实现裙带菜幼体的生长观察，解决了生产中难以对裙带菜幼体发育情况准确把握的问题，在裙带菜养殖中具有推广意义。
附图说明
20.图1：7天时裙带菜配子体的显微镜照片；
21.图2：68天时裙带菜配子体的显微镜照片；
22.图3：70天时裙带菜配子体的显微镜照片；
23.图4：73天时裙带菜配子体的显微镜照片；
24.图5：82天时裙带菜幼体的显微镜照片
25.注：圈内为裙带菜的幼体。
具体实施方式
26.应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本技术提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本技术所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
27.为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本技术的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本技术的技术方案。
28.本发明实施例中所用的试验材料均为本领域常规的试验材料，均可通过商业渠道购买得到。
29.实施例
30.1、2021年6月18日，取6个血球计数板，分别标记1、2、3、4、5、6号。每个血球计数板两个计数池分别标记a、b，分别盖上盖玻片。
31.2、在裙带菜用苗种帘采苗时，采集游孢子液，在100
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显微镜下检测游孢子密度，每视野160个游孢子。
32.3、取游孢子液10ml，用灭菌冷却后的砂滤海水稀释16倍，摇匀，2分钟内，分别用移液枪取游孢子液注入每个盖有载玻片的血球计数板h形凹槽内，游孢子液进入盖玻片与血球计数板之间的计数池空间中。用滤纸吸走盖玻片周围多余液体。
33.4、血球计数板平置于光照220lx，气温17℃试验室操作台上，1小时后显微镜下观察血球计数板。选择1、2、3、4、5、6号血球计数板a、b计数池大方格内网格线上附着的胚孢子进行标记编号。采集游孢子1.5h后，育苗池中苗种帘完成采苗并转移到培育池中。此时，移走1、2、3、4、5、6号血球计数板上盖玻片。在三个苗种培育池悬吊苗种帘的竹竿上分别悬吊2个血球计数板，将苗种帘和血球计数板都放置于育苗池中进行培育。每日显微镜下观察血球计数板上标记的裙带菜幼体生长发育情况，同时以苗帘绳上显微镜下大致观察的裙带菜幼体生长发育情况作为参考，准确判定裙带菜幼体发育阶段和状态，及时调整光照等条件，取得较好的裙带菜育苗效果。
34.第1个血球计数板a计数池中间大方格内第1号裙带菜幼体的发育状态如下：
35.图1：6月25日，7天时，处于配子体生长期的裙带菜配子体。
36.图2：8月25日，68天，处于成熟期的配子体。
37.图3：8月27日，70天，处于成熟期的配子体。
38.图4：8月30日，73天，处于成熟期的配子体。
39.第2个血球计数板a计数池大方格内裙带菜幼体的82天发育状态：图5。
40.以上所述仅为本技术的优选实施例而已，并不用于限制本技术，对于本领域的技术人员来说，本技术可以有各种更改和变化。凡在本技术的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本技术的保护范围之内。