通过引入离子液体提高蛋白质SERS信号强度的方法

通过引入离子液体提高蛋白质sers信号强度的方法
技术领域
1.本发明属于表面增强拉曼光谱技术领域，涉及一种通过引入离子液体提高蛋白质sers信号强度的方法。


背景技术：

2.表面增强拉曼散射(surface enhancement raman scattering,sers)作为一种高灵敏度光谱技术，已广泛应用于研究生物分子在固体表面的界面行为。通过化学增强和物理增强机理增强待分析物质的信号，可在分子水平得到关于物质结构的丰富信息。但是，待分析物质的sers信号极其依赖于sers基底的物理化学性质。使用sers对生物蛋白进行痕量检测时，如何建立一种只需微量蛋白即可产生高强度信号的检测体系是当前研究的难点。
3.传统的关于加强sers信号的研究主要聚焦于优化活性基底，例如使用贵金属如金、银纳米颗粒进行修饰，得到表面覆盖型或球核型基底，从而提高电磁场增强的效果。然而当蛋白分子与活性基底之间的相互作用较弱时，优化基底本身对sers信号的增强效果并不理想。因此，如何加强蛋白分子与活性基底间的作用，增大体系的极化率进而增强sers效应仍然是亟需解决的难题。
4.离子液体作为一种盐类物质，具有独特的物理化学性能，包括可调节的化学结构、热稳定性和化学稳定性、优异的离子电导率等。bai等人在两相液-液体系中成功合成了手性离子液体单层稳定的金纳米粒子，其在空气/水界面处可自组装成环状结构。手性离子液体的分子结构对金纳米颗粒环状结构的形成有着重要的影响。金纳米粒子自组装形成的聚集的环状结构作为sers基底，极大地增强了罗丹明6g(r6g)的信号强度(bai x,li x,zheng l.chiral ionic liquid monolayer-stabilized gold nanoparticles:synthesis,self-assembly,and application to sers[j].langmuir,2010,26(14):12209
–
12214.)。


技术实现要素：

[0005]
本发明的目的在于提供一种通过引入离子液体提高蛋白质sers信号强度的方法。该方法通过引入离子液体，增强蛋白质分子与活性基底间的相互作用，并改善电子转移能力，从而改善sers性能和检测灵敏度。
[0006]
实现本发明目的的技术方案如下：
[0007]
通过引入离子液体提高蛋白质sers信号强度的方法，包括以下步骤：
[0008]
(1)通过电化学阳极氧化法在洁净钛片表面合成具有三维立体管状结构的二氧化钛纳米管阵列；
[0009]
(2)将待检蛋白、离子液体[p
6,6,6,14
][fua]充分溶解于缓冲溶液中得到均匀的混合溶液，再将二氧化钛纳米管阵列浸没于混合溶液中，取出后干燥用于sers检测。
[0010]
优选的，步骤(1)中，二氧化钛纳米管阵列采用现有的电化学阳极氧化法制备，具体步骤如下：
[0011]
(a)将洁净的钛片作为阳极，铂片作为阴极，以添加腐蚀剂氟化铵和去离子水的乙
for lithium-ion batteries[j].physical chemistry chemical physics,2017,19(25):16721
–
16730】和【lee j y,selfridge k m,kohn e m,etal.effects of ionic liquid alkyl chain length on denaturation of myoglobin by anionic,cationic,and zwitterionic detergents[j].biomolecules,2019,9(7):264.】。
[0030]
实施例1
[0031]
步骤1，制备tio2纳米管阵列，具体包括如下步骤：
[0032]
采用电化学阳极氧化法制备tio2纳米管阵列，电解液主要溶剂是乙二醇，添加1wt％的去离子水以及0.2wt％的氟化铵作为腐蚀剂。阳极为洁净的钛片。阴极选择铂片做电极。打开电源并采用变电压法，先在较小的5v电压下反应12h，再开始增加电压到35v电压下，继续反应12h。最后将制备得到的tio2纳米管阵列放入到去离子水中，超声清洗10min，去除纳米管表面在腐蚀时候残留的覆盖层，得到均匀表面干净的tio2纳米管阵列，氮气吹干后进行500℃高温烧结保温2h以促进结晶化，自然降温至60℃取出，裁剪成1cm x 1cm的tio2纳米管阵列。
[0033]
步骤2，以tio2纳米管阵列制备含有离子液体的sers活性基底，具体包括如下步骤：
[0034]
将33.6mg细胞色素c加入10ml ph＝7.2的磷酸盐缓冲溶液中，再加入0.01g的离子液体[p
6,6,6,14
][fua]，50khz超声震荡15min，得到混合均匀的离子液体和细胞色素c缓冲液的混合溶液。然后将tio2纳米管阵列基底浸没于混合溶液中，在4℃条件下保存12h后取出。使用ph＝7.2的磷酸盐缓冲溶液冲洗tio2纳米管阵列基底三次后氮气吹干，得到含有离子液体的sers活性基底。
[0035]
对比例1
[0036]
本对比例改变离子液体的引入方式，其余与实施例1相同。具体包括如下步骤：
[0037]
步骤1同实施例步骤1。
[0038]
步骤2，制备表面固载有离子液体的tio2纳米管阵列，具体包括如下步骤：
[0039]
将0.01g的离子液体[p
6,6,6,14
][fua]加入到60ml乙醇中，50khz超声震荡20min确保其完全溶解。将tio2纳米管阵列浸入离子液体的乙醇溶液，在60℃下油浴加热24h，随后将tio2纳米管阵列置于真空干燥箱内，在35℃条件下干燥12h，确保乙醇完全挥发，得到表面固载有离子液体的tio2纳米管阵列。
[0040]
步骤3，制备sers活性基底，具体包括如下步骤：
[0041]
将33.6mg细胞色素c加入10ml ph＝7.2的磷酸盐缓冲溶液中超声50khz震荡15min，得到混合均匀的细胞色素c缓冲液。将表面固载有离子液体的tio2纳米管阵列浸没于混合溶液中，在4℃条件下保存12h后取出。使用ph＝7.2的磷酸盐缓冲溶液冲洗tio2纳米管阵列基底三次后，氮气吹干，得到表面固载有离子液体的tio2纳米管阵列sers活性基底。
[0042]
对比例2
[0043]
本对比例基本同实施例1，不同之处在于不引入离子液体，仅由tio2纳米管阵列和细胞色素c组成sers活性基底。
[0044]
表面拉曼增强散射实验：
[0045]
以实施例1、对比例1、对比例2制备得到sers活性基底进行细胞色素c的拉曼增强实验，具体包括如下步骤：
[0046]
步骤1：分别将实施例1、对比例1、对比例2制备得到sers活性基底(1cm x 1cm)黏附在洁净载玻片上，在拉曼光谱仪(raman spectrometer,horiba jobin yvon)上进行拉曼增强实验；
[0047]
步骤2：设定激光波长为532nm，激光功率5mw，曝光时间20s，循环次数2次，测试范围900-1800cm-1
；
[0048]
步骤3：在多个样品位置进行四次测量避免误差。
[0049]
图4是实施例1、对比例1、对比例2为活性基底得到的sers信号图谱。从图4中可以看出细胞色素c的拉曼光谱的分配和波段位置，光谱特征峰的υ4(a
1g
)模式在1364cm-1
和υ
10
(b
1g
)模式在1637cm-1
处对应的氧化原生状态细胞色素c，指示在将离子液体引入研究体系后，细胞色素c分子在各个基底上(实施例1、对比例1、对比例2)依旧保有良好生物活性，这也证明了本研究中使用的离子液体[p
6,6,6,14
][fua]的生物相容性。和对比例2相比，实施例1上细胞色素c的信号强度明显增强，说明了离子液体的存在确实提高了sers性能。实施例1中，cyt c的最强峰主要为1172cm-1
的υ
30
(b
2g
)模式、1314cm的υ
22
(a
2g
)模式、1407cm-1
的υ
29
(b
2g
)模式和1586cm-1
的υ
19
(a
2g
)模式，分别对应半环、c-h、四分之一环和c-c键的振动，与对比例1的实验结果相一致。
[0050]
此外，对比例1的信号增强效果没有实施例1好，说明将离子液体固载在tio2纳米管阵列表面并不是离子液体引入的最好方式。从图4中可以看出，对比例1的信号强度、关键位置峰谷起伏都不如实施例1。
[0051]
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应该视为本发明的保护范围。