金银花叶指纹图谱建立的方法及其指纹图谱与流程

1.本发明属于中药材的指纹图谱技术领域，涉及一种金银花叶指纹图谱建立的方法及其指纹图谱。


背景技术：

2.中药材指纹图谱是指中药材经过适当处理后，采用一定的分析手段和检测仪器得到的，能够标识该中药材特性的图谱，它是现阶段可以较全面地反应中药材内在质量的最有效的手段之一。
3.金银花叶为忍冬科植物忍冬lonicera japonica thunb.的干燥叶，具有清热解毒，疏散风热的作用，归肺、心、胃经；多用于热毒血痢，风热感冒；主产于河南、山东、四川、贵州等地，其种类繁杂，按属性可分为：忍冬lonicera japonica thunb.、红腺忍冬lonicera hypoglauca miq.、毛萼忍冬lonicera confusa dc.或毛花柱忍冬lonicera dasystyla rehd.等。其中以忍冬应用最为广泛，为我国地方特色用药。本品含有较多的化学成分，以黄酮类、有机酸类、环烯醚萜苷类等为主；根据现代药理研究表明，金银花叶具有较强的抗菌、抗病毒、保肝等药理作用。绿原酸、木犀草苷是金银花叶的主要成分，含量较高。在金银花叶中化学成分与金银花相似的情况下，可考虑作为金银花的替代品，最大程度节约药材资源。本文通过研究金银花叶质量标准，并采取hplc法，建立金银花叶的指纹图谱，为金银花叶的开发利用、科学鉴定和质量控制提供依据。
4.中国专利申请cn 105842373 a公开了一种建立金银花的药物制剂的指纹图谱的方法。该方法，以金银花配方颗粒为检测对象，建立了针对该药物制剂的指纹图谱的方法，获得了较为全面的图谱信息，确认了共有特征峰1号峰新绿原酸、2号峰绿原酸、3号峰隐绿原酸、4号峰芦丁、5号峰木犀草苷、6号峰、7号峰异绿原酸a和8号峰异绿原酸c，选择2号峰绿原酸作为内参考峰，确定了金银花配方颗粒的共有特征峰的相对保留时间，且结合该指纹图谱中多个色谱峰的信息，能够实现其质量检测和控制。文献：山东道地药材金银花hplc指纹图谱研究[j].山东中医药大学学报,2008.中公开了一种金银花hplc指纹图谱测定方法，建立山东金银花药材hplc标准指纹图谱。通过对山东各产区的金银花样品进行指纹图谱相似度计算和匹配分析研究，归纳出8批样品的hplc指纹图谱具有36个共有的特征指纹峰，其中19个共有指纹峰的总面积占总峰面积的90％以上，其中标定了绿原酸、木犀草苷、芦丁、槲皮素、咖啡酸5个已知指纹峰。然而上述两种指纹图谱均研究金银花，未对该植物的其他部位进行指纹图谱研究；且公开的指纹图谱分离的成分相对较少，指纹图谱信息不全面，质量控制也不完善。
[0005]
因此，有必要探索一种重复性、稳定性、精密度高，专属性强的金银花叶指纹图谱建立的方法。


技术实现要素：

[0006]
本发明针对现有技术存在的问题，提供了一种金银花叶药材指纹图谱建立的方法
及其指纹图谱，利用该图谱可监控金银花叶药材的质量及鉴别真伪。
[0007]
为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：
[0008]
提供了一种金银花叶指纹图谱建立的方法，包括如下步骤：对照品溶液的制备、供试品溶液的制备、hplc检测、标准指纹图谱的制定、指纹图谱的质量控制、聚类分析。
[0009]
进一步地，所述对照品溶液的制备包括以下步骤：
[0010]
(1)将绿原酸、咖啡酸、芦丁、金丝桃苷、木犀草苷混合，加入甲醇溶液溶解、摇匀，即得混合对照品溶液；
[0011]
(2)将绿原酸、咖啡酸、芦丁、金丝桃苷、木犀草苷分别于溶剂中溶解、摇匀，制得绿原酸溶液、咖啡酸溶液、芦丁溶液、金丝桃苷溶液、木犀草苷溶液。
[0012]
进一步地，步骤(1)中所述混合对照品溶液中绿原酸、咖啡酸、芦丁、金丝桃苷、木犀草苷的浓度分别为：0.125-0.130mg/ml，0.110-0.115mg/ml，0.120-0.125mg/ml，12-13μg/ml，86-87μg/ml。
[0013]
进一步地，步骤(2)中所述绿原酸溶液的浓度为0.110-0.115mg/ml，咖啡酸溶液的浓度为0.150-0.160mg/ml、芦丁溶液的浓度为0.145-0.150mg/ml、金丝桃苷溶液的浓度为0.100-0.110mg/ml、木犀草苷溶液的浓度为0.180-0.185mg/ml。
[0014]
进一步地，所述供试品溶液的制备包括以下步骤：
[0015]
(1)在金银花叶粉末中加入甲醇溶液并进行超声处理得到溶液a；
[0016]
(2)将溶液a进行冷却、过滤，所得滤液挥发至干得到产物b；
[0017]
(3)将产物b中加入甲醇溶液过滤。
[0018]
进一步地，步骤(1)、(3)中所述甲醇溶液中甲醇的体积分数为60-80％。
[0019]
进一步地，步骤(1)中所述超声时间为60-90min。
[0020]
进一步地，步骤(3)中所述过滤使用的微孔滤膜的尺寸为0.4-0.5μm。
[0021]
进一步地，所述hplc检测中流动相为乙腈和甲酸溶液，所述甲酸溶液中甲酸的体积分数为0.4-0.6％。
[0022]
进一步地，所述流动相的洗脱程序为：0-15min，乙腈体积分数为10％
→
20％；15-30min，乙腈体积分数为20％
→
20％；30-40min，乙腈体积分数为20％
→
30％；该程序意思是：在0min的时候乙腈占10％，甲酸溶液占90％，到15min的时候乙腈a占20％，甲酸溶液占80％，依次类推，15-30min、30-40min也分别如此。
[0023]
进一步地，所述hplc检测中检测波长为330-370nm，柱温为30-40℃，进样量8-15μl。
[0024]
进一步地，上述所述方法建立的金银花叶指纹图谱。
[0025]
在具体的实施方式中：
[0026]
(1)对照品溶液的制备：
[0027]
精密称取绿原酸、咖啡酸、芦丁、金丝桃苷、木犀草苷，置于100ml同一棕色容量瓶中，加入80％体积分数的甲醇溶液溶解定容，摇匀，制得含绿原酸0.1286mg/ml、咖啡酸0.1140mg/ml、芦丁0.1210mg/ml、金丝桃苷12.348μg/ml、木犀草苷86.700μg/ml的混合对照品溶液。再精密称取上述5种对照品，分别置于5个100ml棕色容量瓶中，加入80％体积分数的甲醇溶液溶解定容，摇匀，分别制得绿原酸0.1102mg/ml、咖啡酸0.1563mg/ml、芦丁0.1499mg/ml、金丝桃苷0.1077mg/ml、木犀草苷0.1815mg/ml的对照品溶液。
[0028]
(2)供试品溶液的制备：
[0029]
精密称定金银花叶药材粉末(过四号筛)1g于锥形瓶中，精密加入80％体积分数的甲醇溶液50ml，称定重量，超声(240w，40khz)处理1h称定重量，用80％体积分数的甲醇溶液补足减失的重量，摇匀，滤过，精密量取20ml样品溶液挥发至干，再用80％体积分数的甲醇溶液定容至5ml容量瓶中，并经微孔滤膜(0.45μm)滤过，即得供试品溶液。
[0030]
(3)hplc检测：
[0031]
吸取上述步骤(2)所得供试品溶液10μl，注入高效液相色谱仪中进行高效液相色谱检测，记录40min内的指纹图谱。
[0032]
色谱条件为：zorbax sb-phenyl色谱柱(250
×
4.6mm，5μm)；流动相：乙睛(a)、0.5％体积分数的甲酸溶液(b)，洗脱程序(0-15min，乙腈体积分数为10％
→
20％；15-30min，乙腈体积分数为20％
→
20％；30-40min，乙腈体积分数为20％
→
30％)；检测波长350nm；柱温35℃；进样量10μl。
[0033]
(4)以绿原酸为参照峰的标准指纹图谱的制定：
[0034]
吸取所得的混合对照品溶液、供试品溶液各10μl，分别注入高效液相色谱仪中，进行高效液相色谱法测定，记录色谱图；依据所得的10批金银花叶药材的指纹图谱，制定标准指纹图谱；所述标准指纹图谱具有16个特征峰，最终指认了1号峰为绿原酸(样品峰为3号峰)、2号峰为咖啡酸(样品峰为4号峰)、3号峰为芦丁(样品峰为8号峰)、4号峰为金丝桃苷(样品峰为9号峰)、5号峰为木犀草苷(样品峰为11号峰)，共5个峰。
[0035]
(5)指纹图谱的质量控制：
[0036]
将金银花叶药材指纹图谱与步骤(4)制定的标准指纹图谱进行比较，计算相似度，识别所具有的共同吸收峰的数量，确定相似度。
[0037]
(6)聚类分析：
[0038]
将待测样品16个共有峰的峰面积导入spss23.0软件进行聚类分析，得到10批不同产地的金银花叶药材的聚类结果。
[0039]
(7)主成分分析：
[0040]
采用simca14.1软件，将10批样品的16个峰面积进行标准化处理，再运用软件进行pca分析。
[0041]
相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：
[0042]
(1)本发明确立了金银花叶药材指纹图谱的建立方法，通过该方法可以获得金银花叶药材的标准指纹图谱，本发明提供的方法建立的金银花叶药材hplc指纹图谱与对照图谱的相似度均大于0.9，能有效的表征其质量，更好地评价控制药材的相对稳定，完善了金银花叶药材的质量评价体系，为金银花叶药材质量的全面、有效控制提供了理论与实践基础。
[0043]
(2)本发明建立的金银花叶药材hplc指纹图谱，标定了16个共有峰，指认了绿原酸、咖啡酸、芦丁、金丝桃苷、木犀草苷5个共有峰，避免了金银花叶药材质量控制的单一性和片面性；
[0044]
(3)本发明的供试品前处理方法简单，建立的指纹图谱特征性成分保留完整，重复性、稳定性良好，精密度高，具有一定的专属性。
附图说明
[0045]
图1对照品1(绿原酸)色谱图；
[0046]
图2对照品2(咖啡酸)色谱图；
[0047]
图3对照品3(芦丁)色谱图；
[0048]
图4对照品4(金丝桃苷)色谱图；
[0049]
图5对照品5(木犀草苷)色谱图；
[0050]
图6对照品6(混合对照品)色谱图：1-绿原酸，2-咖啡酸，3-芦丁，4-金丝桃苷，5-木犀草苷；
[0051]
图7精密度试验的指纹图谱(s1-s6对应表1中药材来源信息)；
[0052]
图8稳定性试验的指纹图谱(s1-s6对应表1中药材来源信息)；
[0053]
图9重复性试验的指纹图谱(s1-s6对应表1中药材来源信息)；
[0054]
图10金银花叶药材标准指纹图谱：3-绿原酸，4-咖啡酸，8-芦丁，9-金丝桃苷，11-木犀草苷，s1-s10对应表1中药材来源信息，r代表参照图谱；
[0055]
图11不同产地金银花叶药材聚类分析结果图(s1-s10对应表1中药材来源信息)；
[0056]
图12不同产地金银花叶药材主成分分析结果图。
具体实施方式
[0057]
值得说明的是，本发明中使用的原料均为普通市售产品，对其来源不做具体限定。
[0058]
以下仪器及试剂来源，为示例性说明：安捷伦1260型高效液相色谱仪(安捷伦公司)，mettler toledo xse105du型十万分之一电子分析天平(梅特勒公司)，fa1104型电子分析天平(上海方瑞公司)，us-1.3d型超声波清洗器(中科仪仪器有限公司)；甲酸(色谱纯，天津四友公司)，乙腈(色谱纯，天津四友公司)，甲醇(分析纯，天津市科密欧化学试剂有限公司)，纯净水(娃哈哈集团有限公司)，磷酸(分析纯，南京化学试剂有限公司)，木犀草苷(中国食品药品检定研究院，供含量测定111720-201609，纯度≥98％)，绿原酸(中国食品药品检定研究院，供含量测定110753-201415)，咖啡酸(中国食品药品检定研究院，供含量测定110885-200102)，芦丁(中国食品药品检定研究院，供含量测定100080-201408，纯度≥98％)，金丝桃苷(中国食品药品检定研究院，供含量测定111521-200311，纯度≥98％)。
[0059]
实施例1
[0060]
1.药材来源
[0061]
为使药材具有足够的代表性，收集不同产地的药材或不同季节的药材作为供试品。见表1。
[0062]
表1金银花叶药材来源
[0063]
药材编号药材基源药材产地采收时间s1忍冬lonicera japonica thund贵州龙里2017.02.25s2忍冬lonicera japonica thund贵州安顺2017.02.28s3忍冬lonicera japonica thund贵州兴义2017.03.02s4忍冬lonicera japonica thund贵州贵阳2017.03.05s5忍冬lonicera japonica thund贵州怀化2017.03.08s6忍冬lonicera japonica thund贵州凯里2017.03.13
s7忍冬lonicera japonica thund贵州遵义2017.03.19s8忍冬lonicera japonica thund贵州息烽2017.03.22s9忍冬lonicera japonica thund贵州毕节2017.03.28s10忍冬lonicera japonica thund贵州铜仁2017.03.31
[0064]
2仪器与试剂
[0065]
2.1实验器材
[0066]
安捷伦1260型高效液相色谱仪，mettler toledo xse105du型十万分之一电子分析天平，fa1104型电子分析天平，us-1.3d型超声波清洗器。
[0067]
2.2实验试剂
[0068]
甲酸，乙腈，甲醇，纯净水，磷酸，木犀草苷，绿原酸，咖啡酸，芦丁，金丝桃苷。
[0069]
3实验方法
[0070]
3.1色谱条件
[0071]
色谱柱agilent zorbax sb-phenyl(4.6
×
250mm，5μm)；流动相：乙腈(a)、0.5％体积分数的甲酸溶液(b)，梯度洗脱程序(0-15min，乙腈体积分数为10％
→
20％；15-30min，乙腈体积分数为20％
→
20％；30-40min，乙腈体积分数为20％
→
30％)；流速1.0ml/min；柱温35℃；检测波长350nm；进样量10μl。
[0072]
3.2对照品的制备：分别精密称取绿原酸、咖啡酸、芦丁、金丝桃苷、木犀草苷12.86mg、11.40mg、12.10mg、1.23mg、8.67mg，置于100ml同一棕色容量瓶中，加入80％体积分数甲醇溶液溶解定容，摇匀，制得储备液分别含绿原酸0.1286mg/ml、咖啡酸0.1140mg/ml、芦丁0.1210mg/ml、金丝桃苷12.348μg/ml、木犀草苷86.700μg/ml的混合对照品溶液；再分别精密称取绿原酸、咖啡酸、芦丁、金丝桃苷、木犀草苷12.86mg、11.40mg、12.10mg、1.23mg、8.67mg，分别置于5个100ml棕色容量瓶中，加入80％体积分数甲醇溶液溶解定容，摇匀，分别制得绿原酸0.1102mg/ml、咖啡酸0.1563mg/ml、芦丁0.1499mg/ml、金丝桃苷0.1077mg/ml、木犀草苷0.1815mg/ml的对照品溶液。
[0073]
分别按上述色谱条件进行(混合)对照品测定，结果见图1-6。
[0074]
3.3供试品溶液的制备方法考察：
[0075]
本实验考察了不同浓度、不同提取时间的甲醇溶液对忍冬叶中木犀草苷含量的影响。试验过程中分别用40％、50％、60％、70％、80％、90％体积分数的甲醇溶液进行考察；对提取时间30min、45min、60min、90min进行了考察；实验结果见表2、表3。
[0076]
表2
[0077][0078][0079]
表3
[0080]
提取时间30(min)45(min)60(min)90(min)木犀草苷(g/kg)0.370.380.430.44
[0081]
4方法学考察
[0082]
供试品溶液的制备：精密称定金银花叶药材粉末(过四号筛)1g于锥形瓶中，精密
加入80％体积分数甲醇溶液50ml，称定重量，超声(240w，40khz)处理1h称定重量，用80％体积分数甲醇溶液补足减失的重量，摇匀，滤过，精密量取20ml样品溶液挥发至干，再用80％体积分数甲醇溶液定容至5ml容量瓶中，并经微孔滤膜(0.45μm)滤过，即得供试品溶液。
[0083]
4.1精密度试验：
[0084]
取上述供试品溶液，在上述液相色谱条件下，重复进样6次，每次进样10μl，考察主要色谱峰的相对保留时间和相对峰面积的一致性，结果见表4、5(以绿原酸为参照峰)，图7。
[0085]
表4精密度试验表(共有峰相对保留时间)
[0086][0087][0088]
表5精密度试验表(共有峰相对峰面积)
[0089]
峰号s1s2s3s4s5s6平均值rsd(％)10.05280.05090.05110.05200.05200.05240.05191.4520.22300.22350.22180.21620.21670.21680.21971.583(s)1.00001.00001.00001.00001.00001.00001.0000040.02390.02380.02380.02480.02460.02450.02421.9350.03160.03160.03140.03110.03110.03110.03140.7960.52080.51800.51640.49600.49730.49790.50772.3270.06970.06940.06920.06820.06780.06870.06881.0580.23280.23070.23080.23640.23600.23730.23401.26
90.44740.44430.44220.44010.44080.44090.44260.63100.12530.12490.12420.12470.12500.12520.12490.32110.11710.11690.11470.11430.11320.11530.11521.32120.16290.16250.15980.17030.16920.17140.16602.93132.40322.48502.47422.49072.48812.48152.47051.35140.09370.09380.09280.09260.09480.09700.09411.73150.05070.05020.05020.04870.04820.04790.04932.44160.92040.97790.97650.97200.97480.97590.96622.33
[0090]
4.2稳定性试验：
[0091]
取同一供试品溶液，在上述液相色谱条件下，分别在0、2、4、6、12、24小时进行检测，每次进样10μl，考察主要色谱峰的相对保留时间和相对峰面积的一致性，结果见表6、7(以绿原酸为参照峰)，图8。
[0092]
表6稳定性试验表(共有峰相对保留时间)
[0093][0094][0095]
表7稳定性试验表(共有峰相对峰面积)
[0096][0097][0098]
4.3重复性试验：
[0099]
取同一批样品，按供试品制备方法制备6份供试品溶液，在上述液相色谱条件下，进样分析，考察主要色谱峰的相对保留时间和相对峰面积的一致性，结果见表8、9(以绿原酸为参照峰)，图9。
[0100]
表8重复性试验表(共有峰相对保留时间)
[0101]
峰号s1s2s3s4s5s6平均值rsd(％)10.60180.60310.60310.60290.60290.60090.60240.1520.66440.66520.66510.66480.63660.66340.65991.733(s)1.00001.00001.00001.00001.00001.00001.0000041.22121.22201.22191.22111.21951.21831.22070.1251.29871.29981.29911.29821.29601.29471.29780.1561.68901.68951.68911.68741.68581.68361.68740.1471.73641.73701.73671.73521.73321.73111.73490.1381.96071.96161.95741.95971.95761.95561.95880.1292.02012.02082.02062.01912.01672.01492.01870.12102.12412.12432.12512.12342.12022.11872.12260.12
112.27552.27512.27602.27362.27002.26762.27290.15122.34722.34602.34802.34512.34082.33792.34420.17132.52442.52262.52422.52102.51662.51312.52030.18142.68242.68002.68202.67902.67442.67042.67800.18152.76952.76712.76812.76582.76102.75712.76480.17162.88922.89022.88982.88402.87842.87402.88430.24
[0102]
表9重复性试验表(共有峰相对峰面积)
[0103][0104][0105]
5金银花叶药材标准指纹图谱的制定
[0106]
精密吸取上述混合对照品溶液、供试品溶液各10μl，分别注入高效液相色谱仪中，进行高效液相色谱法测定，记录色谱图；依据所得的10批金银花叶药材的指纹图谱，制定标准指纹图谱，见图10。
[0107]
比较金银花叶药材色谱图，确定16个峰为共有峰，其中3号峰为绿原酸峰，依据《中药注射剂指纹图谱研究的技术要求》，制定金银花叶药材的标准指纹图谱。以绿原酸峰为参照峰，计算各共有峰的相对保留时间和其相对标准偏差，结果见表10、11。
[0108]
表10 10批样品共有峰相对保留时间
[0109][0110][0111]
表11 10批样品共有峰相对峰面积
[0112][0113]
6相似度评价
[0114]
运用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》2012.a版，采用中位数法计算10批样品成分指纹图谱的相似度，结果见表12。
[0115]
表12 10批金银花叶药材hplc指纹图谱相似度评价结果表
[0116]
样品号s1s2s3s4s5s6s7s8s9s10rs11
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s20.9181
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s30.9490.9921
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s40.9470.9850.9971
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s50.9420.9850.9940.9981
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s60.990.8880.9140.9120.911
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s70.9430.9870.9960.9990.9990.9111
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s80.9470.9940.9890.9960.9930.9130.9951
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s90.9990.9180.9490.9490.9440.9910.9450.9461
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s100.9450.9870.9970.9970.9980.910.9990.9960.9461 r0.9760.980.9930.9930.9910.9530.9920.9930.9770.9921
[0117]
7聚类分析
[0118]
以10批金银花叶药材的16个峰面积为变量，采用spss23.0软件对峰面积进行标准
化处理，采用组间联接，以平方euclidean距离为测度进行聚类分析。通过树状图分析，10批样品聚为3类，其中s4、s3、s9为一类；s5、s8、s10、s2为一类；s1、s6、s7为一类，结果见图11。
[0119]
8主成分分析
[0120]
采用simca14.1软件，将10批样品的16个峰面积进行标准化处理，再运用软件进行pca分析。结果得到3个主成分因子，与聚类分析结果保持一致，结果见图12。
[0121]
本发明采用hplc-dad法，建立了10批金银花叶药材指纹图谱研究方法，并指认了5种成分。通过供试品溶液制备方法及色谱条件的考察，最终建立了特征图谱，并经方法学验证，得到该方法精密性、稳定性、重复性均良好。从金银花叶指纹图谱相似度结果分析，10批金银花叶药材指纹图谱的相似度大于0.9，指纹图谱全貌基本一致，说明不同批次金银花叶化学组成的一致性。主成分分析、聚类分析可将10批金银花叶药材聚为3类，其中s4、s3、s9质量较为接近，归为一类；s5、s8、s10、s2质量较为接近，归为一类；s1、s6、s7质量较为接近，归为一类；主成分分析、聚类分析反应出样品的不同产地，其质量总体差异归类的特点。
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最后应当说明的是，以上内容仅用以说明本发明的技术方案，而非对本发明保护范围的限制，本领域的普通技术人员对本发明的技术方案进行的简单修改或者等同替换，均不脱离本发明技术方案的实质和范围。