表征四臂NHS酯PEG的方法与流程

表征四臂nhs酯peg的方法
技术领域
1.本发明涉及表征四臂nhs酯peg的方法，尤其是对四臂nhs酯peg衍生化后通过反相色谱分析进行表征的方法。


背景技术：

2.聚乙二醇(polyethylene glycol，peg)是一种线性的亲水性高分子化合物，无毒、生物相容性良好，抗原性低。将peg与一些药物分子(如蛋白、多肽、小分子药物、脂质体等)共价偶联后，可将peg的这些优良性质赋予所形成的偶联药物分子。目前，全球批准上市的聚乙二醇修饰药物已多达数十个，包括peg修饰腺苷脱氢酶(peg-ada)、peg修饰天冬酰胺酶、peg修饰干扰素等蛋白药物，以及peg修饰喜树碱(peg-cpt)、peg修饰阿霉素等小分子药物。
3.聚乙二醇修饰技术经历了几十年的发展，已经开发出了多种peg修饰剂，其中包括多臂(分枝)peg修饰剂，例如二臂peg修饰剂和四臂peg修饰剂(如四臂nhs酯peg)等。相对于单臂peg修饰剂，多臂peg修饰剂的一些优势可包括，提高了对修饰位点的选择性；在修饰位点有限的情况下增加了peg载量；可有效阻止细胞或其他大分子(如抗体)接触该被修饰分子，从而增加半衰期和减小免疫原性，等等。
4.在制备四臂nhs酯peg或使用四臂nhs酯peg过程中，经常需要对样品进行表征，即确定其纯度、杂志含量和/或杂质种类。现有技术表征四臂nhs酯peg的方法有紫外分光光度计法，但是用该方法表征时，会受游离的nhs干扰，导致结果不准确；另一方法为高效液相色谱法，该方法所用的流动相为乙腈和水，但是用该方法表征时，具有不同数量活性nhs酯基团的四臂nhs酯peg分子不能达到有效分离，导致检测结果不准确。


技术实现要素：

5.在一方面，本文提供了一种表征待检样品中四臂nhs酯peg的方法，其包括：
6.1)让所述待检样品与1-萘甲胺在乙腈中反应，生成用于进行反相色谱分析的色谱样品；以及
7.2)对所述色谱样品进行反相色谱分析。
8.在一些实施方案中，所述待检样品与1-萘甲胺在常温下反应不少于1小时。
9.在一些实施方案中，所述待检样品与1-萘甲胺在常温下反应不少于4小时。
10.在一些实施方案中，所述反相色谱分析采用如下流动相：
11.1)流动相a，其包括以下体积百分比的成分：水：四丁基硫酸氢铵＝(90-95)：(5-10)；
12.2)流动相b，其包括以下体积百分比的成分：乙腈：甲醇：四丁基硫酸氢铵＝(80-90)：(8-18)：(2-5)。
13.在一些实施方案中，所述反相色谱分析采用如下流动相：
14.1)流动相a，其包括以下体积百分比的成分：水：四丁基硫酸氢铵＝95：5；
15.2)流动相b，其包括以下体积百分比的成分：乙腈：甲醇：四丁基硫酸氢铵＝85：10：5。
16.在一些实施方案中，所述反相色谱分析中使用的流动相色谱梯度为：
17.0min：70％流动相a，30％流动相b；
18.15min：40％流动相a，60％流动相b；以及
19.21min：70％流动相a，30％流动相b。
20.在一些实施方案中，所述四臂nhs酯peg具有下式(iv)的结构：
[0021][0022]
其中n为80至150之间的整数。
[0023]
在一些实施方案中，所述待检样品包括如下(i-iv)式所示的四臂nhs酯peg中的任一个或其任意组合：
[0024][0025][0026]
[0027][0028]
其中n为80至150之间的整数。
[0029]
在一些实施方案中，所述表征包括检测所述待检样品中的四臂nhs酯peg的含量和种类。
[0030]
本文提供的方法可有效地区分样品中含有不同nhs酯基团数量的四臂nhs酯peg，检测目标分子和杂质分子的种类并进行定量。
附图说明
[0031]
图1为采用本文提供的流动相进行反相色谱分析的代表性色谱图。峰a：1-萘甲胺；峰b：一取代物生成的萘甲胺衍生物；峰c：二取代物生成的萘甲胺衍生物；峰d：三取代物生成的萘甲胺衍生物；峰e四取代物生成的萘甲胺衍生物。
[0032]
图2为采用普通流动相(水和乙腈)进行反相色谱分析的代表性色谱图。
具体实施方式
[0033]
除非另有说明，本文使用的所有技术和科学术语具有本领域普通技术人员所通常理解的含义。
[0034]“四臂peg”在本文中指四个peg分子直接或通过连接基团间接连接至同一碳原子或同一小分子而形成的分枝状分子。在一个实例中，四个peg分子可直接通过醚键连接至作为核心的季戊四醇。四臂peg也涵盖其衍生物，尤其是游离peg末端带有活性基团的衍生物，如四臂nhs酯peg。对于四臂peg中的peg部分，其长短基本上没有限制，例如平均分子量可在200至20000da(例如200、400、600、800、1000、1500、2000、4000、5000、6000、8000、10000、20000da等)，大概包括4-500个单体分子。换言之，peg部分中ch2ch2o重复单元的数量n可以为4-500之间的任何整数，例如，5、10、20、50、100、150、200、300、400、500等。分子量或n值超过上述范围通常也是可行的。
[0035]“四臂nhs酯peg”为四臂peg活性酯的一种，指四臂peg分子中的游离peg末端与n-羟基琥珀酰亚胺(nhs)形成活性酯键。在一个实例中，该游离peg末端通过丁二酸分子形成nhs酯。在制备或购买的四臂nhs酯peg产品中，除了四个游离peg末端均具有nhs活性酯的目标分子外，通常会存在一些酯化不完全的杂质分子，例如仅一个peg臂、两个peg臂或三个peg臂游离端形成nhs酯的杂质。为了描述方便，以下将四臂peg分子中在四个游离peg末端均具有nhs活性酯的四臂nhs酯peg称为四取代物，而将四个游离peg末端共计具有一个nhs活性酯、两个nhs活性酯和三个nhs活性酯的杂质分子分别称为一取代物、二取代物和三取代物，以反映分子中的活性酯基团数量。在一个具体实例中，这些一取代物、二取代物、三取代物和四取代物可分别具有下式(i)、(ii)、(iii)和(iv)的结构。
[0036][0037][0038][0039][0040]
在式(i-iv)中，n可为4至500的整数，例如80至150之间的整数。
[0041]
应理解，在某个具体四臂peg分子中，不同臂的ch2ch2o重复单元的数量n有可能是不同的。这是由于用于制备四臂peg的原料peg本身不会是完全均一的。因此，这里所用的n可视为peg分子群体中的单体数均值(通常取整数值)。本领域技术人员可知这种不均一基本上影响本文提供的方法的实施。
[0042]
采用本文提供的表征方法，可鉴定样品中四取代物(如式(iv))的纯度以及杂质分子的种类和含量。
[0043]
本文提供的表征方法可利用如下反应产生萘甲胺衍生物(式(v))：
[0044][0045][0046]
活性基团n-琥珀酰亚胺酯容易与1-萘甲胺反应，产生萘甲胺衍生物。可理解的是，样品中的一取代物、二取代物、三取代物和四取代物都进行该反应。这些萘甲胺衍生物接着可在反相色谱柱中进行有效分离。
[0047]
因此，在本文提供的表征方法的一些实施方案中，首先让待检样品与1-萘甲胺反应，产生含萘甲胺衍生物的色谱样品；接着使用适合的流动相通过高效液相色谱(如反相色谱)确定色谱样品四取代物以及其他杂质生成的萘甲胺衍生物。由于生成萘甲胺衍生物的该反应容易反应完全，所以对生成的萘甲胺衍生物的检测结果可反映样品中的四取代物以及其他杂质的含量情况。
[0048]
本文提供的表征方法的另一重要方面在于通过反相色谱检测这些萘甲胺衍生物时所使用的流动相。发明人曾尝试了多种常用流动相，发现它们都难以将这些萘甲胺衍生物区分开。后期在研究中意外地发现，采用如下流动相可有效地将它们区分开：1)流动相a，其包括以下体积百分比的成分：水：四丁基硫酸氢铵＝(90-95)：(5-10)；2)流动相b，其包括以下体积百分比的成分：乙腈：甲醇：四丁基硫酸氢铵＝(80-90)：(8-18)：(2-5)。根据色谱图，可以准确地推算出样品中目标分子(四取代物)的含量以及杂质分子种类和含量。另外，该流动相适用于大部分的c18色谱柱，具有通用性强、灵敏、重复性好的优点。
[0049]
以下通过实施例来进一步阐述本发明。
[0050]
实施例1制备用于色谱分析的色谱样品
[0051]
称取适量我们自己制备的包括式(iv)四取代物的待检样品(n＝450)，以含有1-萘甲胺的乙腈溶液溶解，然后让所得混合物在室温条件下反应4h。通常可预估样品中四臂nhs酯peg的浓度，使得所用的1-萘甲胺充分过量即可，例如1-萘甲胺与四臂nhs酯peg的摩尔比为12：1，或更高。再用乙腈定容，配制成一定浓度的待色谱分析样品，经针头过滤器滤入色谱用上样瓶中。
[0052]
待测样品中的活性nhs基团通常在1h左右就与1-萘甲胺反应完全，这可通过在不同反应时间进行色谱分析所得的色谱图看出：在1h后取样检测，各个峰的峰面积基本上不再发生变化。采用4h的反应时间基本上可确保反应完全。
[0053]
实施例2反相色谱检测
[0054]
2.1流动相组成
[0055]
流动相a包括以下体积比的成分：水：四丁基硫酸氢铵＝95：5
[0056]
流动相b包括以下体积比的成分：乙腈：甲醇：四丁基硫酸氢铵＝85：10：5。
[0057]
2.2色谱参数
[0058]
色谱柱：c18反相柱(博蕴生物：tup-hb)
[0059]
流速：0.8ml/min
[0060]
进样体积：5μl
[0061]
柱温箱温度：35℃
[0062]
检测时间：30min
[0063]
蒸发光检测器温度：60.0℃
[0064]
蒸发光检测器增益：3
[0065]
色谱梯度设定如下表1所示。
[0066]
表1色谱梯度
[0067]
时间(min)流动相a％流动相b％0.00703015.00406020.00406021.00703030.007030
[0068]
2.3检测结果
[0069]
对实施例1制备的色谱样品进行检测，图1为检测获得的色谱图，横坐标为时间(min)，纵坐标为响应值(mv)。图中，峰a(t＝3.405min)为1-萘甲胺峰，峰b(t＝12.702min)为一取代物生成的萘甲胺衍生物峰，峰c(t＝13.470min)为二取代物生成的萘甲胺衍生物峰，峰d(t＝14.201min)为三取代物生成的萘甲胺衍生物峰，峰e(t＝14.909min)为四取代物(即目标分子)生成的萘甲胺衍生物峰。通过比较峰b-e之间的相对峰面积，可计算出原待检样品中四取代物的含量为(20.5％)。同时亦可计算出杂质一取代物、二取代物和三取代物的含量分别为约7.8％、25.9％和45.8％。具体数据显示在下表2中。
[0070]
表2检测获得的色谱数据
[0071]
峰保留时间(min)峰面积峰面积百分比(％)a3.405
‑‑
b12.702221.87.797c13.470737.125.911d14.2011301.645.752e14.909584.320.539
[0072]
对比例
[0073]
采用与实施例2相同的检测条件，只是将流动相改为乙腈/水，反相色谱分析获得的色谱图如图2所示。峰a中的成分包括目标分子四取代物以及杂质分子(一取代物、二取代物、三取代物)。四取代物和杂质分子难以分开，无法对四取代物和杂质分子的种类和含量进行表征。
[0074]
发明人也采用了其他反相色谱中常用的流动相溶剂如甲醇、乙腈、四氢呋喃、乙醇、丙酮及其二元或三元混合物，发现均无法将四取代物与杂质分子分开。
[0075]
通过以上的描述可知，本文提供的表征方法包括但不限于以下优点：
[0076]
1.该方法能有效的分离不同臂(如二臂、三臂、四臂、八臂等)的nhs酯peg；
[0077]
2.该方法能使nhs酯peg和peg达到有效的分离；
[0078]
3.该方法能让研究者在图谱中清晰了解nhs酯peg和杂质等各组分；
[0079]
4.该方法能有效定量各组分的含量。