一种通过电泳分离蛋白的凝胶、配合使用的缓冲液及其试剂盒的制作方法

1.本发明属于蛋白电泳试剂领域，公开了一种通过电泳分离蛋白的凝胶、配合使用的缓冲液及其试剂盒。


背景技术：

2.聚丙烯酰胺凝胶电泳主要用于分离蛋白质和核酸，在生物学、医学等生物化学相关领域都有广泛使用，通过改变聚合前丙烯酰胺的浓度，可以制备出不同孔径的聚丙烯酰胺凝胶。在1970年，laemmli创建了含有十二烷基硫酸钠的变性聚丙烯酰胺凝胶(sds-page),简称laemmli系统凝胶，这项技术被广泛应用于蛋白质的分析。
3.传统的laemmli系统由三羟甲基氨基甲烷作为缓冲剂控制凝胶ph值，下层胶的ph值为8.8。laemmli系统凝胶具有良好的分离效果和条带清晰度，然而因其凝胶内的碱性环境使聚合后的聚丙烯酰胺易被水解，会扰乱电泳过程中蛋白质的迁移，并会使蛋白条带模糊不清。
4.在将凝胶ph调整至偏酸性时，聚丙烯酰胺凝胶的稳定性得到极大提高，可以将凝胶提前制备好，极大的节省了蛋白电泳实验的操作时间，并因批量制备，也提高了蛋白电泳结果的稳定性。
5.因其核心是将其ph值控制在偏酸性环境，目前使用的缓冲剂主要是双(2-羟甲基)氨基-三(羟甲基)甲烷和三羟甲基氨基甲烷两类。在电泳中其尾随离子的种类对电泳影响很大，主要分为传统的甘氨酸和两性离子缓冲剂(good’s buffer)，good’s buffer中作为电泳时尾随离子的主要是mops、mes和hepes三种，在使用以上三种时，与laemmli系统相比，电泳迁移速度更快可节省时间，而且电泳过程中蛋白质被修饰的概率更低，但是这种系统的凝胶在分离时蛋白质的迁移位置与传统laemmli系统有较大不同，且原料的价格很高。
6.在电泳时其阳极区域会随电泳进行而蓄积氢离子，两种缓冲剂中双(2-羟甲基)氨基-三(羟甲基)甲烷和三羟甲基氨基甲烷的作用就是为保证凝胶内ph值的稳定，如果缓冲能力不够，会使氢离子无法得到吸收，使凝胶底部靠近阳极区域ph值大幅度降低，导致蛋白质在凝胶下部无法迁移。所以现有方法不能通过降低缓冲剂的浓度，来降低成本。
7.在预制胶体系内电泳时，因与传统laemmli系统相比ph值低，所以电泳时实际载量低于传统方法，且在电泳分离蛋白质时，有时会有不容颗粒影响电泳时蛋白质的迁移。


技术实现要素：

8.针对上述情况，本发明公开了一种通过电泳分离蛋白的凝胶、配合使用的缓冲液及其试剂盒。
9.本发明的技术方案如下：
10.一种通过电泳分离蛋白的凝胶，包括以下组份：
11.凝胶缓冲剂：2，2-双二羟甲基苯胺或三羟甲基氨基甲烷；
12.凝胶体系稳定剂：谷氨酸、柠檬酸、苹果酸、丁二酸中的一种或者多种；
13.蛋白增溶剂：二甲基甲酰胺；
14.丙烯酰胺：n，n-甲叉双丙烯酰胺。
15.进一步的，所述通过电泳分离蛋白的凝胶是通过催化剂：过硫酸铵和temed催化得到的。
16.进一步的，所述凝胶缓冲剂：2，2-双二羟甲基苯胺或三羟甲基氨基甲烷的组分浓度为100-400mm，优选为100mm-150mm。
17.进一步的，所述凝胶体系稳定剂为任意配比的谷氨酸、柠檬酸、苹果酸、丁二酸，组分浓度为1-50mm。
18.进一步的，所述丙烯酰胺：n，n-甲叉双丙烯酰胺，组分浓度为700mm-3000mm。
19.进一步的，所述蛋白增溶剂：二甲基甲酰胺的组分浓度为1mm-100mm。
20.进一步的，所述凝胶的ph值为6.4-6.6。
21.与上述通过电泳分离蛋白凝胶配合使用的凝胶电泳缓冲液，包括以下组分：
22.1. 2，2-双二羟甲基苯胺或三羟甲基氨基甲烷，组分浓度为10-100mm；
23.2. 3-吗啉丙磺酸(mops)或2-n-吗啉代烷磺酸(mes)，组分浓度为10-100mm；
24.3.十二烷基硫酸钠，组分浓度为1-5mm；
25.4.edta，组分浓度为0.1-3mm。
26.进一步的，一种凝胶电泳试剂盒，包含上述配比的凝胶和凝胶电泳缓冲液任意比例混合。
27.与现有技术相比，本发明具有如下的有益效果：
28.因缓冲剂需要控制凝胶ph值，所以需要一定浓度以上，本发明在现有配方内加入酸性氨基酸(谷氨酸)，谷氨酸提高凝胶在酸性区域内的缓冲能力，防止酸化的发生；同时因谷氨酸的加入也会提高凝胶的稳定性；谷氨酸本身的缓冲区间在ph值3左右，加入谷氨酸可以通过其羧基和氨基结合氢离子，防止上文中提高的氢离子蓄积，同时聚丙烯酰胺本身的酰胺键会水解为羧基，所以加入谷氨酸也会起到逆向抑制作用。因凝胶的ph值是中性或受尾随离子的影响，导致电泳分离蛋白载量低，且对有不容颗粒的样品耐受性差，所以在本发明中加入二甲基甲酰胺,提高样品溶解性，从而提高蛋白载量，并能防止不溶颗粒堵塞凝胶。二甲基甲酰胺是用途很广的优良溶剂，可以作为多种高分子聚合物的良好溶剂，依次类推推测可用作聚丙烯酰胺凝胶中蛋白质的增溶剂，增加在迁移过程中蛋白质的溶解度。
29.与现有技术相比，本发明可将主要缓冲剂用量减少到100mm-150mm，本发明中加入谷氨酸，可以防止凝胶的底部氢离子的蓄积，从而避免凝胶局部ph低于2而使蛋白质无法迁移(氢离子蓄积的直观表现是溴酚蓝会变黄，然后无法移动，并变形)。
30.同时，本发明所述的凝胶可以增加蛋白质的溶解度，避免样品中有过多的不溶颗粒，使得电泳条带更加平直。
附图说明
31.图1为实施例1中电泳图；
32.图2为实施例2中的电泳图；
33.图3为实施例3中的电泳图；
34.图4为实施例4中配方一(当天配制)分离线性关系图，其中横坐标为蛋白质迁移分子量以10为底的对数值，纵坐标是迁移条带的上边缘距离下边缘溴酚蓝的距离值；
35.图5为实施例4中配方一(配制后37℃保存十二天)分离线性关系图，其中横坐标为蛋白质迁移分子量以10为底的对数值，纵坐标是迁移条带的上边缘距离下边缘溴酚蓝的距离值；
36.图6为实施例4中配方二(当天配制)分离线性关系图，其中横坐标为蛋白质迁移分子量以10为底的对数值，纵坐标是迁移条带的上边缘距离下边缘溴酚蓝的距离值；
37.图7为实施例4中配方二(配制后37℃保存十二天)分离线性关系图，其中横坐标为蛋白质迁移分子量以10为底的对数值，纵坐标是迁移条带的上边缘距离下边缘溴酚蓝的距离值；
38.图8为实施例4中配方三(当天配制)分离线性关系图，其中横坐标为蛋白质迁移分子量以10为底的对数值，纵坐标是迁移条带的上边缘距离下边缘溴酚蓝的距离值；
39.图9为实施例4中配方三(配制后37℃保存十二天)分离线性关系图，其中横坐标为蛋白质迁移分子量以10为底的对数值，纵坐标是迁移条带的上边缘距离下边缘溴酚蓝的距离值。
具体实施方式
40.下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法。
41.下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
42.实施例1
43.本实施例对本发明内添加了谷氨酸和二甲基甲酰胺的聚丙烯酰胺凝胶与不在本发明范围内的聚丙烯酰胺凝胶(其他专利报道配方、或文献公布公布配方)进行比较。在制备凝胶的第二天进行分离。
44.使用玻璃板或塑料板配制聚丙烯酰胺浓度12％的水溶液(t＝12％，c＝2.6％，c＝n，n甲叉双丙烯酰胺的质量/丙烯酰胺质量+n,n甲叉双丙烯酰胺质量，n,n甲叉双丙烯酰胺浓度为1688mm)。制胶溶液中含有密度剂甘油浓度8％，并使用盐酸将ph调节至6.4-6.6之间，使用过硫酸铵和temed作为催化剂催化n，n甲叉双丙烯酰胺聚合交联形成三维网状的聚丙烯酰胺凝胶。对照溶液配制相同浓度的聚丙烯酰胺凝胶(催化部分为常规方法或本领域公知技术，本发明对此不进行特殊限定)。具体配方如下表1。
45.表1：实施例1的配方
46.47.使用mini-protean型电泳槽电泳，测试电泳缓冲液使用配方为50mm三羟甲基氨基甲烷、50mm 3-吗啉丙磺酸、0.1％sds和edta。所分离样品为小鼠肝脏组织制备的不同浓度样品。如图1所示，对所得电泳图进行比较，专利配方(图1左)在高浓度时条带形状更加平直，因浓度过高蓄积的不容颗粒，不会在条带中显现。
48.实施例2
49.本实施例对本发明内添加了谷氨酸和二甲基甲酰胺的聚丙烯酰胺凝胶与不在本发明范围内的聚丙烯酰胺凝胶(其他专利报道配方、或文献公布公布配方)进行比较，在配制后37摄氏度放置12天后测试。
50.使用玻璃板或塑料板配制聚丙烯酰胺浓度12％的水溶液(t＝12％，c＝2.6％，n,n甲叉双丙烯酰胺浓度为1688mm)。制胶溶液中含有密度剂甘油浓度8％，并使用盐酸将ph调节至6.4-6.6之间，使用过硫酸铵和temed作为催化剂催化n，n甲叉双丙烯酰胺聚合交联形成三维网状的聚丙烯酰胺凝胶。对照溶液配制相同浓度的聚丙烯酰胺凝胶(催化部分为常规方法或本领域公知技术，本发明对此不进行特殊限定)。具体配方如下表2所示：
51.表2：实施例2的配方
[0052][0053]
使用mini-protean型电泳槽电泳，测试电泳缓冲液使用配方为50mm三羟甲基氨基甲烷、50mm 3-吗啉丙磺酸、0.1％sds和edta。所分离样品为小鼠肝脏组织制备的不同浓度样品。根据图2对所得电泳图进行比较，专利配方(图2右)在长时间放置后，电泳至凝胶底部不会黄化(表现为溴芬兰颜色变成黄色)，而对照凝胶(图2左)会在底部变黄，导致底部结果无法获得。
[0054]
实施例3
[0055]
本实例对本发明添加的备选的稳定剂苹果酸，同时添加谷氨酸和二甲基甲酰胺的聚丙烯酰胺凝胶，在配制后37摄氏度放置12天后，与当天配制的同样配方凝胶进行比较。
[0056]
使用玻璃板或塑料板配制聚丙烯酰胺浓度12％的水溶液(t＝12％，c＝2.6％，n,n甲叉双丙烯酰胺浓度为1688mm)。制胶溶液中含有密度剂甘油浓度8％，并使用盐酸将ph调节至6.4-6.6之间，使用过硫酸铵和temed作为催化剂催化n，n甲叉双丙烯酰胺聚合交联形成三维网状的聚丙烯酰胺凝胶。对照溶液配制相同浓度的聚丙烯酰胺凝胶(催化部分为常规方法或本领域公知技术，本发明对此不进行特殊限定)。具体配方如表3所示：
[0057]
表3：实施例3的配方
[0058][0059]
使用mini-protean型电泳槽电泳，测试电泳缓冲液使用配方为50mm三羟甲基氨基甲烷、50mm 3-吗啉丙磺酸、0.1％sds和edta。所分离样品为小鼠肝脏组织制备的不同浓度样品、预染marker、非预染marker和大肠杆菌裂解物。由图3所示对所得电泳图进行比较，图3中左侧凝胶图为当天配制凝胶，右侧为37摄氏度放置12天后结果，除部分条带稍有弥散外，没有明显变化。
[0060]
实施例4
[0061]
本实施例也是热加速试验，研究本发明范围内使用不同组合和浓度的缓冲剂和稳定剂对聚丙烯酰胺凝胶稳定性，尤其是条带迁移率的影响。按照下表内凝胶配方，使用玻璃板或塑料板配制聚丙烯酰胺浓度10％的水溶液(t＝12％，c＝2.6％)，n,n甲叉双丙烯酰胺浓度为1407mm。制胶溶液中含有密度剂甘油浓度8％，并使用盐酸将ph调节至6.4-6.6之间，使用过硫酸铵和temed作为催化剂催化n，n甲叉双丙烯酰胺聚合交联形成三维网状的聚丙烯酰胺凝胶。对照溶液配制相同浓度的聚丙烯酰胺凝胶(催化部分为常规方法或本领域公知技术，本发明对此不进行特殊限定)。
[0062]
配方名称区别组分配方a200mm bis-tris；30mm谷氨酸；10mm二甲基甲酰胺配方b300mm tris；30mm谷氨酸；10mm二甲基甲酰胺配方c300mm tris；30mm谷氨酸；50mm二甲基甲酰胺
[0063]
使用mini-protean型电泳槽电泳，测试电泳缓冲液使用配方为50mm三羟甲基氨基甲烷、50mm 3-吗啉丙磺酸、0.1％sds和edta。所分离样品为非预染蛋白分子量标准，上述配方在配制后37摄氏度放置12天，和在使用当天配制凝胶比较非预染蛋白分子量标准在不同配方胶内和不同保存时间的胶内的迁移位置，蛋白分子量迁移率公式为：lgmr＝-b*mr+k。因凝胶分离范围为线性，但一个浓度只针对一定的蛋白分子量分离范围内是线性关系，例如10％浓度凝胶，在蛋白分子质量40-70kda范围内呈线性关系。结果如图4-9所示，不同组分配比和保存时间，蛋白marker迁移位置基本一致。
[0064]
对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。
[0065]
此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。