一种非鳞状上皮细胞模拟物的制备方法与流程

1.本发明涉及分析检测技术领域，尤其涉及一种非鳞状上皮细胞模拟物的制备方法。


背景技术：

2.在现有的尿液有形成分分析检测领域，仪器和所用试剂的质量控制是保证检测结果的准确性、可靠性的重要方式，其中，尿有形成分分析仪用质控物的质量控制尤为重要。
3.目前，市面上的尿液有形成分分析固定剂质控物根据其产品成分分为阴性质控物和阳性质控物的单项质控液，阳性质控物中一般宣称包含红细胞、白细胞、上皮细胞等多种有形成分。上皮细胞与人体内肾脏健康息息相关，特别的是非鳞状上皮细胞具有非常重要的临床意义。然而，非鳞状上皮细胞几乎不可见，其测试灵敏度较差，稳定性差，无法满足非鳞状上皮细胞的质量控制需求。因此，现有技术仍需改进。


技术实现要素：

4.本发明的目的在于提供一种非鳞状上皮细胞模拟物的制备方法，旨在解决现有质控物中非鳞状上皮细胞测试稳定性差的问题。
5.为实现上述目的，本发明提供了一种非鳞状上皮细胞模拟物的制备方法，包括以下步骤：
6.获取动物血液制取红细胞；
7.将所述红细胞投入含有固定剂的固定缓冲液中进行固化，得到半固化细胞，并将所述半固化细胞进行离心，得到沉淀物；
8.将所述沉淀物在25℃条件下使用核突显试剂预处理，得到二次沉淀物，并将所述二次沉淀物洗涤去除固定剂，得到上皮细胞模拟物。其中，所述获取动物血液制取红细胞的具体方式为：
9.获取两栖动物血液，并对所述血液离心分层，得到分层液；
10.去除所述分层液的上清液和白细胞层，得到红细胞层；
11.使用生理盐水离心洗涤所述红细胞层，得到所述红细胞。
12.其中，将所述红细胞投入含有固定剂的固定缓冲液中进行固化，得到半固化细胞，并将所述半固化细胞进行离心，得到沉淀物的具体方式为：
13.取所述固定剂投入200～3000mosm/kgh2o渗透压条件下的固定缓冲液中；
14.将所述红细胞中投入所述固定缓冲液，室温下固化所述红细胞，得到半固化细胞；
15.将所述半固化细胞离心分层过滤，得到所述沉淀物。
16.其中，所述固定剂为醛类固定剂，所述核突显试剂为酸类试剂。
17.其中，所述固定缓冲液为0.2g/lnacl、0.34g/lna2hpo4和0.24g/lkh2po4中的一种或多种。
18.本发明的一种非鳞状上皮细胞模拟物的制备方法，获取动物血液制取红细胞；将
所述红细胞投入固定缓冲液中，用固定剂进行固定随后过滤处理，得到沉淀物；将所述沉淀物在25℃条件下使用核突显试剂处理，并去除所述固定剂，得到上皮细胞模拟物，上述方法利用两栖类动物红细胞模拟非鳞状上皮细胞，优选所述固定剂和所述核突显试剂浓度处理细胞后，可准确模拟非鳞状上皮细胞，明显与其他类型细胞区分开来，可以用来模拟非鳞状上皮细胞，改变细胞的复杂程度，使之适用于模拟非鳞状上皮细胞，具备模拟尿液中非鳞状上皮细胞的形态特征，对非鳞状上皮细胞的分析测定进行准确的质量控制，解决了现有质控物中非鳞状上皮细胞测试稳定性差的问题。
附图说明
19.为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
20.图1是本发明提供的一种非鳞状上皮细胞模拟物的制备方法流程图。
21.图2是本发明提供的所述获取动物血液制取红细胞的具体方式流程图。
22.图3是本发明提供的所述将所述红细胞投入固定缓冲液中，用固定剂进行固定随后过滤处理，得到沉淀物的具体方式流程图。
23.图4是非鳞状上皮细胞的形貌特征图。
24.图5是类似细胞进行模拟图。
25.图6是实施例一制备的模拟物分析结果图。
26.图7是实施例二制备的模拟物分析结果图。
27.图8是实施例三制备的模拟物分析结果图。
28.图9是实施例四制备的模拟物分析结果图。
29.图10是实施例五制备的模拟物分析结果图。
30.图11是实施例六制备的模拟物分析结果图。
具体实施方式
31.下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出，其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
32.请参阅图1至图11，本发明提供一种非鳞状上皮细胞模拟物的制备方法，包括以下步骤：。
33.s1获取动物血液制取红细胞；
34.具体的，动物血液选用两栖动物血液，如蛙类和龟类。
35.具体方式：
36.s11获取两栖动物血液，并对所述血液离心分层，得到分层液；
37.s12去除所述分层液的上清液和白细胞层，得到红细胞层；
38.s13使用生理盐水离心洗涤所述红细胞层，得到所述红细胞。
39.s2将所述红细胞投入含有固定剂的固定缓冲液中进行固化，得到半固化细胞，并
将所述半固化细胞进行离心，得到沉淀物；
40.具体的，所述固定剂为固定剂为醛类固定剂，选自甲醛、乙醛及戊二醛。所述醛类固定剂的浓度优选为0.01％～5％(w/v)，所述浓度为质量体积百分比浓度，固定剂的作用时间根据具体的固定剂以及浓度而变化，通常为5h～24h，所述固定缓冲液为0.2g/lnacl、0.34g/lna2hpo4和0.24g/l kh2po4中的一种或多种，所述固定缓冲液使用时，先用盐酸或naoh调节ph到7.2
±
0.2，再用nacl调节渗透压至300
±
20mosm/kgh2o。
41.具体方式：
42.s21取所述红细胞投入200～3000mosm/kgh2o渗透压条件下的固定缓冲液中；
43.s22将所述红细胞投入含有固定剂的固定缓冲液中进行固化，室温下固化所述红细胞，得到半固化细胞；
44.s23将所述半固化细胞离心分层过滤，得到所述沉淀物。
45.s3将所述沉淀物在25℃条件下使用核突显试剂预处理，得到二次沉淀物，并将所述二次沉淀物洗涤去除固定剂，得到上皮细胞模拟物。
46.具体的，所述核突显试剂为酸类试剂，所述的核突显试剂为酸类试剂，选自乙酸、盐酸。所述酸类试剂的浓度优选为0.5％～5％(w/v)，所述浓度为质量体积百分比浓度，所述核突显试剂的作用时间随浓度而变化，通常为12h～24h，所述沉淀物在使用所述核突显试剂后，通过所述pbs缓冲液洗去除所述固定剂，其中，所述pbs缓冲液为8g/l nacl、0.2g/l kcl、1.44g/l na2hpo4和0.24g/l kh2po4中的一种或多种，所述pbs缓冲液使用时，先用盐酸调节ph到7.2
±
0.2，再用nacl调节渗透压至300
±
20mosm/kgh2o。
47.将含有非鳞状上皮细胞的尿液样本重复混匀后，通过尿液有形成分分析仪流式镜检拍照计数，结果如图4所示，图中显示非鳞状上皮细胞的形貌特征，体积大于白细胞，呈圆形或不规则形，细胞核清晰可见，因此需要用另外一种类似细胞进行模拟，如图5所示，增加细胞通透性，增大细胞核的复杂程度达到模拟非鳞状上皮细胞的目的。
48.下面实施例所使用的尿液有形成分分析仪为ud-1320尿液有形成分分析仪，并采用流式镜检拍照进行识别计数。
49.实施例一
50.s001取新鲜抗凝牛蛙血进行过滤；
51.s002将抗凝牛蛙血1500r/min离心5min，去掉上清和白细胞，得到纯红细胞；
52.s003用生理盐水离心洗涤一遍红细胞；
53.s004取步骤三中的沉淀，用含甲醛0.1％的固定缓冲液重悬细胞，室温下固化24h；
54.s005将半固化的细胞1500r/min离心5min，弃去上清液；
55.s006在含甲醛0.1％的固定缓冲液中加入含1％醋酸的核突显试剂，用该溶液重悬细胞，25℃条件下固化24h；
56.s007用pbs缓冲液离心洗涤去除固定剂。
57.将制备的模拟物在流式镜检原理的尿液有形成分分析仪进行测试，结果如图6所示。
58.实施例二
59.s011取新鲜抗凝牛蛙血进行过滤；
60.s012将抗凝牛蛙血1500r/min离心5min，去掉上清和白细胞，得到纯红细胞；
61.s013用生理盐水离心洗涤一遍红细胞；
62.s014取步骤三中的沉淀，用含戊二醛0.02％的固定缓冲液重悬细胞，室温下固化24h；
63.s015将半固化的细胞1500r/min离心5min，弃去上清液。
64.s016在含戊二醛0.02％的固定缓冲液中加入含1％醋酸的核突显试剂，用该溶液重悬细胞，25℃条件下固化24h；
65.s017用pbs缓冲液离心洗涤去除固定剂。
66.将制备的模拟物在流式镜检原理的尿液有形成分分析仪进行测试，结果如图7所示。
67.实施例三
68.s021取新鲜抗凝牛蛙血进行过滤；
69.s022将抗凝牛蛙血1500r/min离心5min，去掉上清和白细胞，得到纯红细胞；
70.s023用生理盐水离心洗涤一遍红细胞；
71.s024取步骤三中的沉淀，用含乙醛0.2％的固定缓冲液重悬细胞，室温下固化5h；
72.s025将半固化的细胞1500r/min离心5min，弃去上清液。
73.s026在含乙醛0.2％的固定缓冲液中加入含1％醋酸的核突显试剂，用该溶液重悬细胞，25℃条件下固化5h；
74.s027用pbs缓冲液离心洗涤去除固定剂。
75.将制备的模拟物在流式镜检原理的尿液有形成分分析仪进行测试，结果如图8所示。
76.实施例四
77.s031取新鲜抗凝牛蛙血进行过滤；
78.s032将抗凝牛蛙血1500r/min离心5min，去掉上清和白细胞，得到纯红细胞；
79.s033用生理盐水离心洗涤一遍红细胞；
80.s034取步骤三中的沉淀，用含甲醛2％的固定缓冲液重悬细胞，室温下固化24h；
81.s035将半固化的细胞1500r/min离心5min，弃去上清液。
82.s036在含甲醛2％的固定缓冲液中加入含1％醋酸的核突显试剂，用该溶液重悬细胞，25℃条件下固化12h；
83.s037用pbs缓冲液离心洗涤去除固定剂。
84.将制备的模拟物在流式镜检原理的尿液有形成分分析仪进行测试，结果如图9所示。
85.实施例五
86.s041取新鲜抗凝牛蛙血进行过滤；
87.s042将抗凝牛蛙血1500r/min离心5min，去掉上清和白细胞，得到纯红细胞；
88.s043用生理盐水离心洗涤一遍红细胞；
89.s044取步骤三中的沉淀，用含含甲醛2％的固定缓冲液重悬细胞，室温下固化24h；
90.s045将半固化的细胞1500r/min离心5min，弃去上清液。
91.s046在含甲醛2％的固定缓冲液中加入含2％醋酸的核突显试剂，用该溶液重悬细胞，25℃条件下固化12h；
92.s047用pbs缓冲液离心洗涤去除固定剂。
93.将制备的模拟物在流式镜检原理的尿液有形成分分析仪进行测试，结果如图10所示。
94.实施例六
95.s051取新鲜抗凝牛蛙血进行过滤；
96.s052将抗凝牛蛙血1500r/min离心5min，去掉上清和白细胞，得到纯红细胞；
97.s053用生理盐水离心洗涤一遍红细胞；
98.s054取步骤三中的沉淀，用含含甲醛2％的固定缓冲液重悬细胞，室温下固化至少24h；
99.s055将半固化的细胞1500r/min离心5min，弃去上清液。
100.s056在含甲醛2％的固定缓冲液中加入含3％醋酸的核突显试剂，用该溶液重悬细胞，25℃条件下固化12h；
101.s057用pbs缓冲液离心洗涤去除固定剂。
102.将制备的模拟物在流式镜检原理的尿液有形成分分析仪进行测试，结果如图11所示。
103.以上所揭露的仅为本发明一种较佳实施例而已，当然不能以此来限定本发明之权利范围，本领域普通技术人员可以理解实现上述实施例的全部或部分流程，并依本发明权利要求所作的等同变化，仍属于发明所涵盖的范围。