异氰酸甲酯的检测方法与流程

1.本发明涉及微量化合物检测技术领域，特别涉及一种异氰酸甲酯的检测方法。


背景技术：

2.二甲基甲酰胺(n,n-dimethylformamide，dmf)，为无色透明或淡黄色液体，有鱼腥味，易挥发，属于低毒溶剂，能与水混溶，可与多数有机溶剂混溶，是一种性能优使用广泛的化工原料，主要作为有机合成和人造皮革等工业原料。工作场所使用dmf主要有吸入、食入、经皮吸收进入体内。当dmf进入机体后，对多脏器有损伤，但主要靶器官为肝脏，临床发现有肝脏肿大，肝区痛，黄疸和肝功能异常，增加了肿瘤发生率。
3.dmf在人体中经过一系列的反应部分生成的中间产物异氰酸甲酯(mic)，其能与血液中的血红蛋白相互作用生成活性中间产物n-甲基甲酰氨蛋白加合物(mic蛋白复合物)，这种复合物在体内能维持较长时间的稳定，可以作为接触dmf的生物标志物。所以通过检测异氰酸甲酯可以间接实现二甲基甲酰胺中毒的检测，而对于异氰酸甲酯的检测，现有的方案普遍存在灵敏度不高、特性异性较差等问题，所以现在需要提供一种更可靠的方案。


技术实现要素：

4.本发明所要解决的技术问题在于针对上述现有技术中的不足，提供一种异氰酸甲酯的检测方法。本发明先将mic蛋白复合物经过埃德曼降解法降解为3-甲基-5-异丙基海因(mvh)，再通过两步法使用杂质吸附性固相萃取进行样品净化，使用高灵敏度、高特异性液相色谱串联质谱(lc-ms/ms)进行样品测试，从而能够实现异氰酸甲酯的高灵敏度、快速检测，可应用于二甲基甲酰胺中毒检测。
5.为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：一种异氰酸甲酯的检测方法，包括以下步骤：
6.1)样品前处理：
7.1-1)取待测样品，加入盐酸和醋酸的混合溶液，震荡混匀；
8.1-2)加热降解，反应结束后冷却至室温；
9.1-3)反应产物用甲醇水溶液定容，得到样品溶液；
10.1-4)在固相萃取孔板内加入含有甲酸的乙腈甲醇混合液，然后将步骤1-3)得到的样品溶液加入固相萃取孔板内，并混匀；
11.1-5)在固相萃取孔板上方施加正压力，使样品溶液通过固相萃取孔板的填料以进行净化；
12.1-6)收集固相萃取孔板下方流出的净化后的溶液，作为测试样；
13.2)采用液相色谱串联质谱法对测试样进行检测，然后利用标准曲线计算得到待测样品中异氰酸甲酯的含量。
14.优选的是，所述步骤1)具体包括：
15.1-1)取待测样品置于离心管中，加入盐酸和醋酸的混合溶液，震荡混匀1-6min；
16.1-2)于70-100℃下加热降解0.2-1h，反应结束后冷却至室温；
17.1-3)反应产物用甲醇水溶液定容，得到样品溶液；
18.1-4)在固相萃取孔板内加入含有甲酸的乙腈甲醇混合液，然后将步骤1-3)得到的样品溶液加入固相萃取孔板内，并混匀；
19.1-5)在固相萃取孔板上方施加正压力，使样品溶液通过固相萃取孔板的填料以进行净化，控制样品溶液流速为0.5-2ml/min；
20.1-6)收集固相萃取孔板下方流出的净化后的溶液，作为测试样。
21.优选的是，所述步骤1)具体包括：
22.1-1)取0.02-0.1g待测样品置于5-30ml的离心管中，加入1-6ml盐酸和醋酸的混合溶液，震荡混匀1-6min；
23.1-2)于70-100℃下加热降解0.2-1h，反应结束后冷却至室温；
24.1-3)反应产物用甲醇水溶液定容，得到样品溶液；
25.1-4)在固相萃取孔板内加入200-1000μl的含有甲酸的乙腈甲醇混合液，然后将100-400μl步骤1-3)得到的样品溶液加入固相萃取孔板内，并混匀；
26.1-5)在固相萃取孔板上方施加正压力，使样品溶液通过固相萃取孔板的填料以进行净化，控制样品溶液流速为0.5-2ml/min；
27.1-6)收集固相萃取孔板下方流出的净化后的溶液，作为测试样。
28.优选的是，所述步骤1)具体包括：
29.1-1)取0.05g待测样品置于15ml的离心管中，加入3ml盐酸和醋酸的混合溶液，震荡混匀3min；
30.1-2)于90℃下加热降解0.5h，反应结束后冷却至室温；
31.1-3)反应产物用甲醇水溶液定容至5ml，得到样品溶液；
32.1-4)在固相萃取孔板内加入500μl的含有甲酸的乙腈甲醇混合液，然后将200μl步骤1-3)得到的样品溶液加入固相萃取孔板内，并混匀；
33.1-5)在固相萃取孔板上方施加正压力，使样品溶液通过固相萃取孔板的填料以进行净化，控制样品溶液流速为1ml/min；
34.1-6)收集固相萃取孔板下方流出的净化后的溶液，作为测试样。
35.优选的是，盐酸和醋酸的混合溶液中，盐酸和醋酸的体积比为1:1。
36.优选的是，含有甲酸的乙腈甲醇混合液为含有质量分数为0.5％甲酸的乙腈甲醇混合液，且乙腈和甲醇的体积比为1:1。
37.优选的是，甲醇水溶液中，甲醇和水的体积比为1:1。
38.优选的是，其中，待测样品为血红蛋白样品。
39.优选的是，所述步骤2)中，液相色谱条件为：
40.色谱柱：venusil mp c18；
41.流动相：a相为含有质量分数0.1％甲酸的甲酸水，b相为乙腈；
42.梯度洗脱程序：0-0.2min，15％b；0.2-3min，85％b；3-3.2min，100％b；3-4min，100％b；4-4.1min，15％b；4.1-5.5min，15％b；
43.流速：0.6ml/min；进样量：20μl；柱温：40℃。
44.优选的是，所述步骤2)中，质谱条件条件为：
45.离子源参数：esi正模式；检测方式：多反应监测；电喷雾电压：4500v；气帘气：15；雾化气：65；辅助气：40；离子源温度：300℃。
46.本发明的有益效果是：本发明提供了一种异氰酸甲酯的检测方法，本发明利用二甲基甲酰胺能与血液中的血红蛋白相互作用生成mic蛋白复合物的原理，先将mic蛋白复合物经过埃德曼降解法降解为3-甲基-5-异丙基海因(mvh)，再通过两步法使用杂质吸附性固相萃取进行样品净化，最后利用液相色谱串联质谱法进行测试，能够实现异氰酸甲酯的高灵敏度、高特异性快速检测，并可应用于二甲基甲酰胺中毒检测；
47.本发明的方法可以去除内源性干扰物，基质效应小，操作简单，效率高，且具有很高的准确度及精密度。
附图说明
48.图1为本发明的实施例1中得到的标准曲线；
49.图2为本发明的实施例1中得到的目标物色谱图；
50.图3为本发明的实施例1中得到的样品加标色谱图；
51.图4为本发明的样品前处理的原理示意图。
具体实施方式
52.下面结合实施例对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。
53.应当理解，本文所使用的诸如“具有”、“包含”以及“包括”术语并不排除一个或多个其它元件或其组合的存在或添加。
54.实施例1
55.1、试剂来源说明
56.(1)3-甲基-5-异丙基海因(mvh，阿拉丁)；
57.(2)3-甲基-5-异丁基海因(mih，阿拉丁)；
58.(3)盐酸(康科德科技有限公司)；
59.(4)乙酸(thermo fisher)；
60.(5)甲酸(thermo fisher)；
61.(6)乙腈(康科德科技有限公司)；
62.(7)甲醇(康科德科技有限公司)；
63.(8)高纯水为符合国际gb/t 6682-2008的一级水。
64.2、试剂配制
65.使用甲醇配制mvh储备液，再稀释得到标准工作液，mvh的标准工作曲线，浓度点为5ng/ml、20ng/ml、50ng/ml、100ng/ml、250ng/ml、500ng/ml，内标物mih工作溶液浓度为250ng/ml。
66.3、检测方案
67.一种异氰酸甲酯的检测方法，包括以下步骤：
68.1)样品前处理：
69.1-1)准确称取0.05g待测样品置于15ml的离心管中，加入3ml盐酸和醋酸的混合溶
液(1：1，v/v)，震荡混匀3min；
70.1-2)置于90℃恒温箱中加热降解0.5h，反应结束后冷却至室温；
71.1-3)反应产物用甲醇水溶液(1:1,v/v)定容至5ml，得到样品溶液；
72.1-4)在固相萃取96孔板内加入500μl的含有质量分数0.5％甲酸的乙腈甲醇混合液(1：1，v/v)，然后将200μl步骤1-3)得到的样品溶液加入固相萃取孔板内，并用移液枪将溶液混匀；
73.1-5)使用96位正压装置在固相萃取孔板上方施加正压力，使样品溶液通过固相萃取孔板的填料以进行净化，控制样品溶液流速为1ml/min；
74.1-6)收集固相萃取孔板下方流出的净化后的溶液，作为测试样。
75.2)采用液相色谱串联质谱法对测试样进行检测，然后利用标准曲线计算得到待测样品中异氰酸甲酯的含量。
76.液相色谱条件为：
77.色谱柱：venusil mp c18(2.1*150mm，5μm，)；
78.流动相：a相为含有质量分数0.1％甲酸的甲酸水，b相为乙腈；
79.梯度洗脱程序：0-0.2min，15％b；0.2-3min，85％b；3-3.2min，100％b；3-4min，100％b；4-4.1min，15％b；4.1-5.5min，15％b；
80.流速：0.6ml/min；进样量：20μl；柱温：40℃。
81.质谱条件条件为：
82.离子源参数：esi正模式；检测方式：多反应监测；电喷雾电压：4500v；气帘气：15；雾化气：65；辅助气：40；离子源温度：300℃。每种化合物的母离子、子离子、去簇电压、碰撞能量等质谱参数见表1。
83.表1质谱采集参数
[0084][0085]
其中，标准曲线的构建方法为：将以上配制的不同浓度的mvh标准工作液供液相色谱串联质谱法进行检测，从而获得标准曲线，如图1所示。目标物标准溶液与内标物溶液的浓度比与其峰面积比呈良好的线性关系，可得其线性方程为y＝1.0346x+0.0373(r2＝0.9988)。y为标准物质mvh与内标物mih的面积之比，x为标准物质mvh与内标物mih之比。
[0086]
参照图2，为目标物色谱图，图3为样品加标色谱图。
[0087]
参照图4，为样品前处理的原理示意图，本发明中，先从血红蛋白中提取mvh，使用了多官能化的复合吸附材料，以离子交换、反相、氢键等机理去除生物样品中的主要内源性干扰物质，同时将目标物留在样品溶液中，从而达到净化和富集的目的；最后采用液相色谱串联质谱法检测样品溶液，能够实现异氰酸甲酯的高精度检测。
[0088]
本实施例中，还对本发明的方法的加标回收率进行了检测，具体如下。
[0089]
由于血红蛋白样品中含有目标物mvh，无法获得空白样品。实验中取血红蛋白样品进行本底测试实验，加标样品实际值为测量值扣除掉样品中mvh的含量之后的数据。
[0090]
实验中取等量5份血红蛋白样品进行本底值测试，最后取5份样品的平均值用于加标回收率实验本底值扣除，测试结果如下表2所示，实验获得mvh本底平均值为7.1mg/kg。
[0091]
表2实验加标回收率
[0092][0093][0094]
尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节。