一种颠茄草药材特征图谱的建立方法及其应用与流程

1.本发明涉及中药材的特征图谱技术领域，具体涉及一种颠茄草药材特征图谱的建立方法及其应用。


背景技术：

2.颠茄为茄科植物颠茄atropa belladonna l.的干燥全草。在开花至结果期内采挖，除去粗茎和泥沙，切段干燥。颠茄主要含有莨菪类生物碱，包括天仙子胺(莨菪碱)、东莨菪碱、山莨菪碱等。由于该类生物碱具有解痉、镇痛、镇静等作用，具有较高的药用价值，但是，这些成分也存在于曼陀罗、莨菪等植物中，在生产颠茄草类相关提取物及制剂产品时，存在混用的风险；《中国药典》2020年版一部“颠茄草”项下，对颠茄草的质量控制指标中，在化学显色鉴别、薄层色谱鉴别、含量测定中均以生物碱为检测对象，存在重复评价的问题；颠茄草中除了含有莨菪类生物碱外，还含有香豆素类、糖苷类、黄酮类成分，香豆素类如东莨菪内酯，药理作用显示其具有抗肿瘤、抗炎镇痛、保肝、降血压等作用，糖苷类如东莨菪苷、槲皮素-3-o-半乳糖-(6
→
1)鼠李糖-7-o-葡萄糖苷、山柰素-3-o-半乳糖-(6
→
1)鼠李糖-7-o-葡萄糖苷等，黄酮类如芦丁，他们也具有镇痛抗炎等药理活性，另外，这些非生物碱成分的共同特点是在颠茄叶、花中含量较高，在颠茄草根、茎、果实中含量很低或者没有，而颠茄草是全草入药，在颠茄的收获期，有人为了单纯提高生物碱的含量，避免莨菪类生物碱含量不合格，使采收期延后，造成种子成熟较多，已基本无花，且叶子仅剩余少量顶部小叶，不符合颠茄草采收要求；同时，只剩顶部小叶，会引起上述除生物碱外其他活性成分较多的丧失，造成资源浪费。
3.目前，随着生活水平的提高，对健康需求的增加，医药市场不断繁荣发展，带动了颠茄提取物市场的繁荣扩大，国内种植颠茄草的地区越来越多，已从山东、湖南等主产区逐渐发展至黑龙江、陕西、新疆、江西、湖北、河南等地，由于颠茄草为外来引种植物，不存在“道地药材”之说，中国各地由于地理环境、土壤、种植水平等差异，导致各地的颠茄草在植物形态、生长周期、播种与成熟季节等方面存在较大差异，也可能会导致颠茄草中代表其植物特征的化学成分存在差异，进而影响药材的质量的均一稳定性，而国内至今未开展与颠茄草有关的特征成分研究。
4.为全面、合理地控制颠茄草的质量及合理利用颠茄草，有必要建立颠茄草的特征成分图谱，弥补颠茄草质量控制不足，使其更加完善、科学，指导颠茄草产业的健康发展，为药品的安全、有效、质量可靠提供技术支持。


技术实现要素：

5.针对上述情况，为克服现有技术之缺陷，本发明之目的就是提供一种颠茄草药材特征图谱的建立方法及其应用，可有效解决颠茄草质量控制不足的问题，利用该图谱能明显区别颠茄草和其他药材，并能保证颠茄草药材的植物完整性，为药材内在质量的进一步控制提供参考依据，提升、完善颠茄草质量控制水平，规范、保障临床用药。
6.为实现上述目的，本发明解决的技术方案是，一种颠茄草药材特征图谱的建立方法，包括以下步骤：
7.(1)、对照品溶液的制备：取东莨菪苷、绿原酸、槲皮素-3-o-半乳糖-(6
→
1)鼠李糖-7-o-葡萄糖苷、槲皮素-3-o-葡萄糖-(6
→
1)鼠李糖-7-o-葡萄糖苷、山柰素-3-o-半乳糖-(6
→
1)鼠李糖-7-o-葡萄糖苷、山柰素-3-o-葡萄糖-(6
→
1)鼠李糖-7-o-葡萄糖苷、东莨菪内酯、芦丁和山奈酚-3-o-鼠李糖半乳糖苷对照品，以体积浓度50％甲醇溶解，分别配成浓度为10.48μg
·
ml-1
、10.12μg
·
ml-1
、10.03μg
·
ml-1
、10.56μg
·
ml-1
、20.31μg
·
ml-1
、10.12μg
·
ml-1
、10.03μg
·
ml-1
、10.62μg
·
ml-1
和10.59μg
·
ml-1
的溶液，过微孔滤膜，得对照品溶液；
8.(2)、供试品溶液的制备：取颠茄草粉末2g，加入体积浓度50％甲醇25ml，在功率400w，频率60khz条件下，超声处理30min，冷却至室温，用体积浓度50％甲醇补足减失的重量，摇匀，过滤得滤液，再过微孔滤膜，得供试品溶液；
9.(3)、高效液相色谱分析：色谱条件为：ultimate xb-c
18
色谱柱(4.6mm
×
250mm，5μm)；流动相：a为甲醇，b为质量浓度0.05％磷酸水溶液，梯度洗脱顺序为：0～5min，3％～15％a，97％～85％b；5～60min，15％～60％a，85％～40％b；体积流量0.8ml
·
min-1
；检测波长344nm；柱温35℃；进样量10μl；
10.(4)、测定：分别吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入高效液相色谱仪，测定，以山柰素-3-o-半乳糖-(6
→
1)鼠李糖-7-o-葡萄糖苷为特征图谱参照物，以山柰素-3-o-半乳糖-(6
→
1)鼠李糖-7-o-葡萄糖苷色谱峰为参照物峰，测定生成16批颠茄草药材的指纹图谱，采用相对保留时间标定颠茄草的共有特征峰，得颠茄草药材特征图谱。
11.所述的颠茄草药材特征图谱共有特征峰有17个，其中8号峰为山柰素-3-o-半乳糖-(6
→
1)鼠李糖-7-o-葡萄糖苷，以参照物峰相应的峰为s峰，所述17个共有特征峰的相对保留时间分别为：峰1：0.44
±
0.05；峰2：0.62
±
0.05；峰3：0.70
±
0.05；峰4：0.77
±
0.05；峰5：0.80
±
0.05；峰6：0.91
±
0.05；峰7：0.92
±
0.05；峰8(s)：1.00
±
0.05；峰9：1.03
±
0.05；峰10：1.09
±
0.05；峰11：1.46
±
0.05；峰12：1.58
±
0.05；峰13：1.61
±
0.05；峰14：1.64
±
0.05；峰15：1.71
±
0.05；峰16：1.81
±
0.05；峰17：2.02
±
0.05。
12.所述方法建立的颠茄草特征图谱在颠茄草药材质量控制中的应用。
13.本发明颠茄草药材特征图谱的建立方法及特征图谱，专属性好、重现性好、精密度高、稳定性好，能有效地鉴别颠茄草药材的真伪，可反映颠茄草药材质量的优劣，完善颠茄草药材的质量评价体系，为进一步提高完善颠茄草标准提供参考依据，规范、保障临床用药，有显著的社会和经济效益。
附图说明
14.图1是本发明颠茄草药材的hplc特征图谱。
15.图2是本发明颠茄草药材的hplc特征图谱的共有模式曲线图(其中，3-东莨菪苷；4-绿原酸；6-槲皮素-3-o-半乳糖-(6
→
1)鼠李糖-7-o-葡萄糖苷；7-槲皮素-3-o-葡萄糖-(6
→
1)鼠李糖-7-o-葡萄糖苷；8-山柰素-3-o-半乳糖-(6
→
1)鼠李糖-7-o-葡萄糖苷；9-山柰素-3-o-葡萄糖-(6
→
1)鼠李糖-7-o-葡萄糖苷；10-东莨菪内酯；11-芦丁；12-山奈酚-3-o-鼠李糖半乳糖苷)。
16.图3是本发明hplc混合对照品图谱(其中，3-东莨菪苷；4-绿原酸；6-槲皮素-3-o-半乳糖-(6
→
1)鼠李糖-7-o-葡萄糖苷；7-槲皮素-3-o-葡萄糖-(6
→
1)鼠李糖-7-o-葡萄糖苷；8-山柰素-3-o-半乳糖-(6
→
1)鼠李糖-7-o-葡萄糖苷；9-山柰素-3-o-葡萄糖-(6
→
1)鼠李糖-7-o-葡萄糖苷；10-东莨菪内酯；11-芦丁；12-山奈酚-3-o-鼠李糖半乳糖苷)。
17.图4是本发明不同产地颠茄草聚类分析树状图。
18.图5是本发明颠茄草不同部位hplc特征图谱比较曲线图。
19.图6是本发明正常采收期颠茄草与延后采收颠茄草hplc特征图谱比较曲线图(其中，a:正产采收期采收的颠茄草；b：延后采收的颠茄草(缺失叶、花))。
具体实施方式
20.以下结合实施例对本发明的具体实施方式作详细说明。
21.本发明一种颠茄草药材特征图谱的建立方法，包括以下步骤：
22.(1)、对照品溶液的制备：取东莨菪苷、绿原酸、槲皮素-3-o-半乳糖-(6
→
1)鼠李糖-7-o-葡萄糖苷、槲皮素-3-o-葡萄糖-(6
→
1)鼠李糖-7-o-葡萄糖苷、山柰素-3-o-半乳糖-(6
→
1)鼠李糖-7-o-葡萄糖苷、山柰素-3-o-葡萄糖-(6
→
1)鼠李糖-7-o-葡萄糖苷、东莨菪内酯、芦丁和山奈酚-3-o-鼠李糖半乳糖苷对照品，以体积浓度50％甲醇溶解，分别配成浓度为10.48μg
·
ml-1
、10.12μg
·
ml-1
、10.03μg
·
ml-1
、10.56μg
·
ml-1
、20.31μg
·
ml-1
、10.12μg
·
ml-1
、10.03μg
·
ml-1
、10.62μg
·
ml-1
和10.59μg
·
ml-1
的溶液，用0.22μm微孔滤膜过滤，得对照品溶液；
23.(2)、供试品溶液的制备：取颠茄草粉末2g，加入体积浓度50％甲醇25ml，在功率400w，频率60khz条件下，超声处理30min，冷却至室温，用体积浓度50％甲醇补足减失的重量，摇匀，过滤得滤液，再用0.22μm微孔滤膜过滤，得供试品溶液；
24.(3)、高效液相色谱分析：色谱条件为：ultimate xb-c
18
色谱柱(4.6mm
×
250mm，5μm)；流动相：a为甲醇，b为质量浓度0.05％磷酸水溶液，
25.梯度洗脱顺序为：
26.时间(min)
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
流动相a(％)
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
流动相b(％)
27.0～5
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
3～15
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
97～85
28.5～60
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
15～60
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
85～40
29.体积流量0.8ml
·
min-1
；检测波长344nm；柱温35℃；进样量10μl；
30.(4)、测定：分别吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入高效液相色谱仪，测定，供试品中选择稳定性较好，吸收强，特征明显的色谱峰为特征图谱共有峰，并以分离度好、含量较高、周围无干扰的色谱峰为参照峰，以山柰素-3-o-半乳糖-(6
→
1)鼠李糖-7-o-葡萄糖苷为特征图谱参照物，以山柰素-3-o-半乳糖-(6
→
1)鼠李糖-7-o-葡萄糖苷色谱峰为参照物峰，测定生成16批颠茄草药材的指纹图谱，采用相对保留时间标定颠茄草的共有特征峰，共有峰有17个，其中8号峰为山柰素-3-o-半乳糖-(6
→
1)鼠李糖-7-o-葡萄糖苷。
31.上述颠茄草药材特征图谱的建立方法而得到的颠茄草药材的特征图谱，所述建立的颠茄草的特征图谱具有17个共有特征峰，以参照物峰相应的峰为s峰，所述17个共有特征峰的相对保留时间分别为：峰1：0.44
±
0.05；峰2：0.62
±
0.05；峰3：0.70
±
0.05；峰4：0.77
±
0.05；峰5：0.80
±
0.05；峰6：0.91
±
0.05；峰7：0.92
±
0.05；峰8(s)：1.00
±
0.05；峰9：
1.03
±
0.05；峰10：1.09
±
0.05；峰11：1.46
±
0.05；峰12：1.58
±
0.05；峰13：1.61
±
0.05；峰14：1.64
±
0.05；峰15：1.71
±
0.05；峰16：1.81
±
0.05；峰17：2.02
±
0.05。具体试验资料如下。
32.一、仪器与材料
33.1.1、药材
34.16批次颠茄草药材样品采集于全国不同种植区，详见表1，5批不同部位药材与2批植株完整性有差异的药材采集于河南新县中药材种植示范基地，详见表2，经河南中医药大学王浴铭教授鉴定为茄科植物颠茄atropa belladonna l.的干燥全草。
35.表1颠茄草药材样品信息
[0036][0037][0038]
表2不同部位颠茄草样品信息
[0039][0040]
1.2、仪器与试剂
[0041]
lc-20ad型hplc仪及配备的dgc-20a型在线脱气系统、sil-20a型自动进样系统、cto-20ac型柱温箱、spd-m20a型二极管阵列检测器(日本shimadzu公司)；ultimate xb-c
18 5μm(4.6*250mm，5μm)(月旭科技上海股份有限公司)；dhg-9075a电热鼓风干燥箱(上海一恒科学仪器有限公司)；114b摇摆式高速中药粉碎机(瑞安市永历制药机械有限公司)；xse204万分之一电子天平(d＝0.1mg)(瑞士梅特勒-托利多公司)；xpe105十万分之一电子天平(d
＝0.01mg)(瑞士梅特勒-托利多公司)；kq-600vde双频数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)。色谱甲醇(天津四友精细化学品有限公司，批号：673550)，水为注射用水，其他试剂均为分析纯。绿原酸(批号110753-202006，含量为99.1％)，芦丁(批号100080-202002，含量为98.8％)，东莨菪内酯(批号：110768-200504，含量为100.0％)，均购自中国食品药品检定研究院；东莨菪苷(含量为99.2％)、槲皮素-3-o-半乳糖-(6
→
1)鼠李糖-7-o-葡萄糖苷(含量为99.1％)、槲皮素-3-o-葡萄糖-(6
→
1)鼠李糖-7-o-葡萄糖苷(含量为98.8％)、山柰素-3-o-半乳糖-(6
→
1)鼠李糖-7-o-葡萄糖苷(含量为99.6％)、山柰素-3-o-葡萄糖-(6
→
1)鼠李糖-7-o-葡萄糖苷(含量为99.5％)、山奈酚-3-o-鼠李糖半乳糖苷(含量为99.2％)，均购自北京中科质检生物技术有限公司。
[0042]
二、实验方法
[0043]
2.1、提取溶剂种类的考察
[0044]
药材取样量为2g，分别以30％甲醇水溶液、50％甲醇水溶液、70％甲醇水溶液为提取溶剂，采用超声提取方法，对同一批供试品进行了提取溶剂种类考察。
[0045]
结果表明(图未示出)，30％甲醇水溶液色谱峰较少，50％甲醇水溶液与70％甲醇水溶液提取效果相当，出峰均较多，峰面积无显著差异，考虑环保因素，选用50％甲醇水溶液作为供试品提取溶剂。
[0046]
2.2、提取溶剂用量的考察
[0047]
药材取样量为2g，分别以15ml、25ml、35ml 50％甲醇水溶液作为提取溶剂，采用超声提取方法，对同一批供试品进行了提取溶剂用量考察。
[0048]
结果表明(图未示出)，15ml 50％甲醇水溶液未能全部淹没药材，35ml 50％甲醇水溶液提取样品进样后，含量小的成分出峰不明显，影响样品特征图谱对比，因此，选用50％甲醇水溶液作为供试品提取溶剂。
[0049]
2.3、超声功率考察
[0050]
药材取样量为2g，以50％甲醇水溶液为提取溶剂，采用超声提取方法，频率60khz，功率分别选择200w、400w、600w，对同一批供试品进行超声功率考察。
[0051]
结果表明(图未示出)，200w功率超声，50％甲醇水溶液提取样品进样后，含量小的成分出峰不明显，400w与600w超声效果无明显差异，样品提取率较高，出峰明显，考虑节约能源，选用400w作为超声功率。
[0052]
2.4、超声时间考察
[0053]
药材取样量为2g，以50％甲醇水溶液为提取溶剂，超声功率400w，频率60khz,超声时间分别选择15min、30min、45min，对同一批供试品进行超声功率考察。
[0054]
结果表明(图未示出)，超声15分钟，50％甲醇水溶液提取样品进样后，含量小的成分出峰不明显，超声30、45分钟，样品各峰面积无明显差异，样品提取率较高，出峰明显，考虑节约能源，选用30min作为超声时间。
[0055]
2.5、色谱柱的选择
[0056]
不同来源、品牌的色谱柱具有一定的差异，同一来源的色谱柱也有不同程度的差别，柱效(理论塔板数)、保留时间、分离度、对称因子都有差别，在本实验中色谱条件相同的情况下，进行了不同厂家同一规格的c18两根高效液相色谱柱进行考察。
[0057]
色谱柱规格如下：
[0058]
(1)、ultimate xb-c
18
(250mm
×
4.6mm，5μm)批号2101.105。
[0059]
(2)、agilent zorbax sb-c18(250mm
×
4.6mm，5μm)批号b11248。
[0060]
结果表明(图未示出)，在ultimate xb-c
18
柱(250mm
×
4.6mm,5μm)色谱柱中，各峰的分离度较好、基线较平稳。
[0061]
2.6、检测波长的选择
[0062]
文献研究表明，黄酮、香豆素类成分在200～400nm区域具有存在主要紫外吸收带，采用二极管阵列检测器对样品进行全波长检测，通过对比得出在波长为344nm时所得到的色谱峰的分离度、峰面积、保留时间、对称因子比较好及得到峰的个数比较多，基线较平稳，故本研究选用在344nm波长下测定，(图未示出)。
[0063]
2.7、流动相系统的选择
[0064]
分别采用3种梯度洗脱方式，考察样品出峰情况：
[0065]
(1)、梯度洗脱(0～5min，3％～25％a；5～100min，25％～60％a)；
[0066]
(2)、梯度洗脱(0～5min，3％～15％a；5～100min，15％～60％a)；
[0067]
(3)、梯度洗脱(0～5min，3％～10％a；5～100min，10％～60％a)。
[0068]
结果表明(图未示出)，第1种梯度方式，样品中存在部分峰面积分离度偏小，峰分不开情况，第3种情况，样品在100分钟检测时间结束，尚有未出完的峰，分析时间较长，第2中梯度方式，样品出峰时间适中，60min所有峰即可出完，各峰分离度适中，基线平稳，故选择第2种梯度洗脱方式，洗脱时间定位60min。
[0069]
2.8、柱温的选择
[0070]
分别考察了30℃、35℃、40℃三个不同的柱温进行比较，在其它色谱条件相同情况下，35℃时各峰分离效果最好，所以最后确定柱温为35℃(图未示出)。
[0071]
2.9、流速的选择
[0072]
分别考察了不同流速(1ml/min、0.8ml/min、0.6ml/min)对颠茄草色谱峰的分离效果、保留时间、峰面积、对称因子的影响，结果显示流速为0.8ml/min时得到的图谱分离度比较好，故本研究选择采用的流速为0.8ml/min(图未示出)。
[0073]
2.10、确定指纹图谱色谱条件
[0074]
根据以上考察的结果，色谱条件为：ultimate xb-c18色谱柱(4.6mm
×
250mm,5μm)；流动相：a为甲醇，b为0.05％磷酸水溶液，梯度洗脱(0～5min，3％～15％a；5～60min，15％～60％a)；体积流量0.8ml
·
min-1
；检测波长344nm；柱温35℃；进样量10μl。
[0075]
2.11、参照峰的选择
[0076]
在实验所建立的特征图谱中山柰素-3-o-半乳糖-(6
→
1)鼠李糖-7-o-葡萄糖苷(8号峰)的色谱峰分离良好，具有较大的峰面积、适中的保留时间且为所有样品共有，因此，选择山柰素-3-o-半乳糖-(6
→
1)鼠李糖-7-o-葡萄糖苷为参照峰。
[0077]
三、制备方法
[0078]
3.1、对照品溶液的制备：取东莨菪苷、绿原酸、槲皮素-3-o-半乳糖-(6
→
1)鼠李糖-7-o-葡萄糖苷、槲皮素-3-o-葡萄糖-(6
→
1)鼠李糖-7-o-葡萄糖苷、山柰素-3-o-半乳糖-(6
→
1)鼠李糖-7-o-葡萄糖苷、山柰素-3-o-葡萄糖-(6
→
1)鼠李糖-7-o-葡萄糖苷、东莨菪内酯、芦丁和山奈酚-3-o-鼠李糖半乳糖苷对照品，以体积浓度50％甲醇溶解，分别配成浓度为10.48μg
·
ml-1
、10.12μg
·
ml-1
、10.03μg
·
ml-1
、10.56μg
·
ml-1
、20.31μg
·
ml-1
、
10.12μg
·
ml-1
、10.03μg
·
ml-1
、10.62μg
·
ml-1
和10.59μg
·
ml-1
的溶液，再用0.22μm微孔滤膜过滤，即为对照品溶液。
[0079]
3.2、供试品溶液的制备：取颠茄草粉末2g，精密称定，精密加入体积浓度50％甲醇25ml，称定重量，超声处理30min(功率400w，频率60khz)，冷却后用50％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，用0.22μm微孔滤膜过滤，即得。
[0080]
四、特征图谱方法学考察
[0081]
4.1、精密度试验
[0082]
精密称取山东烟台牟平高陵镇颠茄草药材的干燥粉末(s14)1份2.0g，按照“3.2”项供试品溶液制备的方法，制备同一供试品，按“2.10”项下色谱条件连续进样6次，记录图谱，以8号峰为参照峰，17个共有峰的相对保留时间和相对峰面积的rsd分别小于1.3％和3.5％，表明本研究所用的仪器精密度良好，结果见表3-1、表3-2、表4-1、表4-2。
[0083]
表3-1共有峰相对保留时间数据
[0084][0085]
表3-2共有峰相对保留时间数据
[0086][0087]
表4-1共有峰相对峰面积数据
[0088][0089]
表4-2共有峰相对峰面积数据
[0090][0091]
4.2、重复性试验
[0092]
精密称取山东烟台牟平高陵镇颠茄草药材的干燥粉末(s14)平行6份，各2.0g，按照“3.2”项供试品溶液制备的方法，制备供试品，按“2.10”项下色谱条件测定，记录图谱，以8号峰为参照峰，17个共有峰的相对保留时间和相对峰面积的rsd分别小于2.0％和4.5％，表明实验重复性良好，结果见表5-1、表5-2、表6-1、表6-2。
[0093]
表5-1共有峰相对保留时间数据
[0094][0095]
表5-2共有峰相对保留时间数据
[0096][0097]
表6-1共有峰相对峰面积数据
[0098][0099]
表6-2共有峰相对峰面积数据
[0100][0101]
4.3、稳定性试验
[0102]
精密称取山东烟台牟平高陵镇颠茄草药材的干燥粉末(s14)1份2.0g，按照“3.2”项供试品溶液制备的方法，制备供试品，分别于0h、2h、4h、8h、12h、24h按“2.10”项下色谱条件测定，记录图谱，以8号峰为参照峰，17个共有峰的相对保留时间和相对峰面积的rsd分别小于1.3％和3.8％，表明实验稳定性良好，结果见表7-1、表7-2、表8-1、表8-2。
[0103]
表7-1共有峰相对保留时间数据
[0104][0105]
表7-2共有峰相对保留时间数据
[0106][0107]
表8-1共有峰相对峰面积数据
[0108][0109]
表8-2共有峰相对峰面积数据
[0110][0111]
五、颠茄草特征图谱的建立与评价
[0112]
5.1、流动相空白考察
[0113]
在“2.10”色谱条件下，不进样，单运行程序考察60min的色谱图，未检测到任何色谱峰(图未示出)，结果表明流动相对特征图谱检测无影响。
[0114]
5.2、空白溶剂影响的考察
[0115]
在“2.10”色谱条件下记录空白溶剂(50％甲醇水溶液)60min的色谱图，未检测到任何色谱峰(图未示出)，结果表明空白溶剂对特征图谱检测无影响。
[0116]
5.3、各产地颠茄草药材的特征图谱采集
[0117]
选取不同产地颠茄草药材样品16批，按照“3.2”项下方法制备各批次样品的供试品溶液，按照“2.10”项下色谱条件进行测定，记录各批次样品色谱图。采用仪器自带软件将所有色谱图叠加，根据叠加图谱中色谱峰分布，选择各批次共有色谱峰作为特征峰，建立统一处理方法处理各批次样品色谱图，确保每一批次特征峰均能被积分。
[0118]
再将上述色谱图导入《中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2012年版)》进行特征图谱分析，以任意样品的色谱图为参照图谱，采用中位数法，设置时间窗宽度为0.1min，进行多点校正和色谱峰匹配，经全峰匹配后得到颠茄草药材的叠加特征图谱和对照特征图谱(r)，结果显示，16批颠茄草药材均有17个共有峰，按出峰时间依次标记为1～17号峰。详见图1、图2。
[0119]
5.4、特征峰的指认
[0120]
为考察特征图谱是否具有代表性以及能否表征所含成分的专属性，取“3.1”项下混合对照品溶液，按“2.10”项下色谱条件进样测定，记录色谱图。将所得色谱图与“5.3”项下颠茄草药材的色谱图进行比对，通过对照品比对，如图3，明确相对保留时间依次为0.70
±
0.05、0.77
±
0.05、0.91
±
0.05、0.92
±
0.05、1.00
±
0.05、1.03
±
0.05、1.09
±
0.05、1.46
±
0.05、1.58
±
0.05的色谱峰分别对应东莨菪苷(峰3)、绿原酸(峰4)、槲皮素-3-o-半乳糖-(6
→
1)鼠李糖-7-o-葡萄糖苷(峰6)、槲皮素-3-o-葡萄糖-(6
→
1)鼠李糖-7-o-葡萄糖苷(峰7)、山柰素-3-o-半乳糖-(6
→
1)鼠李糖-7-o-葡萄糖苷(峰8)、山柰素-3-o-葡萄糖-(6
→
1)鼠李糖-7-o-葡萄糖苷(峰9)、东莨菪内酯(峰10)、芦丁(峰11)、山奈酚-3-o-鼠李糖半乳糖苷(峰12)。
[0121]
以上指认特征峰均为颠茄草药材中有效成分，因此认定建立的特征图谱具有代表性，能对颠茄草药材进行质量控制。通过对照品对特征峰进行指认后，选取主要有效成分8号峰(山柰素-3-o-半乳糖-(6
→
1)鼠李糖-7-o-葡萄糖苷)作为参照峰(s)；计算上述17个共有峰与s峰的相对保留时间(表9-1、表9-2)和相对峰面积(表10-1、表10-2)。
[0122]
表9-1不同产地颠茄草药材共有峰的相对保留时间
[0123][0124][0125]
表9-2不同产地颠茄草药材共有峰的相对保留时间
[0126][0127]
表10-1不同产地颠茄草药材共有峰的相对峰面积
[0128][0129][0130]
表10-2不同产地颠茄草药材共有峰的相对峰面积
[0131][0132]
由上述结果显示，各批次样品特征峰的相对保留时间rsd小于0.25％，说明特征峰出峰时间相对稳定；而相对峰面积rsd结果显示，各批次特征峰的峰面积差异较大，反映了全国不同省份产地来源批次颠茄草药材的差异性。
[0133]
5.5、聚类分析
[0134]
为进一步比较全国范围不同产地颠茄草药材的差异，以颠茄草特征图谱中17个共有峰峰面积为变量，导入spss 22.0软件，采用组间联接法，平方欧式距离为测度，对其进行q型聚类分析，结果见图4。由聚类结果可知，16批样品在平方欧式距离为5～10时，16批颠茄草药材分为4大类，河南固始县黎集乡，河南光山晏河乡，湖南新田骥村，湖南新田县毛里
乡，湖南新田县新圩镇，湖南新田县知市坪镇，河南新县吴陈河乡，陕西旬阳县，周口西华县，驻马店正阳县产颠茄草聚为一类；江西赣州，江西上高产颠茄草聚为一类；黑龙江牡丹江，新疆库尔勒产颠茄草聚为一类；山东蓬莱，山东烟台牟平高陵镇产颠茄草聚为一类。由此可以看出，不同批次的药材由于地理位置等环境的影响，化学成分含量有明显的差异。
[0135]
5.6、颠茄草不同部位特这图谱比较
[0136]
为确保采收时段的合理，本发明对颠茄草不同部位特征图谱进行分析对比，结果如图5所示，结果表明根、果实、茎中特征峰峰面积很小，有的特征峰几乎没有，叶、花中特征峰峰面积相对较大，且特征峰完整，说明采收时间延后，特征图谱中特征峰由于叶、花的大量减少以及缺失，会造成颠茄草整体特征图谱的相关特征峰的消失，使颠茄草中除生物碱外其他有效成分损失，如图6。通过对颠茄草特征图谱分析，可以有效判定颠茄草整株完整性情况，有利于加强颠茄草质量控制。
[0137]
5.7、结论
[0138]
中药化学成分复杂多样，有效成分难以一一明确，如何在化学成分不完全明确的前提下对药材进行质量控制十分有必要。本研究建立的颠茄草hplc特征图谱，提取到17个共有峰，以8号峰(山柰素-3-o-半乳糖-(6
→
1)鼠李糖-7-o-葡萄糖苷)为参照峰，计算其他共有峰的相对峰面积，并对结果进行了聚类分析。通过对前处理方法和仪器条件进行优化，使得该条件下，颠茄草各化学成分在60min之内得到良好的分离，为颠茄草质量控制增添了一种更稳定有效的方法。在数据分析中，特征图谱主要强调特征峰的特征信息，用特征峰的信息来进行聚类分析，将其应用于质量标准中更易操作、好推广。
[0139]
由上述可知，本发明一种颠茄草药材特征图谱的建立方法及特征图谱，有利于全面监控颠茄草药材的质量，与现有技术相比，具有如下有益效果：
[0140]
(1)、本发明具有专属性好、重现性好、精密度高、稳定性好的特点，
[0141]
(2)、本发明的颠茄草hplc特征图谱共有17个共有特征峰，通过比较特征图谱中共有峰的有无，能有效地鉴别颠茄草药材的真伪，可反映颠茄草药材质量的优劣，完善颠茄草药材的质量评价体系；
[0142]
(3)、本发明的颠茄草特征图谱作为标准特征图谱经多批样品验证后可用于颠茄草质量控制中，用于从整体上评价和控制颠茄草药材的质量，避免了依靠单一化学成分判定颠茄草整体质量造成的片面性，指导颠茄草合理的采收时节，避免了颠茄草一味追求生物碱含量而忽视其他有效成分含量，造成采收期过晚，叶、花损失过多，药材以次充好现象发生，为进一步提高完善颠茄草标准提供参考依据，规范、保障临床用药。