一种类酶活性的镧系纳米材料及其在有机磷农药可视化快速检测中的应用

1.本发明涉及纳米技术和分析检测技术领域，具体涉及一种类酶活性的镧系纳米材料及其在有机磷农药可视化快速检测中的应用。


背景技术：

2.有机磷农药(organophosphorus pesticides，ops)在杀虫、杀菌和除草等方面发挥着重要作用。在全球范围内有机磷农药每年的用量可占全部农药用量的38％。有机磷农药具有毒性高、持久性长的特点，大量使用农药使得其在农产品、海产品及环境中不断积累，严重危害着公众健康。有机磷农药的病理机制主要与胆碱神经系统有关，其与乙酰胆碱酯酶作用形成磷酰化胆碱酯酶，导致胆碱酯酶失去催化乙酰胆碱的水解作用，积聚的乙酰胆碱使得神经过度兴奋，引起毒蕈碱样、烟碱样和中枢神经系统症状，严重的可引起死亡。高灵敏度快速检测有机磷农药可起到积极的预警作用以有效降低其危害。目前对有机磷农药的检测主要依赖于传统方法如高效液相色谱法、毛细管电泳法、气质联用等，这些检测方法虽然检出限较低，但要么所需检测仪器昂贵，要么样品预处理过程复杂且耗时较长。针对以上问题，科研人员开发了多种检测有机磷农药的生物传感器如荧光传感器、比色传感器、电化学传感器等。
3.比色法是基于beer-lambert定律而衍生出的一种方法，通过简单的紫外-可见光光谱仪器测定相关生色团的吸光度就可以推知待测物质的准确浓度；而只需要通过肉眼对颜色的分别，也可以实现对目标物的半定量。但由于天然酶合成复杂，成本较高，不易储存，催化性能不可控等，纳米酶的合成和应用就显得尤为重要。


技术实现要素：

4.针对上述现有技术，本发明的目的是提供一种类酶活性的镧系纳米材料及其在有机磷农药可视化快速检测中的应用。
5.为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
6.本发明第一方面，提供一种类酶活性的镧系纳米材料(dpa-ce-gmp)，所述的镧系纳米材料由以下方法制得：
7.(1)ce(ch3coo)3与鸟苷5'-单磷酸(gmp)溶液混合，经涡旋后产生白色沉淀，离心收集白色沉淀，并复溶于吡啶二羧酸(dpa)溶液中得混合溶液，再次涡旋后，混合溶液变得澄清透明，将混合溶液放入紫外灯箱中紫外照射得黄褐色溶液；
8.(2)将黄褐色溶液放入透析袋中透析得透析液；
9.(3)将透析液冷冻干燥后，研磨成黄褐色粉末即为dpa-ce-gmp。
10.作为优选，ce(ch3coo)3溶液，gmp溶液和dpa溶液的体积比为1:1:2。
11.作为优选，涡旋时间为1-3min，进一步优选的，涡旋时间为2min。
12.作为优选，混合溶液放入紫外灯箱紫外照射时间为20-40min，进一步优选的，照射
时间为30min。
13.作为优选，透析袋的透析时间为8-16h，进一步优选的，透析时间为12h。
14.进一步的，本发明的第二方面，基于dpa-ce-gmp优良的催化性能，提供在有机磷农药可视化快速检测中的应用。
15.本发明的第三方面，提供了有机磷农药可视化快速检测方法，包括以下步骤：
16.(1)将有机磷农药与乙酰胆碱酯酶(ache)混匀孵育得第一混合液，随后向第一混合液中加入乙酰胆碱(atch)，混匀孵育得第二混合液；
17.(2)将dpa-ce-gmp复溶于tris-hcl缓冲液中得第三混合溶液，将第二混合液加入第三混合溶液中，再加入tmb溶液于第三混合溶液中，混合均匀形成检测体系；
18.(3)根据检测体系的颜色变化对有机磷农药进行定性检测和根据紫外-可见吸收光谱的强度变化对有机磷农药进行定量检测。
19.作为优选，所述类酶纳米材料dpa-ce-gmp为本实验室合成。
20.作为优选，所述有机磷农药(敌敌畏)、乙酰胆碱酯酶(ache)、乙酰胆碱(atch)均从从阿拉丁试剂(上海)有限公司购买。
21.作为优选，所述反应体系均为400μl。
22.作为优选，有机磷农药、ache和atch的体积比为13:13:10。
23.作为优选的，步骤(2)中第二混合液和第三混合液的体积比为1:10。
24.作为优选，atch浓度为2-3mm，进一步优选的，atch浓度为1mm。
25.作为优选，乙酰胆碱酯酶活浓度为0.5-3.0u/ml，进一步优选的，乙酰胆碱酯酶活浓度为2u/ml。
26.作为优选，tmb浓度为0.1-1.0mm，进一步优选的，tmb浓度为0.6mm。
27.作为优选，tris-hcl缓冲液ph为5.5-10.0，进一步优选的，tris-hcl缓冲液ph为6.5。
28.作为优选，dpa-ce-gmp浓度为0.05-0.15mg/ml，进一步优选的，dpa-ce-gmp浓度为0.1mg/ml。
29.本发明的有益效果：
30.本发明中的dpa-ce-gmp具有合成简单、成本可控、稳定易储存、催化活性可调节、具有更大的比表面积、对外部刺激响应灵敏的特点，且更容易催化tmb显色的特点，应用于有机磷农药的可视化快速检测，克服了传统有机磷农药检测方法耗时久、专业操作技术限制的缺点，具有操作简捷快速、反应条件温和、经济实用等优点；同时，也可使用裸眼实现有机磷农药的半定量检测；实现了实际水样中有机磷农药的可视化检测。因此，该发明方法具有原始创新性、良好的社会价值和应用前景。
附图说明
31.图1为可视化比色检测方法用于有机磷农药检测的检测原理图；
32.图2为实施例2中构建可视化比色传感方法检测有机磷农药的可行性验证；
33.图3为实施例3中可视化比色传感方法检测有机磷农药的实验条件优化；
34.图4为实施例4中可视化比色传感方法对不同浓度有机磷农药的检测能力探究；
35.图5为实施例5中可视化比色传感方法抗干扰研究；
36.图6为实施例6中可视化比色传感方法对有机磷农药的普适性研究。
具体实施方式
37.应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本技术提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本技术所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
38.如前所述，有机磷农药具有毒性高、持久性长的特点，大量使用农药使得其在农产品、海产品及环境中不断积累，严重危害着公众健康。科研人员开发了多种检测有机磷农药的生物传感器，其中比色传感器具有检测速度快，可视化的特点，因此利用类酶活性纳米材料进行有机磷农药的检测显得尤为重要。
39.基于此，本发明提供了基于dpa-ce-gmp良好催化性能的有机磷农药可视化快速检测方法的，其原理如图1所示。首先合成了dpa-ce-gmp，进一步构建了一种基于dpa-ce-gmp催化3,3',5,5'-四甲基联苯胺(tmb)的可视化比色方法用于有机磷农药的检测。采用atch作为ache催化底物，atch会被催化分解为巯基胆碱(tch)，其末端还原性巯基能够抑制dpa-ce-gmp的催化性能；当有机磷农药存在时，乙酰胆碱酯酶的活性被抑制，无还原性巯基产生，dpa-ce-gmp催化tmb快速显蓝色，导致有机磷农药浓度依赖性的tmb的蓝色越来越深，达到对有机磷农药的便捷且低成本的可视化比色检测目的。
40.本发明中基于dpa-ce-gmp优良的催化性能建立的有机磷农药可视化快速检测方法，具体如下：
41.(1)取敌敌畏溶液10μl加入到容积为600μl的ep管中，再加入10μl的乙酰胆碱酯酶溶液，混合均匀，静置得第一混合液；
42.(2)向第一混合液中加入10μlatch溶液，混合均匀后，37℃放置孵育得第二混合液；
43.(3)将第二混合液加入dpa-ce-gmp的tris-hcl缓冲液(其中含有10μltmb溶液)混合均匀得第三混合液；
44.(2)通过紫外-可见光光谱仪和裸眼对第三混合液进tmb吸收光谱和颜色信号收集，实现定量或定性分析。
45.为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本技术的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本技术的技术方案。
46.本发明实施例中所用的试验材料均为本领域常规的试验材料，均可通过商业渠道购买得到。
47.实施例1：dpa-ce-gmp/tmb的制备
48.(1)10mm的ce(ch3coo)3与10mm的gmp溶液混合，经涡旋2min后产生白色沉淀，离心收集白色沉淀，并复溶于10mm的dpa溶液中，其中ce(ch3coo)3、gmp溶液和dpa溶液的体积比为1:1:2，涡旋2min后，混合溶液变得澄清透明，将该混合溶液放入紫外灯箱中紫外照射30min，溶液变为黄褐色；
49.(2)将该黄褐色溶液放入分子量为10kda透析袋中透析12h。收集透析袋中的溶液经冷冻干燥后，研磨成黄褐色粉末即为dpa-ce-gmp。
50.实施例2：可视化比色传感方法用于有机磷农药检测的可行性验证
51.在以下情况下利用紫外分光光度计检测tmb的吸收光谱，如图2所示，
52.(1)dpa-ce-gmp/tmb的混合溶液(dpa-ce-gmp：0.1mg/ml，tmb：0.6mm)；
53.(2)2u/ml的ache溶液与dpa-ce-gmp/tmb混合后；
54.(3)1mm的atch溶液与dpa-ce-gmp/tmb混合后；
55.(4)ache和atch混合反应后再与dpa-ce-gmp/tmb混合；
56.(5)100μg/l的敌敌畏溶液先与ache混合孵育，然后加入到atch溶液中，最后将该混合溶液与dpa-ce-gmp/tmb混合。tmb的吸收光谱的范围为500-750nm。
57.结果分析：由图2a中的紫外光谱1、2和3和图2b中1、2和3号反应皿可知，dpa-ce-gmp可催化氧化tmb显蓝色，并在650nm左右有很强的吸收峰。而单独的ache和atch并不能改变dpa-ce-gmp催化tmb的能力；图2a的光谱4是由于ache和atch产生的具有较强还原性的tch抑制了dpa-ce-gmp的催化活性，tmb不能被催化，其在650nm几乎没有特征峰，且图2b中4号反应皿无色；在图2a的光谱5和图2b中5号反应皿，当ops加入到ache溶液中后，致使ache失活，不能催化atch产生tch，此时的反应体系中dpa-ce-gmp催化能力不被抑制，可催化tmb显蓝色，并在650nm处出现很强的吸收峰。
58.实施例3：可视化比色传感方法检测有机磷农药的实验条件优化及有机磷农药的可视化快速检测体系的建立
59.可视化比色传感方法检测有机磷农药的实验条件优，其中优化浓度和ph均为形成检测体系的浓度和ph：
60.(1)优化tmb的浓度，如图3a，在含有0.1mg/ml的dpa-ce-gmp的缓冲液中加入不同浓度的tmb(0,0.1,0.2,0.3,0.4,0.5,0.6,0.7,0.8,0.9,1.0mm)后混合均匀，测定tmb的吸光度值；
61.(2)优化ache的酶活性浓度，如图3b，向1mm的atch加入不同酶活性浓度的ache(0,0.5,1.0,1.5,2.0,2.5,3.0u/ml),混合均匀，孵育一段时间，随后分别加入含有dpa-ce-gmp/tmb体系的缓冲液中，混合均匀，测定tmb的吸光度值；
62.(3)优化缓冲液ph，如图3c,将0.1mg/ml的dpa-ce-gmp溶于不同ph(5.5,6.0,6.5,7.0,7.5,8.0,8.5,9.0,9.5,10.0)的tris-hcl缓冲液中，向其中分别加入0.6mm的tmb，混合均匀，测定tmb的吸光度值。
63.结果分析：由图3a可知，当dpa-ce-gmp的浓度为0.1mg/ml时，最多能催化0.6mm的tmb；由图3b可知，当ache的酶活性浓度为2.0u/ml时使1mm的atch生成足够多的tch抑制dpa-ce-gmp催化活性，致使tmb不被氧化；由图3c可知，dpa-ce-gmp在ph为6.5的tris-hcl缓冲液显现出对tmb最好的催化性能。
64.有机磷农药的可视化快速检测体系：
65.(1)将13.2μl有机磷农药与13.2μl乙酰胆碱酯酶混匀孵育得第一混合液，随后向第一混合液中加入10μlatch，混匀孵育得第二混合液；
66.(2)将纳米材料dpa-ce-gmp复溶于tris-hcl缓冲液(ph6.5)中形成第三混合液，将第二混合液加入第三混合液中，其中，第二混合液和第三混合液体积比为1:10，再加入tmb溶液于第三混合液中，混合均匀得检测体系,其中，atch的终浓度为1mm；ache酶活终浓度为2u/ml，tmb的终浓度为0.6mm，dpa-ce-gmp的终浓度为0.1mg/ml；
67.(3)采用紫外-可见光光谱仪对检测体系进行分析，收集tmb的吸收峰光谱图，根据
tmb的蓝色由浅到深的变化和吸收光谱峰强，实现有机磷农药的定性与定量检测。
68.实施例4：可视化比色传感方法对不同浓度有机磷农药的检测能力探究
69.有机磷农药的可视化快速检测体系：将不同浓度的敌敌畏加入到ache溶液中，混合均匀后，再加入到atch溶液中，混合均匀并孵育一段时间，将该混合溶液加入到含有dpa-ce-gmp/tmb的tris-hcl缓冲液(ph＝6.5)中，混合均匀后，测定tmb的吸光度值。
70.其中敌敌畏浓度范围为0-100μg/l，具体的为：0，0.01,0.03,0.1,0.5,1,3,5,10,15,20,30,40,50,80,100μg/l，ache酶活性浓度为2.0u/ml，atch浓度为1mm，dpa-ce-gmp浓度为0.1mg/ml，tmb浓度为0.6mm。
71.结果分析：从图4a中可得，随着敌敌畏浓度的增加，tmb的吸收光谱峰强逐渐增大，这表明tmb吸收峰强度值与敌敌畏的浓度成正相关。从图4b中可得，该传感器对敌敌畏检测在0.03-80μg/l有良好的线性关系。图4c中，随着敌敌畏浓度的增加，该传感器的颜色逐渐加深。获得的线性方程为：
72.y＝0.327x+0.514
ꢀꢀꢀꢀ
式(1)
73.实施例5：可视化比色传感方法抗干扰研究
74.将敌敌畏、不同离子和小分子加入到ache溶液中，混合均匀后，再分别加入到atch溶液中，混合均匀并孵育一段时间，将混合溶液加入到含有dpa-ce-gmp/tmb的tris-hcl缓冲液(ph＝6.5)中，混合均匀后，分别测定各个传感器中tmb的吸光度值。
75.结果分析：由图5可以看出，金属离子k
+
，ca
2+
，na
+
，mg
2+
，fe
3+
，al
3+
，cu
2+
，hg
2+
，pb
2+
，以及常规小分子干扰物葡萄糖(glucose)、乳糖(lactose)、蔗糖(sucrose)、柠檬酸(citric acid)、酒石酸(tartaric acid)均不能使传感器中tmb的吸光度值发生变化，说明该可视化传感器对有机磷农药有良好的选择性。
76.实施例6：可视化比色传感方法对有机磷农药的普适性研究
77.将敌敌畏、甲基对硫磷(parathion-methyl)、氧化乐果(omethoate)、亚胺硫磷(phosmet)、毒死蜱(dursban)、甲拌磷(phorate)、敌百虫(trichlorfon)和磷酸三丁酯(tributyl-phosphate)加入到ache溶液中，混合均匀后，再分别加入到atch溶液中，混合均匀并孵育一段时间，将混合溶液加入到含有dpa-ce-gmp/tmb的tris-hcl缓冲液(ph＝6.5)中，混合均匀后，分别测定各个传感器中tmb的吸光度值。
78.结果分析：由图6可以看出，基于有机磷农药抑制ache的特性，该可视化比色传感器对常规有机磷农药有普适性。
79.实施例7：可视化比色传感方法用于蔬菜中有机磷农药的检测
80.先把西红柿和黄瓜榨汁离心后取上清液并稀释，将不同浓度的有机磷农药加入稀释后的蔬菜汁中。按照实施例3所涉及步骤建立的有机磷农药的可视化快速检测体系，检测tmb的吸光度值，根据检测结果利用所得线性方程式(1)计算得出实际检出浓度，据此计算加标回收率。
81.结果分析：从表1的回收率结果可以得出，针对西红柿和黄瓜有机磷农药检测的回收率分布在94.8-106％之间，并且具有较小的偏差，说明该可视化比色传感方法可用于蔬菜中有机磷农药的快速检测分析。
82.表1可视化比色传感器用于蔬菜中有机磷农药的检测
[0083][0084]
以上所述仅为本技术的优选实施例而已，并不用于限制本技术，对于本领域的技术人员来说，本技术可以有各种更改和变化。凡在本技术的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本技术的保护范围之内。