苏丹红在植物腺毛特异性染色中的应用

1.本发明涉及植物组织观察技术领域，具体涉及苏丹红在植物腺毛特异性染色中的应用。


背景技术：

2.几乎所有的植物表面都覆有毛发状的结构，地上部分被称为表皮毛，地下部分称为根毛。表皮毛由植物表皮细胞发育而来，广泛分布于陆生植物，是生长在植物表皮组织的一种特化结构。根据不同的特征和功能，表皮毛可分为分枝或非分枝、单细胞或多细胞，以及腺毛或非腺毛。非腺毛是植物抵御动物取食、紫外线(uv)辐射等自然危害的第一道保护屏障，而腺毛则是合成、贮存和分泌天然产物的重要场所。药用植物的活性可归因于其合成的天然产物，表皮毛是植物天然产物合成和存储的重要场所之一，因此表皮毛种类和数量是影响药材品质的重要因素。
3.为了提高药材品质，研究者们对于植物的表皮毛进行了深入研究，并借助一系列电子设备来观察植物叶片表皮毛的形态和类型，通常采用的是光学显微镜、荧光显微镜、扫描电子显微镜等来完成，其辨别效果依次提升且仪器价格也随之增加。广藿香、薄荷等植物叶片上附有浓密的不同类型的表皮毛，大量的非腺毛对于观察腺毛的形态、类型和分布等产生了严重的干扰；另外，表皮毛透明且具有一定的高度，难以聚焦同一水平面分辨表皮毛结构及类型。通常，实验室采用撕取表皮法、解离表皮法、透明制片法、组织切片等制片手段，但上述手段操作难度较高，过程复杂，且易造成植物组织的破坏，从而影响植物腺毛的形态和分布状态。因此，亟需提供一种植物腺毛特异性染色的技术，用于有效分辨植物表皮毛的类型及其分布。


技术实现要素：

4.本发明提供了苏丹红在植物腺毛特异性染色中的应用，有效解决了现有的制片过程复杂且易破坏植物腺毛形态和分布状态的技术问题，同时克服了现有观察手段高度依赖昂贵仪器的技术缺陷。
5.本发明提供了苏丹红在植物腺毛特异性染色中的应用，其特征在于，包括以下步骤：
6.s1，植物组织采集：选取植株生长状态良好的叶片，取部分叶片备用；
7.s2，固定：将s1所述的部分叶片置于faa固定液中，抽真空，待叶片沉入固定液底部后，冷藏固定，漂洗后得固定叶片；
8.s3，染色：将s2所述的固定叶片置于苏丹红染料中，抽真空，待叶片沉入所述苏丹红染料底部后，恒温染色，漂洗后得染色叶片；
9.s4，制片观察：对s3所述的染色叶片制片后于光学纤维下观察并拍照。
10.优选的，s3中，所述苏丹红染料是苏丹红7b染色液、苏丹红ⅰ染色液、苏丹红ⅲ染色液或苏丹红ⅳ染色液。
11.优选的，所述苏丹红染料的制备方法是将10～50mg的苏丹红粉末溶解于聚乙二醇中，粉末完全溶解后加入体积百分比为70％～100％甘油制成。
12.优选的，所述苏丹红粉末与聚乙二醇的料液比为10mg：2～10ml。
13.优选的，所述苏丹红粉末与甘油的料液比为10mg：5～10ml。
14.优选的，s3中，所述抽真空时间为3～15min，真空压为10～20hpa。
15.优选的，s3中，所述恒温染色温度为28～37℃，时间为16～48h。
16.优选的，s1中，所述部分叶片是避开主叶脉在其两侧取直径0.2～1cm的圆叶片。
17.优选的，s2中，所述抽真空时间为2～10min，真空压为10～20hpa。
18.优选的，s2中，所述冷藏固定温度为4℃，时间为24～72h。
19.与现有技术相比，本发明的有益效果在于：
20.(1)本发明将生长良好的植物叶片置于固定液中，一方面保持了植物表皮毛的形态特征，另一方面去除了叶片中的叶绿素，消除了叶绿素自发荧光对于观察植物表皮特征的影响，采用苏丹红染料可特异性指示油脂类物质，将脂类染成橘色至深红色，对于合成和存储精油的腺毛进行特异性染色，从而有效区分腺毛和非腺毛，并对腺毛和非腺毛的数量和分布进行统计。
21.(2)本发明提供的苏丹红在植物腺毛特异性染色中的应用，其操作方法简单，实用性强、成本低、昂贵设备依赖性低、工作量小、成功率高，可有效解决植物叶片多种表皮毛类型区分不清的问题。
附图说明
22.图1为实施例1广藿香叶片表皮毛光学显微镜图；
→
代表盾状腺毛，√代表头状腺毛；
23.图2为实施例1在高倍显微镜下广藿香叶片表皮毛图；图a是盾状腺毛，图b是头状腺毛，图c是非腺毛；
24.图3是对比例1广藿香叶片的光学显微镜图；
25.图4是对比例2广藿香叶片的光学显微镜图。
具体实施方式
26.为了使本领域技术人员更好地理解本发明的技术方案能予以实施，下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，但所举实施例不作为对本发明的限定。下述试验方法和检测方法，如没有特殊说明，均为常规方法；所述试剂和原料，如没有特殊说明，均为市售。
27.本发明以广藿香为原材料进行染色实验。
28.所述faa固定液采用3.7ml的甲醛，5ml的冰醋酸，60ml的无水乙醇，5ml的甘油和去离子水，定容至100ml制成。
29.所述聚乙二醇采用聚乙二醇200、聚乙二醇300、聚乙二醇400或聚乙二醇600。
30.所述制片步骤为：将染色叶片转移至载玻片上，用20％～50％的甘油固定所述染色叶片。
31.实施例1
32.苏丹红在植物腺毛特异性染色中的应用，其特征在于，包括以下步骤：
33.s1，植物组织采集：选取广藿香生长状态良好的叶片，避开主叶脉在其两侧采用打孔器取直径为0.2cm的圆叶片备用；
34.s2，固定：将s1所述的圆叶片置于faa固定液中，并于10hpa的真空压下抽真空2min，待叶片沉入固定液底部后，于4℃冷藏固定24h，漂洗后得固定叶片；
35.s3，染色：将s2所述的固定叶片置于苏丹红7b染色液中，并于10hpa的真空压下抽真空3min，待叶片沉入所述苏丹红染料底部后，于28℃恒温染色16h，漂洗后得染色叶片；
36.所述苏丹红7b染色液的制备方法是将10mg苏丹红7b粉末溶解于5ml聚乙二醇300中，粉末完全溶解后加入2ml体积百分比为70％的甘油制成。
37.s4，制片观察：对s3所述的染色叶片转移至载玻片上，用20％的甘油固定所述染色叶片制片后于光学纤维下观察并拍照。
38.实施例2
39.苏丹红在植物腺毛特异性染色中的应用，其特征在于，包括以下步骤：
40.s1，植物组织采集：选取广藿香生长状态良好的叶片，避开主叶脉在其两侧采用打孔器取直径为1cm的圆叶片备用；
41.s2，固定：将s1所述的圆叶片置于固定液中，并于20hpa的真空压下抽真空10min，待叶片沉入固定液底部后，于4℃冷藏固定72h，漂洗后得固定叶片；
42.s3，染色：将s2所述的固定叶片置于苏丹红ⅰ染色液中，并于20hpa的真空压下抽真空15min，待叶片沉入所述苏丹红染料底部后，于37℃恒温染色48h，漂洗后得染色叶片；
43.所述苏丹红ⅰ染色液的制备方法是将50mg苏丹红ⅰ粉末溶解于10ml聚乙二醇200中，粉末完全溶解后加入10ml体积百分比为100％的甘油制成。
44.s4，制片观察：对s3所述的染色叶片转移至载玻片上，用50％的甘油固定所述染色叶片制片后于光学纤维下观察并拍照。
45.实施例3
46.苏丹红在植物腺毛特异性染色中的应用，其特征在于，包括以下步骤：
47.s1，植物组织采集：选取广藿香生长状态良好的叶片，避开主叶脉在其两侧采用打孔器取直径为0.6cm的圆叶片备用；
48.s2，固定：将s1所述的圆叶片置于固定液中，并于15hpa的真空压下抽真空6min，待叶片沉入固定液底部后，于4℃冷藏固定48h，漂洗后得固定叶片；
49.s3，染色：将s2所述的固定叶片置于苏丹红ⅲ染色液中，并于15hpa的真空压下抽真空9min，待叶片沉入所述苏丹红染料底部后，于32℃恒温染色32h，漂洗后得染色叶片；
50.所述苏丹红ⅲ染色液的制备方法是将30mg苏丹红ⅲ粉末溶解于8ml聚乙二醇400中，粉末完全溶解后加入6ml体积百分比为85％的甘油制成。
51.s4，制片观察：对s3所述的染色叶片转移至载玻片上，用35％的甘油固定所述染色叶片制片后于光学纤维下观察并拍照。
52.实施例4
53.苏丹红在植物腺毛特异性染色中的应用，其特征在于，包括以下步骤：
54.s1，植物组织采集：选取广藿香生长状态良好的叶片，避开主叶脉在其两侧采用打孔器取直径为0.4cm的圆叶片备用；
55.s2，固定：将s1所述的圆叶片置于固定液中，并于12hpa的真空压下抽真空4min，待
叶片沉入固定液底部后，于4℃冷藏固定36h，漂洗后得固定叶片；
56.s3，染色：将s2所述的固定叶片置于苏丹红ⅳ染色液中，并于12hpa的真空压下抽真空6min，待叶片沉入所述苏丹红染料底部后，于30℃恒温染色24h，漂洗后得染色叶片；
57.所述苏丹红ⅳ染色液的制备方法是将20mg苏丹红ⅳ粉末溶解于6ml聚乙二醇600中，粉末完全溶解后加入4ml体积百分比为78％的甘油制成。
58.s4，制片观察：对s3所述的染色叶片转移至载玻片上，用28％的甘油固定所述染色叶片制片后于光学纤维下观察并拍照。
59.实施例5
60.苏丹红在植物腺毛特异性染色中的应用，其特征在于，包括以下步骤：
61.s1，植物组织采集：选取广藿香生长状态良好的叶片，避开主叶脉在其两侧采用打孔器取直径为0.8cm的圆叶片备用；
62.s2，固定：将s1所述的圆叶片置于固定液中，并于18hpa的真空压下抽真空8min，待叶片沉入固定液底部后，于4℃冷藏固定60h，漂洗后得固定叶片；
63.s3，染色：将s2所述的固定叶片置于苏丹红7b染色液中，并于18hpa的真空压下抽真空12min，待叶片沉入所述苏丹红染料底部后，于35℃恒温染色40h，漂洗后得染色叶片；
64.所述苏丹红7b染色液的制备方法是将40mg苏丹红7b粉末溶解于9ml聚乙二醇300中，粉末完全溶解后加入8ml体积百分比为93％的甘油制成。
65.s4，制片观察：对s3所述的染色叶片转移至载玻片上，用42％的甘油固定所述染色叶片制片后于光学纤维下观察并拍照。
66.为了进一步说明本发明的效果，本发明还设置了对比例，如下：
67.对比例1
68.苏丹红在植物腺毛特异性染色中的应用，其特征在于，包括以下步骤：
69.s1，植物组织采集：选取广藿香生长状态良好的叶片，避开主叶脉在其两侧采用打孔器取直径为0.6cm的圆叶片备用；
70.s2，不用固定液固定；
71.s3，染色：将s1所述的圆叶片置于苏丹红7b染色液中，并于15hpa的真空压下抽真空9min，待叶片沉入所述苏丹红染料底部后，于32℃恒温染色32h，漂洗后得染色叶片，并对染色叶片采用酒精进行脱色处理，得到脱色叶片
72.所述苏丹红7b染色液的制备方法是将30mg苏丹红7b粉末溶解于8ml聚乙二醇300中，粉末完全溶解后加入6ml体积百分比为85％的甘油制成。
73.s4，制片观察：对s3所述的脱色叶片转移至载玻片上，用35％的甘油固定所述染色叶片制片后于光学纤维下观察并拍照。
74.对比例2
75.苏丹红在植物腺毛特异性染色中的应用，其特征在于，包括以下步骤：
76.s1，植物组织采集：选取广藿香生长状态良好的叶片，避开主叶脉在其两侧采用打孔器取直径为0.6cm的圆叶片备用；
77.s2，不用固定液固定；
78.s3，染色：将s2所述的固定叶片置于苏丹红7b染色液中，并于15hpa的真空压下抽真空9min，待叶片沉入所述苏丹红染料底部后，于32℃恒温染色32h，漂洗后得染色叶片；
79.所述苏丹红7b染色液的制备方法是将30mg苏丹红7b粉末溶解于8ml聚乙二醇300中，粉末完全溶解后加入6ml体积百分比为85％的甘油制成。
80.s4，制片观察：对s3所述的染色叶片转移至载玻片上，用35％的甘油固定所述染色叶片制片后于光学纤维下观察并拍照。
81.由图1和图2可以看出，本发明苏丹红染料可对植物腺毛进行特异性染色，并能对植物叶片的盾状腺毛、头状腺毛和非腺毛进行较好的区分，有效解决植物叶片多种表皮毛类型区分不清的问题。而对比例1未对广藿香叶片采用固定液进行固定，直接采用苏丹红染色液进行染色，并采用酒精进行脱色处理；对比例2未对广藿香叶片采用固定液进行固定，直接采用苏丹红染色液进行染色且未采用酒精进行脱色处理，由图3和图4可看出，两者在光学显微镜下根本无法对植物腺毛的种类进行区分。
82.显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。