基于固态自旋传感器的生化反应温度测量装置及方法

1.本发明涉及纳米量热领域，更具体地，涉及一种基于固态自旋传感器的生化反应温度测量装置及方法。


背景技术：

2.热量的产生和吸收是生物化学活动中普遍存在的现象。温度监测可以为生物分子相互作用、构象变化和酶动力学等过程提供重要信息。
3.等温滴定量热法(itc，isothermal titration calorimetry)和差示扫描量热法(dsc，differential scanning calorimetry)等温度测量方法，凭借其无标记和分析物无需固定的优势，被广泛应用于许多科学发现中。然而，该些测量通常需要大的样本量，通常数百微升，阻碍了温度测量方法在高通量检测和样品消耗极低的情况下的应用，如药物筛选和催化反应优化。
4.随着微流控技术在微米和纳米液滴操作方面的最新进展，对相应小体积的无标签温度测量的需求日益增长，开发具有高温灵敏度和长期化学稳定性的纳米级温度计成为挑战。如热敏电阻、热电堆等电温度计，尺寸通常在数十μm至数百μm，在温度计和反应液体之间通常需要一个2-5μm厚的保护层。此外，基于荧光的热响应分子，虽然能实现纳米尺度的应用，但由于局域ph值、离子浓度和折射率等影响，大多数测量方法都存在信号不稳定的缺陷。对于分辨率优于100mk的亚微米级生化反应的观测，也较为缺乏。


技术实现要素：

5.有鉴于此，本发明提供了一种基于固态自旋传感器的生化反应温度测量装置及方法。
6.本发明的一个方面提供了一种基于固态自旋传感器的生化反应温度测量装置，包括：样品模块，预置有待测样品和作为温度探针的固态自旋纳米颗粒，上述样品模块用于完成上述待测样品的生化反应，上述固态自旋纳米颗粒用于测量上述生化反应过程中的温度变化；温度控制模块，用于控制上述样品模块所占据区域的环境温湿度保持稳定；泵浦光模块，用于生成激发光束，以及将上述激发光束聚焦至上述固态自旋纳米颗粒处，以使得处于上述激发光束的光束范围内的目标固态自旋纳米颗粒发射荧光；微波模块，用于生成微波场，以及将上述微波场辐射至上述固态自旋纳米颗粒处；收集模块，用于收集与上述荧光相对应的荧光光束，以及对上述荧光光束进行处理，得到荧光信号；处理模块，用于接收上述荧光信号，将上述荧光信号转换为特征信号，并根据上述特征信号，确定上述生化反应过程的温度变化测量结果。
7.可选地，固态自旋纳米颗粒包括如下中的至少之一：内含温度变化敏感的自旋传感器的纳米颗粒，以及结合温度响应型材料和上述自旋传感器确定的复合探针。
8.可选地，上述待测样品包括第一样品和第二样品，上述样品模块包括：微液滴控制器，用于生成预定体积的上述第一样品；反应腔室，用于装载上述第二样品和上述固态自旋
纳米颗粒，以及为上述第一样品和上述第二样品的生化反应过程提供反应空间；微流管，用于将上述微液滴控制器生成的第一样品导入上述反应腔室；位移模块，用于承载上述反应腔室，以及控制上述反应腔室内装载的固态自旋纳米颗粒锁定在显微物镜光斑聚焦处。
9.可选地，微波模块包括：微波波源，用于生成调制自旋态的微波场；微波功率放大器，用于增强上述微波场的功率；辐射组件，用于将上述微波场辐射至上述固态自旋纳米颗粒处。
10.可选地，收集模块包括：滤光片，用于对上述荧光光束进行滤波处理；消色差透镜，用于将上述荧光光束会聚至针孔上；上述针孔，用于对上述荧光光束进行空间滤波；分束镜，用于将经滤波处理、空间滤波后的荧光分束，发送至光谱仪和雪崩二极管；上述雪崩二极管，用于将上述荧光光束转换为用于记录荧光光子数的荧光计数；上述光谱仪，用于将上述荧光光束转换为光谱信号。
11.可选地，泵浦光模块包括：光源，用于生成与上述自旋传感器相对应波长的激发光束；调制器，用于对上述激发光束的强度进行调制；光纤准直器，用于将经过调制的激发光束投射至二向色镜；上述二向色镜，用于将上述激发光束发送至显微物镜，以及将上述荧光光束发送至上述收集模块；上述显微物镜，用于将上述激发光束聚焦至上述固态自旋纳米颗粒处，以及收集上述荧光光束。
12.可选地，温度控制模块包括：外层控温子模块，设置为包围显微物镜和上述样品模块，用于为上述显微物镜和上述样品模块提供稳定的环境温度；内层控温子模块，设置为包围上述样品模块，用于为上述固态自旋纳米颗粒提供稳定的环境温度和环境湿度。
13.可选地，内层控温子模块包括：环绕加热板，设置为结合上述位移模块包围上述反应腔室，用于为上述固态自旋纳米颗粒提供稳定的环境温度；水槽，设置于上述环绕加热板的外围，用于为上述固态自旋纳米颗粒提供稳定的环境湿度；参考温度计，设置为与上述反应腔室相连，用于测量上述反应腔室的环境温度；温度控制器，设置为与上述参考温度计相连，用于根据上述参考温度计测量的环境温度控制上述环绕加热板的功率。
14.本发明的另一个方面提供了一种基于固态自旋传感器的生化反应温度测量方法，基于本发明上述的基于固态自旋传感器的生化反应温度测量装置实现，该方法包括：利用温度控制模块控制样品模块所占据的环境温湿度保持稳定，上述样品模块中包括作为温度探针的固态自旋纳米颗粒和用于进行生化反应的待测样品；利用泵浦光模块，对放置于上述样品模块内的固态自旋纳米颗粒施加激发光束；利用微波模块，对放置于上述样品模块内的固态自旋纳米颗粒施加微波场；利用雪崩二极管，获取上述固态自旋纳米颗粒发射的荧光光子的荧光计数；利用微波波源，获取上述微波场的微波频率；利用处理模块，控制同时施加上述激发光束和上述微波场，并记录上述荧光计数，在检测到上述荧光计数发生改变的情况下，获取与上述固态自旋纳米颗粒的自旋能级相匹配的目标微波频率；根据上述目标微波频率，确定上述生化反应的过程的温度变化测量结果。
15.本发明的又一个方面提供了一种基于固态自旋传感器的生化反应温度测量方法，基于本发明上述的基于固态自旋传感器的生化反应温度测量装置实现，该方法包括：利用温度控制模块控制样品模块所占据的环境温湿度保持稳定，上述样品模块中包括作为温度探针的固态自旋纳米颗粒和用于进行生化反应的待测样品；利用泵浦光模块，对放置于上述样品模块内的固态自旋纳米颗粒施加激发光束；利用光谱仪，获取上述固态自旋纳米颗
粒发射的荧光的光谱信息；利用处理模块，根据上述光谱信息，确定上述生化反应的过程的温度变化测量结果。
16.根据本发明的实施例，通过采用了在样品模块中预置待测样品和作为温度探针的固态自旋纳米颗粒，完成待测样品的生化反应，结合温度控制模块、泵浦光模块、微波模块的处理，根据收集到的特征信号得到生化反应过程的温度变化测量结果的技术手段，由于采用的固态自旋纳米颗粒，对生化环境有较高的稳定性，适用于各种复杂生化反应过程的测量。利用纳米尺度颗粒作为探针，空间分辨率在亚微米尺度，结合待测样品，可以将测量体积降低到飞升量级。同时固态自旋纳米颗粒具有很高的温度灵敏度，使得温度测量装置具有高化学稳定性、温度灵敏度和低样品消耗量的优点。
附图说明
17.为了更清楚的说明本发明实施例或现有技术的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单的介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
18.图1示意性示出了根据本发明实施例的基于固态自旋传感器的生化反应温度测量装置的结构图；
19.图2示意性示出了根据本发明实施例的在非等温量热模式下样品模块的示意图；
20.图3示意性示出了根据本发明实施例的在等温量热模式下样品模块的示意图；
21.图4示意性示出了根据本发明实施例的内层控温子模块的示意图；
22.图5示意性示出了根据本发明实施例的基于固态自旋传感器的生化反应温度测量装置的光路图；
23.图6示意性示出了根据本发明实施例的采用odmr方法实现的基于固态自旋传感器的生化反应温度测量方法的流程图；
24.图7a示意性示出了根据本发明实施例的单个荧光计数的计数原理图；
25.图7b示意性示出了根据本发明实施例的根据微波频率和荧光计数确定共振频率的示意图；
26.图7c示意性示出了根据本发明实施例的根据共振频率确定温度变化的示意图；
27.图8示意性示出了根据本发明实施例的采用all-optical方法实现的基于固态自旋传感器的生化反应温度测量方法的流程图；
28.图9示意性示出了根据本发明实施例的采用all-optical方法测温的原理图；
29.图10示意性示出了根据本发明实施例的光谱方法测温响应系数的示例图；
30.图11a示意性示出了根据本发明实施例的采用all-optical方法检测酸碱中和反应过程的温度变化的示意图；
31.图11b示意性示出了根据本发明实施例的采用all-optical方法检测酸碱中和反应的稳定性的检测结果；以及
32.图12示意性示出了根据本发明实施例的采用all-optical方法检测atp酶促水解过程的温度变化的示意图。
具体实施方式
33.以下，将参照附图来描述本发明的实施例。但是应该理解，这些描述只是示例性的，而并非要限制本发明的范围。在下面的详细描述中，为便于解释，阐述了许多具体的细节以提供对本发明实施例的全面理解。然而，明显地，一个或多个实施例在没有这些具体细节的情况下也可以被实施。此外，在以下说明中，省略了对公知结构和技术的描述，以避免不必要地混淆本发明的概念。
34.在此使用的术语仅仅是为了描述具体实施例，而并非意在限制本发明。在此使用的术语“包括”、“包含”等表明了所述特征、步骤、操作和/或部件的存在，但是并不排除存在或添加一个或多个其他特征、步骤、操作或部件。
35.在此使用的所有术语(包括技术和科学术语)具有本领域技术人员通常所理解的含义，除非另外定义。应注意，这里使用的术语应解释为具有与本说明书的上下文相一致的含义，而不应以理想化或过于刻板的方式来解释。
36.在使用类似于“a、b和c等中至少一个”这样的表述的情况下，一般来说应该按照本领域技术人员通常理解该表述的含义来予以解释(例如，“具有a、b和c中至少一个的系统”应包括但不限于单独具有a、单独具有b、单独具有c、具有a和b、具有a和c、具有b和c、和/或具有a、b、c的系统等)。在使用类似于“a、b或c等中至少一个”这样的表述的情况下，一般来说应该按照本领域技术人员通常理解该表述的含义来予以解释(例如，“具有a、b或c中至少一个的系统”应包括但不限于单独具有a、单独具有b、单独具有c、具有a和b、具有a和c、具有b和c、和/或具有a、b、c的系统等)。
37.本发明一实施例提供了一种基于固态自旋传感器的生化反应温度测量装置。
38.图1示意性示出了根据本发明实施例的基于固态自旋传感器的生化反应温度测量装置的结构图。
39.如图1所示，基于固态自旋传感器的生化反应温度测量装置可以包括泵浦光模块1、样品模块2、温度控制模块3、微波模块4、收集模块5和处理模块6。
40.泵浦光模块1，用于生成激发光束10，以及将激发光束10聚焦至预置于样品模块2中的固态自旋纳米颗粒处，以使得处于激发光束10的光束范围内的目标固态自旋纳米颗粒发射荧光20。
41.样品模块2，预置有待测样品和作为温度探针的固态自旋纳米颗粒，样品模块2可以用于完成待测样品的生化反应，固态自旋纳米颗粒可用于测量生化反应过程中的温度变化。
42.温度控制模块3，用于控制样品模块2所占据区域的环境温湿度保持稳定。
43.微波模块4，用于生成微波场40，以及将微波场40辐射至固态自旋纳米颗粒处。微波场可用于调制固态自旋纳米颗粒的自旋状态。
44.收集模块5，用于收集与荧光20相对应的荧光光束荧光，以及对荧光光束进行处理，得到荧光信号50。
45.处理模块6，用于接收荧光信号50，将荧光信号50转换为特征信号，并根据特征信号，确定生化反应过程的温度变化测量结果。
46.根据本发明的实施例，特征信号可以包括微波频率信号。采用光探测磁共振(odmr)测温方法时，处理模块6可以控制泵浦光模块1和微波模块4同时工作，将激发光束和
微波场同时施加到样品模块2中的固态自旋纳米颗粒处。在该种情况下，可以将当微波模块4生成的微波场40与固态自旋纳米颗粒中自旋传感器的自旋能级相匹配时的目标微波频率30作为处理模块6处理的特征信号。
47.根据本发明另一实施例，特征信号还可以包括光谱信号。采用全光学(all-optical)测温方法时，装置中可以不包括微波模块4。在该种情况下，可以通过收集模块5收集与荧光信号相对应的光谱信号，并将光谱信号作为处理模块6处理的特征信号。
48.根据本发明的实施例，在确定特征信号之后，可以根据特征信号，对固态自旋纳米颗粒周围的温度变化进行测量，据此可以得到生化反应过程中的温度变化测量结果。
49.根据本发明的实施例，待测样品可以包括各类能够进行生化反应的反应液或反应样品。在需要利用固态自旋纳米颗粒测量生化反应过程中的温度变化的情况下，可以使待测样品浸没固态自旋纳米颗粒。
50.以下结合具体实施例，并结合附图，对图1所示的基于固态自旋传感器的生化反应温度测量装置进一步详细说明。
51.根据本发明的实施例，固态自旋纳米颗粒包括如下中的至少之一：内含温度变化敏感的自旋传感器的纳米颗粒，以及结合温度响应型材料和该自旋传感器确定的复合探针。
52.根据本发明的实施例，固态自旋纳米颗粒可以内含自旋传感器。例如，固态自旋纳米颗粒可以选择nv(nitrogen-vacancy)色心、siv色心、gev色心等自旋传感器。以nv色心为代表的自旋传感器是一种新兴的量子热探针，在纳米尺度可以具有很高的灵敏度，且具有极高的化学稳定性和导热性，能够与反应溶液直接接触，可以适应各种复杂的化学环境，有利于实现对各类生化反应的温度变化的探测。
53.根据本发明的实施例，纳米颗粒也可以结合其他温度响应型材料做成复合探针。温度响应型材料例如可以包括铜镍材料等，且可不限于此。
54.根据本发明的实施例，固态自旋纳米颗粒的尺寸和注入浓度可以根据需求选择。例如，固态自旋纳米颗粒的尺寸可以选则100nm，注入浓度可以选择3.5ppm。
55.根据本发明的实施例，泵浦光模块可以包括：光源，用于生成与自旋传感器相对应波长的激发光束。显微物镜，用于将激发光束聚焦至固态自旋纳米颗粒处，以及收集固态自旋纳米颗粒发射的荧光光束。
56.根据本发明的实施例，光源可以包括激光光源，也可以包括其他光源。激光光源可以包括半导体激光器，也可包括其他类型的激光器。根据激光光源准直性高、亮度高、单色性好等优势，光源可选择激光光源，以达到较好的效果。光源的出光波长可以根据与固态自旋纳米颗粒相对应的激发波长确定。例如，对应于nv色心这一自旋传感器，可以选择532nm波长或593nm波长。
57.根据本发明的实施例，泵浦光模块还可以包括如下中的至少之一：光纤耦合器，用于将光源发射的激发光束耦合入光纤。调制器，用于对激发光束的强度进行调制。光纤准直器，用于将经过调制的激发光束投射至二向色镜。二向色镜，用于将激发光束发送至显微物镜，以及将固态自旋纳米颗粒发射的荧光光束发送至收集模块。
58.根据本发明的实施例，调制器可采用声光调制器、光纤耦合声光调制器等其中任一。在调制器采用光纤耦合声光调制器的情况下，光纤耦合器可通过光纤与光纤耦合声光
调制器相连接，光纤准直器可通过光纤与光纤耦合声光调制器相连接。调制器可以接收处理模块的ttl信号，ttl信号可由处理模块的pci(peripheral component interconnect，个人计算机接口)板卡产生，并可通过程序进行控制。
59.根据本发明的实施例，待测样品可以包括第一样品和第二样品。样品模块可以包括：微液滴控制器，用于生成预定体积的第一样品。反应腔室，用于装载第二样品和固态自旋纳米颗粒，以及为第一样品和第二样品的生化反应过程提供反应空间。微流管，用于将微液滴控制器生成的第一样品导入反应腔室。位移模块，用于承载反应腔室，以及控制反应腔室内装载的固态自旋纳米颗粒锁定在显微物镜光斑聚焦处。
60.根据本发明的实施例，微液滴控制器可以控制生成的反应液的体积，例如，可以生成微液滴形式的第一样品，体积可控制在1μl等。第一样品可以通过微流管导入反应腔室内，与装载于反应腔室内的第二样品进行生化反应。装载于反应腔室内的第二样品可以浸没固态自旋纳米颗粒，固态自旋纳米颗粒可以实时检测反应腔室内从未开始生化反应到生化反应结束的温度变化。
61.根据本发明的实施例，反应腔室可以由pmma(polymethyl methacrylate，有机玻璃)环和隔热层构成，用于形成一个隔热的微液滴反应腔室。隔热层可以由具有一定间隙的双层玻璃构成。可根据需要选择空气隔热层或真空隔热层与环境隔热。固态自旋纳米颗粒可以固定在隔热层上方的玻璃基底上。需要说明的是，也可以采用其他微纳结构设计反应腔室。
62.根据本发明的实施例，位移模块可以包括精度较低的粗调三维位移台和精度较高的扫描三维位移台，可用于实现大范围移动和精准定位。通过将反应腔室装载在位移模块上，通过调节位移装置，可以实现将固定于反应腔室隔热层上的固态自旋纳米颗粒锁定至显微物镜光斑聚焦处。
63.图2示意性示出了根据本发明实施例的非等温量热模式下的样品模块的示意图。
64.如图2所示，26为隔热层，用于减小反应腔室内的散热。24为pmma环，隔热层26和pmma环24结合可以构成反应腔室25，22为培养皿，可用于为反应腔室25构建一个较小的外部空间。反应腔室25可以为执行生化反应的第一样品和第二样品提供混合、发生反应的区域。27为固态自旋纳米颗粒，可以固定在隔热层26上方的玻璃基底上，即可以固定于反应腔室25底部。23为微流管，28为微液滴控制器，两者结合例如可以将预定体积的第一样品滴入反应腔室25内，与反应腔室25内预装载的浸没固态自旋纳米颗粒27的第二样品进行生化反应。在进行生化反应的过程中，可以在保持样品模块温度稳定的条件下，固态自旋纳米颗粒27可以检测相关生化反应过程的温度变化情况。
65.根据本发明实施例，在保持内层环境温度稳定的条件下，也可以用等温量热的模式直接测量生化反应的热量变化。即通过吸热材料，吸收生化反应释放的热量，使得反应腔内的热平衡温度始终保持与环境温度等温。
66.图3示意性示出了根据本发明实施例的等温量热模式下的样品模块的示意图。
67.如图3所示，以放热的生化反应为例，291为光致制冷材料，可以放置于反应腔室25内，作为等温量热模式下设置的吸热材料。光致制冷材料291可以根据反应腔室25中生化反应的放热情况，调节致冷光292的功率进行相应的吸热操作，以使反应腔室25的热平衡温度与环境温度一致，即反应腔室内温度变化为零。此处固态自旋纳米颗粒27用于监测反应腔
内的温度变化，反馈给致冷光292的控制器，便于调节其功率，以达到实现反应腔室25的热平衡温度与环境温度一致的目标。实验过程中记录致冷光292的功率变化，结合对光致制冷材料291吸热功率的校准，可以确定反应腔室25内发生的生化反应的反应放热量，得到相关生化反应的温度变化测量结果。放置于反应腔室内的光致制冷材料291和固态自旋纳米颗粒27可以以具有良好的热接触的方式相互隔离放置。
68.根据本发明的实施例，温度控制模块可以包括外层控温子模块和内层控温子模块。外层控温子模块可以设置为包围显微物镜和样品模块，可用于为显微物镜和样品模块提供稳定的环境温度。内层控温子模块可以设置为包围样品模块，也可以设置为包围样品模块的反应腔室，可用于为固态自旋纳米颗粒提供稳定的环境温度和环境湿度。
69.根据本发明的实施例，内层控温子模块可以包括：环绕加热板，设置为结合位移模块包围反应腔室，用于为固态自旋纳米颗粒提供稳定的环境温度。水槽，设置于环绕加热板的外围，用于为固态自旋纳米颗粒提供稳定的环境湿度。参考温度计，设置为与反应腔室相连，用于测量反应腔室的环境温度。温度控制器，设置为与参考温度计相连，用于根据参考温度计测量的环境温度控制环绕加热板的功率。
70.图4示意性示出了根据本发明实施例的内层控温子模块的示意图。
71.如图4所示，324为环绕加热板，可以用于给反应腔室25及其内的待测样品、固态自旋纳米颗粒27提供稳定的局域温度。323为水槽，可以用于给反应腔室25及其内的待测样品、固态自旋纳米颗粒27提供稳定的局域湿度，减少反应液等待测样品的蒸发。322为参考温度计，可以实时检测反应腔室周边的环境温度。321为温度控制器，可以实时展示参考温度计322检测到的温度值信息，并可以根据该温度值信息调控环绕加热板324的加热功率，以保持反应腔室周边环境温度的稳定。结合参考温度计322和温度控制器321，可以为待测样品的生化反应过程提供稳定的环境温度。
72.根据本发明的实施例，微波模块4可以包括：微波波源，用于生成调制自旋态的微波场。微波功率放大器，用于增强微波场的功率。辐射组件，用于将微波场辐射至固态自旋纳米颗粒处。
73.根据本发明的实施例，微波场可以包括电磁波磁场。辐射组件可以安装在样品模块附近，可用于将微波波源产生的微波场辐射到固态自旋纳米颗粒处，对其进行自旋态调控。由此实现的微波模块可以向固态自旋纳米颗粒发射电磁波，电磁波可以调制固态自旋纳米颗粒中的自旋传感器以及复合探针中的自旋传感器的自旋状态。
74.根据本发明的实施例，收集模块可以包括：雪崩二极管，用于将固态纳米自旋颗粒发射的荧光光束转换为用于记录荧光光子数的荧光计数，以及将荧光计数输出到处理模块。光谱仪，用于将固态纳米自旋颗粒发射的荧光光束转换为光谱信号，以及将光谱信号输出到处理模块。
75.根据本发明的实施例，雪崩二极管可以在采用odmr方法测温的模式下工作。在该模式下，微波模块可以同时展开工作。光谱仪可以在采用all-optical方法测温的模式下工作。在该模式下，可以关闭微波模块的相关功能。
76.根据本发明的实施例，收集模块5还可以包括如下中的至少之一：滤光片，用于对荧光光束进行滤波处理，滤除干扰信号。消色差透镜，用于将荧光光束会聚至针孔上。针孔，用于对荧光光束进行空间滤波，针孔的大小可以根据需要的空间分辨率进行选择，例如可
以选50μm直径的针孔。分束镜，用于将经滤波处理、空间滤波后的荧光分束，发送至光谱仪和雪崩二极管。
77.根据本发明的实施例，处理模块可以包括计算机控制处理模块。计算机控制处理模块可以处理收集到的荧光信号，转化为如目标微波频率、光谱信号等特征信号，并可通过特征信号的变化得到相关生化反应过程的温度变化测量结果。
78.图5示意性示出了根据本发明实施例的基于固态自旋传感器的生化反应温度测量装置的光路图。
79.如图5所示，泵浦光模块1和收集模块5可以构成共聚焦显微装置。该显微装置可以包括光源11、光强衰减器18、第一反射镜19、光纤耦合器14、调制器15、光纤准直器16、二向色镜12、第二反射镜17、显微物镜13、滤光片55、第一消色差透镜56、针孔54、第二消色差透镜57、分束镜53、第三消色差透镜58、雪崩二极管51和光谱仪52等。
80.根据本发明的实施例，参见图5所示，激发光束可以由光源11射出，经过衰减器18、第一反射镜19后，耦合进光纤耦合器14，通过光纤与调制器15连接，再通过光纤准直器16出射，变成自由光。自由光经过二向色镜12和第二反射镜17的反射进入显微物镜13，可以聚焦到固态自旋纳米颗粒27上，使得光束范围内的固态自旋传感器发射荧光。
81.根据本发明的实施例，参见图5所示，在固态自旋纳米颗粒在激发光的作用下发射出荧光的情况下，荧光可以经由显微物镜13收集，再经过第二反射镜17、二向色镜12、滤光片55和第一消色差透镜56，会聚到针孔54上，再经过第二消色差透镜57变成平行光。分束镜53可以将荧光光束分束到雪崩二极管51和光谱仪52上。雪崩二极管51可以将荧光光束转换为用于记录荧光光子数的荧光计数，光谱仪52可以将荧光光束转换为光谱信号。
82.根据本发明的实施例，在采用all-optical方法测温的模式下，光谱信号可以作为特征信号，用于确定生化反应过程的温度变化测量结果。
83.根据本发明的实施例，参见图5所示，在利用泵浦光模块产生激发光束照射固态自旋纳米颗粒27的情况下，微波模块4也可以基于微波波源42、微波功率放大器43和辐射组件41产生微波场，辐射至该固态自旋纳米颗粒27。在该种情况下，固态自旋纳米颗粒可以吸收微波信号。在采用odmr方法测温的模式下，固态自旋纳米颗粒对微波场的吸收频率可以作为特征信号，用于确定生化反应过程的温度变化测量结果。
84.根据本发明的实施例，参见图5所示，6为处理模块。处理模块6可以控制如位移模块21、光纤准直器16、雪崩二极管51以及光谱仪52等电子学部件。处理模块6例如还可以记录微波源波源42生成的微波信号的微波频率。
85.通过本发明的上述实施例，提供一种亚微米尺度、用于测量生化分子相互作用过程中温度变化的装置，使用基于荧光的纳米颗粒和热响应分子的测量可以解决空间限制，具有系统结构和操作简单、空间分辨率高、样品消耗量小、化学稳定性好、灵敏度高的优点。
86.图6示意性示出了根据本发明实施例的采用odmr方法实现的基于固态自旋传感器的生化反应温度测量方法的流程图。
87.如图6所示，该方法包括操作s610～s670。
88.在操作s610，利用温度控制模块控制样品模块所占据的环境温湿度保持稳定，样品模块中包括作为温度探针的固态自旋纳米颗粒和用于进行生化反应的待测样品。
89.在操作s620，利用泵浦光模块，对放置于样品模块内的固态自旋纳米颗粒施加激
发光束。
90.在操作s630，利用微波模块，对放置于样品模块内的固态自旋纳米颗粒施加多个不同频率的微波场。
91.在操作s640，利用雪崩二极管，获取固态自旋纳米颗粒在接收到每个频率的微波场的情况下所发射的荧光光子的荧光计数，得到多个荧光计数。
92.在操作s650，利用微波波源，获取微波场的微波频率。
93.在操作s660，利用处理模块，控制同时施加激发光束和多个不同频率的微波场，并记录多个荧光计数，在检测到荧光计数发生改变的情况下，获取与固态自旋纳米颗粒的自旋能级相匹配的目标微波频率。
94.在操作s670，根据目标微波频率，确定生化反应的过程的温度变化测量结果。
95.图7a示意性示出了根据本发明实施例的单个荧光计数的计数原理图。
96.根据本发明的实施例，在采用odmr方法测温的模式下，如图7a所示，可以利用处理模块6控制泵浦光模块1和微波模块4对固态自旋纳米颗粒同时施加一段时间的激发光束和一定频率的微波场。在对固态自旋纳米颗粒施加激发光束的情况下，固态自旋纳米颗粒可以在基态与激发态之间跃迁。在该过程中，可利用雪崩二极管检测该段时间内固态自旋纳米颗粒发射的荧光光子的荧光计数。在该段时间结束后，可以在下一个时间段改变微波频率，重复前述过程，并获得相应时间段的荧光计数。通过该种方法，可以获得固态自旋纳米颗粒在接收到不同频率的微波场的不同时间段下所发射的荧光光子的多个荧光计数。
97.根据本发明的实施例，在对固态自旋纳米颗粒施加微波场的情况下，微波场的微波频率与固态自旋纳米颗粒的自旋能级匹配时两者可以发生共振，共振发生时固态自旋纳米颗粒的荧光计数可以发生改变，例如以nv色心为例的自旋传感器的计数会降低，共振发生时微波信号的微波频率可以作为共振频率。基于该原则，可以根据多个荧光计数，获取荧光计数发生改变时的微波频率，作为与固态自旋纳米颗粒的自旋能级相匹配的目标微波频率。具体地，在该过程中，可根据微波波源确定相应的微波频率。通过将固态自旋纳米颗粒置于温度变化的环境中，保持激发光束信号不变，同时扫描荧光计数发生改变时的微波信号的微波频率，可以根据共振频率的变化，测量生化反应过程中的温度变化。
98.图7b示意性示出了根据本发明实施例的根据微波频率和荧光计数确定共振频率的示意图。
99.图7c示意性示出了根据本发明实施例的根据共振频率确定温度变化的示意图。
100.如图7b所示，d(t)表征共振频率，在固态自旋纳米颗粒处于由于生化反应引起温度变化的环境的情况下，共振频率d(t)会发生变化。通过检测共振频率的变化，即可测量温度变化。如图7c所示，根据共振频率的变化曲线，可以确定温度变化曲线，从而可确定相关生化反应过程的温度变化测量结果。
101.根据本发明的实施例，特征信号共振频率d(t)也可以拓展为用总荧光计数、四点法等方式描述，在此不做限定。例如，可以根据针对固态自旋纳米颗粒发射的荧光光束的荧光计数，确定共振频率d(t)。
102.图8示意性示出了根据本发明实施例的采用all-optical方法实现的基于固态自旋传感器的生化反应温度测量方法的流程图。
103.如图8所示，该方法包括操作s810～s840。
104.在操作s810，利用温度控制模块控制样品模块所占据的环境温湿度保持稳定，样品模块中包括作为温度探针的固态自旋纳米颗粒和用于进行生化反应的待测样品。
105.在操作s820，利用泵浦光模块，对放置于样品模块内的固态自旋纳米颗粒施加激发光束。
106.在操作s830，利用光谱仪，获取固态自旋纳米颗粒发射的荧光的光谱信息。
107.在操作s840，利用处理模块，根据光谱信息，确定生化反应的过程的温度变化测量结果。
108.根据本发明的实施例，在采用all-optical方法测温的模式下，可以对固态自旋纳米颗粒施加激发光束，固态自旋纳米颗粒在接收到激发光束的激发作用的情况下，可以在基态与激发态之间跃迁。固态自旋纳米颗粒在由激发态到基态的自发辐射荧光光谱会随温度的变化而变化，根据光谱的谱峰位置、谱峰面积、谱峰峰宽等特征的变化，可以测量相关生化反应过程中的温度变化。
109.图9示意性示出了根据本发明实施例的采用all-optical方法测温的原理图。
110.如图9所示，展示了利用相同波长的激发光束在不同温度下激发同一固态纳米自旋颗粒时的发射光谱。以nv色心的自旋传感器为例，910为在以594nm激发光束在30℃的温度下激发该自旋传感器的情况下，nv-的发射光谱，920为在以594nm激发光束在37℃的温度下激发该自旋传感器的情况下，nv-的发射光谱，放大部分930可以为发射光谱910、920在637nm处的零声子线部分的对比结果，可以用于确定637nm处的零声子线部分对应于不同发射光谱时的荧光强度变化。
111.图10示意性示出了根据本发明实施例的光谱方法测温响应系数的示例图。
112.根据本发明的实施例，通过定义扣除线性背景后的零声子线面积为德拜-沃勒因子，可以得到德拜-沃勒因子的变化随温度变化的线性关系：
113.δt＝φ*δdwf/dwf0ꢀꢀꢀꢀ
(1)
114.如图10所示。δt可以表征温度变化量，φ可以表征德拜-沃勒因子对温度变化的响应系数，δdwf可以表征德拜-沃勒因子的变化量，dwf0可以表征参考温度下的德拜-沃勒因子。
115.图11a示意性示出了根据本发明实施例的采用all-optical方法检测酸碱中和反应过程的温度变化的示意图。
116.图11b示意性示出了根据本发明实施例的采用all-optical方法检测酸碱中和反应的稳定性的检测结果。
117.如图11a和图11b所示，例如为本发明实施例提供的在非等温模式下、利用all-optical方法测温来进行酸碱中和反应的稳定性测试。具体实施过程可以包括：将酸液预先放置于反应腔室中，碱液放置于微流管尖端，等待反应腔室周边的环境温度达到热平衡。之后将碱液从微流管推入反应腔室，同时检测固态自旋纳米颗粒发射的荧光光谱对应的温度变化。如图11a所示，可以获得酸碱中和反应温度呈剧烈变化，通过比较反应前温度δt
ini
和反应后温度δt
fin
基线的变化，可以评估固态自旋纳米颗粒作为温度探针的化学稳定性。图11b通过进行多次酸碱中和反应展现了优于100mk的稳定性。
118.图12示意性示出了根据本发明实施例的采用all-optical方法检测atp酶促水解过程的温度变化的示意图。
119.如图12所示，例如为本发明实施例提供的在非等温模式下、利用all-optical方法测温来进行atp(三磷酸腺苷)在酶催化下水解的动力学过程中的温度变化图。具体实施过程可以包括：将催化酶溶液预置于反应腔室内，atp溶液预置于微流管尖端，等待反应腔室周边的环温度达到热平衡。之后将atp推入反应池中，同时监测固态自旋纳米颗粒发射的荧光光谱对应的温度变化。如图12所示，atp在酶催化下水解放热，温度上升，同时系统散热导致温度下降。用双e指数函数拟合整个过程，从拟合结果中可以得到反应时间τ
rise
和反应焓h
reac
＝84*δt
reac
。其中，双e指数函数如式(2)所示：
[0120][0121]
其中，δt(t)可以表征t时刻的温度变化量，δt
ini
可以表征反应开始前温度相对于参考环境温度的温度变化，δt
reac
可以表征反应焓对应的相对于参考环境温度的温度变化，δt
fin
可以表征热平衡后的温度相对于参考环境温度的温度变化，τ
rise
可以表征反应时间，τ
decl
可以表征散热时间，t0可以表征生化反应的开始时刻。
[0122]
根据本发明的实施例，在需要执行基于固态自旋传感器的生化反应温度测量方法的情况下，可以执行如下操作：s1.制备反应池：设计好反应腔室并将固态自旋纳米颗粒固定在反应腔室内。s2.预置反应液：将反应液a液滴预置于反应腔室中，浸没固态自旋纳米颗粒，再将反应液b预置于微流管内。s3.稳定温度：按照温度控制模块的设定参数，等待固态自旋纳米颗粒附近温度达到平衡。s4.滴加反应液b：温度平衡后，将反应液b液滴推入反应腔室中，同时连续检测固态自旋纳米颗粒反映出来的特征信号。s5.数据处理：处理特征信号，得到温度的时域变化结果，从而可以得出反应液a、b分子反应焓和反应速率的相关信息。
[0123]
通过本发明的上述实施例，提供了基于固态自旋传感器的生化反应温度测量方法，利用固态自旋传感器对温度变化的快速响应，能够实现化学稳定性好、测温灵敏度高、样品消耗量少的亚微米尺度生物分子相互作用过程的温度测量。例如，基于odmr方法，利用固态自旋纳米颗粒对温度变化敏感的微波场吸收频率的变化来监测生化反应过程中的温度变化时，可以对来自生物组织的误差来源如散射、吸收和背景荧光具有较高的鲁棒性，且具有较高的灵敏度。基于光谱信息的全光学测温方法无需微波操控，操作更简单。本装置兼容两种测温方法，光学部分与电子部分结构简单，具有操作成本低的优点。本发明的上述实施例，结合宽场技术，还可以拓展应用到高通量的应用中。
[0124]
需要说明的是，实施例中提到的方向用语，例如“上”、“下”、“前”、“后”、“左”、“右”等，仅是参考附图的方向，并非用来限制本发明的保护范围。贯穿附图，相同的元素由相同或相近的附图标记来表示。在可能导致对本发明的理解造成混淆时，将省略常规结构或构造。并且图中各部件的形状和尺寸不反映真实大小和比例，而仅示意本发明实施例的内容。再者，单词
″
包含
″
不排除存在未列在权利要求中的元件或步骤。位于元件之前的单词“一”或“一个”不排除存在多个这样的元件。
[0125]
类似地，应当理解，为了精简本发明并帮助理解各个发明方面中的一个或多个，在上面对本发明的示例性实施例的描述中，本发明的各个特征有时被一起分组到单个实施例、图、或者对其的描述中。然而，并不应将该发明的方法解释成反映如下意图：即所要求保
护的本发明要求比在每个权利要求中所明确记载的特征更多的特征。更确切地说，如下面的权利要求书所反映的那样，发明方面在于少于前面发明的单个实施例的所有特征。因此，遵循具体实施方式的权利要求书由此明确地并入该具体实施方式，其中每个权利要求本身都作为本发明的单独实施例。
[0126]
以上所述的具体实施例，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明，应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实施例而已，并不用于限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。