一种利用太赫兹频域光谱快速鉴别林下山参和园参的方法

：
1.本发明属于中药鉴定检测领域，涉及林下山参和园参的鉴别方法，具体来说是一种采用太赫兹频域光谱鉴别林下山参和园参的方法。


背景技术：

2.人参(panax ginseng c.a.mey)为多年生草本植物，由于其抗衰老、抗癌、抗压力、抗疲劳和抗焦虑作用，一直是全球畅销的天然保健品之一。
3.根据生长环境和栽培方式的不同可将人参分为三类：园参，林下山参以及野生人参。野生人参生长年限长，目前资源极为短缺。园参，即人工栽培在园地的人参，一般种植4-6年。林下山参，指播种或者移栽到山林野生状态下自然生长的人参，在药性方面超过普通的园参，具有更高的药食用价值，市场售价也远超普通的人参。
4.目前，林下山参和园参在整株的情况下可以通过观察外观性状，专业的人士可以通过采取传统的人参“五型”的方法进行鉴别，但是对于人参的切片、粉末、或者加工物进行品种的区分，非常具有挑战。
5.国家标准《野山参鉴定及分等质量gb/t 18765-2015》中，采用理化方法，通过高效液相色谱鉴定人参皂苷含量成分的部分，有描述野山参中的人参皂苷的成分如rb1的含量大于0.40％，re和rg1含量之和大于0.60％，总皂苷含量大于4.40％。而这一含量标准需要复杂的样本制备处理，提取的人参皂苷借助液质平台进行检测，往往要花费6-8个小时的时间。由于野山参目前在全球数量极其有限，市场上流通的“野山参”以多年生长的林下山参为主。国家标准中没有给出园参的主要皂苷含量，以及利用皂苷含量比较区分林下山参和园参两种人参的方法。
6.国家标准方法中给出理化性质鉴定中利用液质联用技术平台确认皂苷含量的不同来鉴定参种的技术适合用于林下山参和园参的鉴定。受制于复杂的样本打粉，化学试剂提取，液质联用仪器进样，标准物质对比等复杂的实验操作和过程。在实际的市场流通中无法普及应用。其他的有报道的方法有利用拉曼光谱、近红外光谱、等光学手段方法，操作简单，但由于灵敏度和特异性不高，并且没有在相同的样本上同时进行标准方法和光谱学方法的一致性验证。
7.太赫兹(terahertz，thz)是一种具有特定波长的处于微波与红外之间的电磁波，其特有的波段频率在0.1-10thz范围，波长在0.03-3m。太赫兹用于现代分析领域的原理为：利用太赫兹透过待检测的物体，会得到穿过检测物质后的太赫兹波或者是被检测物体反射回来的太赫兹波信号，这些信号包含了待检测物在太赫兹波段的光谱吸收特性，将得到的时域信号除掉背景信号后，可以得到被测物的光谱时域信号。
8.太赫兹技术较其他的光谱技术在鉴定中药的时候具有如下几个优势：
9.1：测量中药时域谱和瞬态特性，太赫兹脉冲宽度在皮秒至飞秒量级；
10.2：太和兹技辐射的光子能量很低，(约4.1mev)，不会对所测中药产生伤害；
11.3：所需要样本量可低至几个毫克，不会对珍贵中药材造成检测上的样本浪费；
12.4：可验证性：太赫兹波段处于微波与红外波之间，可以与其他应用于中药鉴定的光谱技术相互验证和补充；
13.5：适应在实际中的应用，太赫兹技术操作简单，一般是打粉压片即可；
14.6：太赫兹光谱具有较快的检测效率和较强的信噪比；


技术实现要素：

15.针对现有技术的人参鉴定过程复杂问题，结合太赫兹光谱的优势。本发明提供了一种采用太赫兹频域光谱鉴别林下山参和园参的方法，所述方法解决现有技术中鉴别林下山参和园参的方法复杂、时间长的技术问题。准确性和现有国家标准中利用理化性质进行区分鉴定的结果相比，结果可靠，具有良好的一致性。
16.包括如下步骤：
17.一种采用太赫兹光谱鉴别林下山参和园参的方法，其包括如下步骤：
18.1)一个获取待测人参样本指纹图谱的步骤：
19.a)取晒干的待测人参样本根部组织，通过粉碎机处理，制成人参粉，取20-200mg，干燥；
20.b)将干燥后的待测人参粉末和透光性辅料混合(透光性辅料为在太赫兹特有的波段频率0.1-10thz范围内光学吸收较弱的材料)
21.c)将步骤b)中的混合物进行研磨和混合，压制成薄片；
22.d)将步骤c)中的薄片样本采用太赫兹光谱进行检测，得到待测样本的太赫兹光谱的全频域吸收数据表；
23.2)对太赫兹光谱全频域的吸收数据进行分析处理的步骤；
24.a)将收集的待测样本的太赫兹光谱全频域的吸收数据表导入origin 14.1，生成光谱吸收图，x轴为太赫兹频域，y轴为光学吸收数值，发现8.25-9.50thz区段存在差异化。
25.b)对x轴8.25-9.50thz之间对应的y轴的吸收光谱值进行一阶求导，以8.25-9.50thz光谱区域为横坐标x，此区间待测样本的太赫兹光学吸收数据的一阶导数为纵坐标y，取此区间的y值最大值为ymax,最小值为ymin；
26.c)令δy＝ymax-ymin若：
27.δy》0.15，则为园参；
28.δy《0.15，则为林下山参；
29.如上所述的一种采用太赫兹时域光谱鉴别林下山参和园参的方法，其中在一个获取待测人参样本太赫兹指纹图谱中，待测样本和透光性辅料混合，优选为1：1
‑‑
1：10之间。
30.如上所述的一种采用太赫兹时域光谱鉴别林下山参和园参的方法，其中透光性辅料为聚乙烯类高分子化合物。
31.如上所述的一种采用太赫兹时域光谱鉴别林下山参和园参的方法，其中在一个对太赫兹光谱全频域的吸收数据进行分析处理的步骤中，9.2thz处园参有特异性吸收，而林下山参没有吸收峰。
32.更具体的，该方法包括以下步骤：
33.1)一个获取林下山参和园参太赫兹指纹图谱的步骤：
34.a)分别取晒干的林下山参和园参样本的根部组织，通过粉碎机处理，分别制成细
碎的人参粉，取20-200mg，干燥，通过恒重称量的方法确认水分挥发完全；
35.b)将充分干燥的林下山参和园参样本的人参粉末分别和辅料充分混合；
36.c)将步骤b)中的混合物分别进行研磨和混合，压制成薄片；
37.d)将步骤c)中的薄片样本转移到太赫兹光谱上进行检测，得到林下山参和园参样本的太赫兹光谱的全频域吸收数据表；
38.2)一个对太赫兹光谱全频域的吸收数据进行分析处理的步骤；
39.a)利用收集的林下山参和园参样本的太赫兹光谱全频域的吸收数据表导入origin 14.1(origin是由originlab公司开发的一个科学绘图、数据分析软件)，生成两种参种的光谱吸收图，x轴为太赫兹频域，y轴为光学吸收数值，通过比较林下山参和园参样本的太赫兹吸收峰图，发现园参和林下山参8.25-9.50thz区段存在差异化；
40.b)定位到8.25-9.50thz之间频域区间，经过多项式拟合平滑，标准正态变化，直线相减，一阶导数，二阶导数处理，对比挑选此频域区段能够明显放大差异化吸收的算法；确认对8.25-9.50thz之间的吸收光谱谱图进行一阶求导的数据模型，可以有效区分鉴定林下山参和普通的园参；
41.c)以8.25-9.50thz光谱区域为横坐标x，此区间两种人参的太赫兹光学吸收数据的一阶导数为纵坐标y，取此区间的y值最大值为ymax,最小值为ymin；
42.d)令δy＝ymax-ymin若：
43.δy》0.15,则为园参；
44.δy《0.15，则为林下山参。
45.进一步的，在一个获取林下山参和园参太赫兹指纹图谱中，林下山参和园参样本的人参粉末分别和辅料充分混合，优选的混合范围是人参粉末和辅料的质量比在1：1
‑‑
1：10之间。
46.进一步的，在一个获取林下山参和园参太赫兹指纹图谱的步骤中，辅料优选为聚乙烯高分子化合物。
47.进一步的，在一个对太赫兹光谱全频域的吸收数据进行分析处理的步骤中，9.2thz处园参有特异性吸收，而林下山参没有吸收峰。
48.本发明提供了一种利用太赫兹光谱吸收峰鉴别普通园参和以林下山参的方法，发明人通过测定两种不同类型人参样品，利用多地采购的普通园参样本，并重点收集7年-20年的不同年份林下山参样本进行测试，通过分析不同频域的吸收值，找到林下山参和园参差异化的光谱吸收波段，多次分析，数学建模，得到该特定频域内对两种人参进行有效区分的数学模型。同时根据国家标准《野山参鉴定及分等质量gb/t 18765-2015》中推荐的分析人参中的皂苷成分的方法，测得林下山参和园参中的人参皂苷的成分rg1、re和rb1的含量，找到利用皂苷含量区分林下山参和园参的方法。对比得到两种方法的一致性良好。说明基于太赫兹光谱的特异性的吸收信号值建立的数学模拟，可发展为鉴定技术快速鉴定林下山参和园参的方法。
49.本发明和已有技术相比，其技术进步是显著的。采用光谱技术中的太赫兹光谱应用到名贵中药材人参中，建立林下山参和普通园参无损鉴定的方法。同时和现有的色谱技术对比人参皂苷区分两种人参的方法具有可对比，两者的一致性良好.
附图说明：
50.图1：7年-20年的林下山参的样本图。
51.图2：a林下山参液相色谱图,b园参液相色谱图
52.图3：7年-20年的林下山参的太赫兹指纹图谱。
53.图4：普通园参茎和须和8年、20年林下山参在9.2thz差异化吸收图。
54.图5：8.25thz-9.50thz区分林下山参和园参的方法。
55.下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
具体实施方式：
56.实施例1
57.20份样本包含：
58.园参主根粉末样本8份(生长年限4-6年)，称量粉末500mg-1g备用
59.林下山参的样本12株(7年-20年)的样本，如图1，人参整株样品，截切主根部分进行打粉，称量粉末500mg-1g备用
60.一、利用国家药典推荐的高效液相色谱方法检测样本中常见的人参皂苷rg1，re，rb1的含量，通过比较(rg1+re)/rb1的比值可以区分出两种人参。
61.实验所用仪器和试剂：
[0062][0063][0064]
1)供试品溶液的制备：
[0065]
取100mg样品至2ml的ep管中，加入1ml的体积百分比为75％的甲醇溶液，用封口膜将管口处封住，超声1个小时，用0.22wn的聚四氟乙烯一次性滤头过滤到固体的残渣，得到清澈的淡黄色人参皂苷溶液大概600ul。
[0066]
2)对照品溶液的制备：精密称量rg1,re和rb1的对照品，分别加甲醇溶解得约0.50mg/ml的对照品原液，再分别吸取适量原液，加甲醇稀释得到适宜浓度的混标溶液。
[0067]
3)色谱和梯度进样条件
[0068]
高压液相色谱是利用acquity uplc/synapt g2，ms系统(沃特世)的两元溶剂系统外带一个pda的检测器，利用沃特世的acqutty hss t3色谱柱(100mm*2.1mm，1.8mm)，
[0069]
流动相选用a)体积百分比浓度为0.1％的甲酸溶液，b)体积百分比浓度为0.1％的甲酸溶液和乙腈的梯度洗脱方案如下：
[0070][0071]
洗脱速度，设置在0.4ml/min，色谱柱和空气的温度分别保持在40℃和8℃，所检测到的色谱峰用masslynx v4.2 software进行数据分析。
[0072]
4)通过对照品，获取re+rg1的时间在6.75分钟-7.10分钟，rb1的出峰时间在10.98-11.30分钟。如图2所示。对应色谱峰用masslynx v4.2 software进行数据处理获取吸收峰面积后。进行(re+rg1)/rb1的比值计算。(re+rg1)/rb1《1的结果判定样本为园参，(re+rg1)/rb1》1的结果判定为林下山参。
[0073]
二、获取林下山参和园参太赫兹光学信号谱图并进行数据处理分析
[0074]
1)粉末样本100mg，干燥，通过干燥恒重的称量方法确认水分挥发完全；
[0075]
2)将充分干燥的林下山参和园参样本的人参粉末分别和辅料充分混合，人参粉末和辅料的质量比在1：5；
[0076]
3)将以上混合物分别压制成薄片，转移到太赫兹光谱上进行检测，得到样本的太赫兹光谱的全频域吸收数据图表，其中，共12株林下山参的7-20年太赫兹频域谱图如图3
[0077]
4)将以上数据表导入origin 14.1得到两种参种的光谱吸收图，发现园参和林下山参8.25-9.50thz区段存在差异化，在9.2thz园参具有明显吸收峰，而林下山参则没有吸收。其中，8年和20年林下参和园参的光谱差异吸收图示意如图4
[0078]
5)截取8thz-10thz之间频域区间的光学信号数值进行一阶求导，在8.25-9.50thz区间，的最大值为ymax，最小值为ymin
[0079]
计算每个样本的δy(ymax-ymin)值进行判断如图5
[0080]
两种不同方法对林下山参和园参的鉴定准确符合率如下表
[0081]
表1：液质联用检测人参皂苷含量样本结果：
[0082][0083][0084]
表2：不同参种太赫兹光谱8.25thz-9.50thz区域光学吸收：
[0085][0086]
两种方法鉴定林下山参和园参的准确率：
[0087]
液质联用准确度：90％太赫兹光谱准确度：85％
[0088]
利用太赫兹光谱技术每个样本的处理鉴定时间约为20分钟，检测时间约需要1分钟。对比现有的文献和行业标准方法通过理化性质-皂苷含量判定“野生“山参需要6-8个小时来说，可明显降低操作时间。
[0089]
实施例2
[0090]
含有普通园参和林下山参粉末样本共计43份样本进行盲测，
[0091]
1)按照两种不同方法进行检测总结结果，如下
[0092]
[0093]
2)比较两种方法检测的一致性，采用配对卡方检验
[0094][0095]
表2：配对χ2检验
[0096][0097]
结果判断：kappa＝0.767，p《0.05，证明两种方法具有良好的一致性，可以通过统计学检验。