一种提高紫杉醇脂质体冻融稳定性的血浆样品前处理方法与流程

1.本发明涉及一种样品处理方法，特别是涉及一种提高紫杉醇脂质体冻融稳定性的血浆样品前处理方法。


背景技术：

2.紫杉醇是一种从裸子植物红豆杉的树皮分离提纯的天然次生代谢产物，经临床验证，具有良好的抗肿瘤作用，通过使微管蛋白和组成微管的微管蛋白二聚体失去动态平衡，诱导与促进微管蛋白聚合、微管装配、防止解聚，从而使微管稳定并抑制癌细胞的有丝分裂和触发细胞凋亡，进而有效阻止癌细胞的增殖，特别是对癌症发病率较高的卵巢癌、子宫癌和乳腺癌等有特效。紫杉醇是近年国际市场上最热门的抗癌药物，被认为是人类未来20年间最有效的抗癌药物之一。
3.作为一种可用于治疗多种癌症的广谱化疗药物，紫杉醇的水溶性较差，因此，用脂质体作为紫杉醇的递送系统，可以提高药效、降低毒性。脂质体是一种人工膜，在水中磷脂分子亲水头部插入水中，脂质体疏水尾部伸向空气，搅动后，形成双层脂分子的球形脂质体。
4.脂质体结构复杂，通常的成分包括阳离子脂质体，卵磷脂，胆固醇和聚乙二醇。尽管脂质体的制备工艺在不断改进，脂质体紫杉醇的稳定性仍然极易受环境因素的影响，比如温度，ph值，氧化剂等，脂质体不稳定，会直接导致药物的渗漏。临床前毒理试验的生物样品中的紫杉醇脂质体药物的定量也面临着巨大挑战，其中，冻融稳定性是一直无法解决的难题。含有紫杉醇脂质体的生物样品在1次冻融循环后，就会导致药物的渗漏，使得游离紫杉醇和脂质体紫杉醇在样品中的相对比例发生改变，从而导致各自定量的不准确性。
5.目前，对于紫杉醇脂质体冻融稳定性的常规解决办法是尽量避免反复冻融，在毒理实验中采集动物的全血后，立即离心成血浆，再把得到的血浆立即进行生物分析前处理，即通过固相萃取把游离紫杉醇和脂质体紫杉醇立即分离，之后再分别冻存起来以便后续定量检测。然而，得到血浆后立即进行固相萃取等前处理，这一系列步骤的操作时间较长且操作较为繁琐，长时间的连续工作，不仅增加了操作人员的单次工作强度，还容易导致出现操作失误，影响分析检测的结果；除此之外，避免反复冻融，并不能够从根本上提升紫杉醇脂质体的稳定性，要解决紫杉醇脂质体的冻融稳定性，还应从血浆样品的处理方法上进行创新性改进。
6.因此，本领域需要研究一种能够提高紫杉醇脂质体冻融稳定性的血浆样品前处理方法，能够保证在反复冻融后，紫杉醇脂质体不会破裂或渗漏，且方法操作简便、试验成本低，无需长时间连续操作，保证操作人员的合理工作时间，从而保证后续试验检测的准确性。


技术实现要素：

7.本发明所要解决的技术问题在于，提供一种能够提高紫杉醇脂质体冻融稳定性的
血浆样品前处理方法，能够保证在反复冻融后，紫杉醇脂质体不会破裂或渗漏，且方法操作简便、试验成本低，无需长时间连续操作，保证操作人员的合理工作时间，从而保证后续试验检测的准确性。
8.为解决上述技术问题，本发明提供的一种提高紫杉醇脂质体冻融稳定性的血浆样品前处理方法，包括以下步骤：步骤1、全血样品采集：对毒代实验动物采全血，置于采血管中，所述采血管中添加有抗凝剂；将装有全血样品的采血管轻轻颠倒数次，使全血样品与抗凝剂混匀，放入湿冰中保存；步骤2、血浆样品采集：完成步骤1后1小时内，取步骤1的全血样品，在2800 xg，4 ℃条件下离心10分钟，得到血浆样品；步骤3、蛋白酶抑制剂处理：在经步骤2处理后得到的血浆样品中加入蛋白酶抑制剂，所述蛋白酶抑制剂为sigmafast蛋白酶抑制剂；步骤4、冻存处理：将步骤3处理后的血浆样品分为两份，分别转移至透明的聚丙烯管中，再将所述聚丙烯管垂直放入干冰，并储存在超低温冰箱中；步骤5、血浆样品的固相萃取和蛋白沉淀前处理：取260
µ
l 的5%葡萄糖溶液置于预冷的离心管中，加入步骤4处理后的血浆40
µ
l，混匀；对hlb固相萃取柱进行润洗、活化和平衡，结束后，从所述离心管中取250
µ
l样品进行上样，之后再用250
ꢀµ
l 10%pbs清洗hlb固相萃取柱；步骤6、采用超高效液相色谱质谱分析检测血浆样品中的脂质体紫杉醇含量以及游离紫杉醇含量：将步骤5中的上样样品和hlb固相萃取柱的洗脱液混匀，取100
µ
l作为检测样品，采用内标法，进行超高效液相色谱质谱联用分析，检测血浆样品中的脂质体紫杉醇的含量；步骤5结束后，对hlb固相萃取柱进行再次洗脱，收集洗脱后的样品，采用内标法，进行超高效液相色谱质谱联用分析，检测血浆样品中的游离紫杉醇的含量；所述内标法采用格列苯脲为内标液，所述格列苯脲的用量为10
µ
l。
9.具体地，所述步骤1中，所述抗凝剂为k2 edta。
10.具体地，所述步骤1中，所述采血管预先在4 ℃条件下预冷处理。
11.具体地，所述步骤3中，所述蛋白酶抑制剂为40x sigmafast蛋白酶抑制剂，且所述蛋白酶抑制剂与血浆样品的体积比为18：1、19：1或20：1中的一种。
12.优选地，所述蛋白酶抑制剂与血浆样品的体积比为19：1。
13.具体地，所述步骤3中，所述蛋白酶抑制剂预先在4 ℃条件下预冷处理。
14.具体地，所述步骤4中，所述聚丙烯管预先在4 ℃条件下预冷处理，所述超低温冰箱的温度设置为
ꢀ‑
60℃。
15.具体地，所述步骤5中，对hlb固相萃取柱进行润洗、活化和平衡是指取血浆样品100
µ
l和5% glucose 100
µ
l混匀，再取甲醇200
µ
l和去离子水200
µ
l，对hlb固相萃取柱进行润洗、活化和平衡。
16.具体地，所述步骤6中，检测血浆样品中的脂质体紫杉醇的含量时，先在待测样品中加入10
µ
l 格列苯脲和490
µ
l 含0.05% tfa 的乙腈，离心后取100
µ
l上清，再加100
µ
l 去
离子水，混匀进样。
17.具体地，所述步骤6中，对hlb固相萃取柱进行再次洗脱是指，先使用5% acn，20% acn各200
µ
l清洗hlb板，再使用125
µ
l的90% acn洗脱hlb固相萃取柱两遍，检测血浆样品中的游离紫杉醇的含量时，收集洗脱液后混匀取100
µ
l，加入10
µ
l 格列苯脲，再加100
µ
l 去离子水，混匀进样。
18.本发明的样品前处理方法具有以下有益效果：1、本发明方法在处理血浆时，通过添加适量的sigmafast蛋白酶抑制剂，有效抑制血浆中质蛋白酶对脂质体胆固醇的分解，胆固醇能够通过降低脂质体的流动性来减少脂质体的渗漏，因此，防止胆固醇的分解，能够有效提升紫杉醇脂质体的稳定性，防止其发生破裂和渗漏的现象。
19.2、本发明方法中，对制作血浆、固相萃取以及蛋白前处理的所有耗材均提前置于4℃的条件下预冷，防止后续放入或取出超低温冰箱时，由于温度骤然升降，导致内水相结晶膨胀从而引起膜破碎，从而提升紫杉醇脂质体的冻融稳定性。
20.3、本发明的方法处理血浆样品，血浆的ph为中性，降温过程温和，使得在对血浆进行固相萃取和蛋白沉淀前处理之前，能够反复冻融，而血浆中的紫杉醇脂质体在冻融过程中，不会产生渗透或者破裂，既方便了实验人员的操作，又保证了紫杉醇脂质体的冻融稳定性，从而也能够提高血浆样品的采样和检测通量，提升检测效率。
附图说明
21.图1为本发明实施例一中对照组血浆样本的色谱图；图2为本发明实施例一中实验组血浆样本中的游离紫杉醇的色谱图；图3为本发明实施例一中内标物格列苯脲的色谱图。
具体实施方式
22.下面将对本发明的技术方案进行清楚、完整的描述，显然，所描述的实施例是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
23.以下实施例中所用试剂未做特别说明的均为商品化试剂，其中，sigmafast蛋白酶抑制剂购自sigma公司，货号：slcf1306。本说明书中，lpl为脂蛋白酶的英文缩写，lcat为卵磷脂胆固醇酯酰转移酶的英文缩写，hdl是高密度脂蛋白胆固醇的英文缩写，vldl是极低密度脂蛋白的英文缩写，hlb是亲水亲油平衡的英文缩写，hlb亲水亲油平衡填料为固相萃取柱填料的一种，tfa为三氟乙酸，fa为乙酸，acn为乙腈，k2 edta为乙二胺四乙酸二钾，5% glucose为浓度为5%的葡萄糖溶液。
24.表2-9中，sf： sigmafast蛋白酶抑制剂；偏差：两组数据的偏差，接受标准为15%以内；收率值：以新鲜配置样品为基准的收率值，接受范围为85%-115%；冻融：freeze thaw，本领域内英文简称ft，指将样品冷冻后再解冻融化的过程。
25.实施例1一、设置实验组，实验组包括两组平行实验，分别为平行组1和平行组2，具体操作如下：
a、全血样品采集：采血管预先在4 ℃条件下预冷处理，对毒代实验犬采全血，采血位置包括但不限于颈静脉或其他合适位点，采集0.3ml全血置于添加有k2 edta抗凝剂的采血管中，将装有全血样品的采血管轻轻颠倒数次，使全血样品与抗凝剂混匀，放入湿冰中保存； 血样在湿冰中可以保持至少1小时的稳定，除此之外可充入氮气，以提高血样中脂质体的稳定性。
26.b、血浆样品采集： 1小时内，取步骤1的全血样品，在2800 xg，4 ℃条件下离心10分钟，得到血浆样品；调节血浆样品ph值，可以通过添加适量碳酸或碳酸氢钠，使血浆ph值稳定在7-7.5，由于酸碱度对于脂质体的稳定性也会产生较大影响，因此在中性环境下，有利于紫杉醇脂质体的稳定性。
27.c、蛋白酶抑制剂处理：在血浆样品中加入40x sigmafast蛋白酶抑制剂，添加量为血浆：蛋白酶抑制剂=19：1，v：v，蛋白酶抑制剂主要抑制了血浆中脂蛋白酶lpl和卵磷脂胆固醇酯酰转移酶lcat的活性，lact是一种在血浆中起催化作用的酶，其作用是将hdl的卵磷脂的c2位不饱和脂肪酸转移给游离胆固醇，生成溶血卵磷脂和胆固醇酯，lpl不仅会消除胆固醇，还能够残余vldl和hdl之间的载脂蛋白和磷脂的转换，因此，sigmafast蛋白酶抑制剂对这些酶进行同步抑制，减少了胆固醇在反复冻融时的损失，保证了紫杉醇脂质体的流动性稳定在较低的水平，因此降低了紫杉醇脂质体的渗透可能性，也即提升了紫杉醇脂质体的冻融稳定性；通过剂量探索得到的血浆与蛋白酶抑制剂体积比，最优选为19：1，该添加比例能够保证蛋白酶抑制剂对脂蛋白酶等的抑制效果的同时，还能够尽可能减少sigmafast蛋白酶抑制剂本身的溶液占比。
28.d、冻存处理：将血浆样品转移至提前在4℃条件下预冷的透明聚丙烯管中，分为两份（一份用于分析检测，一份备份保存），两份样品分别垂直放入干冰，储存在超低温冰箱中，超低温冰箱的温度为-60℃。
29.e、血浆样品的固相萃取和蛋白沉淀前处理：取260
µ
l 的5%葡萄糖溶液置于预冷的离心管中，加入经过3次冻融操作后的血浆40
µ
l，颠倒混匀；对hlb固相萃取柱进行润洗、活化和平衡，使用的溶液为：血浆样品100
µ
l和5% glucose 100
µ
l混匀，再取甲醇200
µ
l和去离子水200
µ
l，完成对hlb固相萃取柱进行润洗、活化和平衡，结束后，从离心管中取250
µ
l样品进行上样，正压装置压干，之后用250
ꢀµ
l 10%pbs清洗hlb固相萃取柱。
30.f、采用超高效液相色谱质谱分析检测血浆样品中的脂质体紫杉醇的含量：取步骤e上样后的样品和hlb固相萃取柱洗脱液，混匀，在混匀后的液体中取100
µ
l，采用内标法，即添加10
µ
l格列苯脲作为内标液，再加入490
µ
l 含0.05% tfa 的乙腈，离心后取100
µ
l上清，再加100
µ
l 去离子水，混匀进样，进行超高效液相色谱质谱联用分析，检测血浆样品中的脂质体紫杉醇的含量。
31.g、采用超高效液相色谱质谱分析检测血浆样品中的游离紫杉醇的含量：步骤e处理后，先使用5% acn，20% acn各200
µ
l清洗hlb板，再使用125
µ
l的90% acn洗脱hlb固相萃取柱两遍，取洗脱液100
µ
l，采用内标法，即加入10
µ
l 格列苯脲，再加100
µ
l 去离子水，混匀进样，进行超高效液相色谱质谱联用分析，得到血浆样品中的游离紫杉醇的含量。
32.超高效液相色谱质谱检测条件如下表1所示：表1 超高效液相色谱质谱检测条件从图1-3中可看出，经本发明方法前处理后的血浆样品，性质稳定，在超高效液相色谱质谱检测中，内标物格列苯脲和检测物均正常出峰，本方法检测得到的犬血浆中游离紫杉醇含量和脂质体紫杉醇峰面积数据如下表2-5所示。
33.下表2-9中，sf：sigmafast蛋白酶抑制剂；偏差：两组数据的偏差，接受标准为15%以内；收率值：以新鲜配置样品为基准的收率值，接受范围为85%-115%；冻融：freeze thaw，本领域内英文简称ft，指将样品冷冻后再解冻融化的过程。
34.表2 浓度为10ng/ml的脂质体样品中游离紫杉醇的峰面积对比
表3 浓度为10ng/ml的脂质体样品中脂质体紫杉醇的峰面积对比表4 浓度为1000ng/ml的脂质体样品中游离紫杉醇的峰面积对比表5 浓度为1000ng/ml的脂质体样品中脂质体紫杉醇的峰面积对比表2为犬种属基质中添加蛋白酶抑制剂后，脂质体浓度为10ng/ml时，新鲜配制的脂质体中的游离紫杉醇与三次冻融后的脂质体中的游离紫杉醇的峰面积对比。
35.表3为犬种属基质中添加蛋白酶抑制剂后，脂质体浓度为10ng/ml时，新鲜配制的脂质体中的脂质体紫杉醇与三次冻融后的脂质体中的脂质体紫杉醇的峰面积对比。
36.通过表2和表3数据对比可以看出，在低浓度质控品（10ng/ml）下，经过3次冻融后，血浆样品中游离紫杉醇无明显增多，收率值为113.2%，脂质体紫杉醇无明显减少，收率值为93.9%，偏差值和收率值均在接受范围内，且平行组1和平行组2的数据无明显差异，平行性较好，数据可信性好，表明脂质体无明显的破裂和渗漏的现象，冻融稳定性较好。
37.表4为犬种属基质中添加蛋白酶抑制剂后，脂质体浓度为1000ng/ml时，新鲜配制的脂质体中的游离紫杉醇与三次冻融后的脂质体中的游离紫杉醇的峰面积对比。
38.表5为犬种属基质中添加蛋白酶抑制剂后，脂质体浓度为1000ng/ml时，新鲜配制的脂质体中的脂质体紫杉醇与三次冻融后的脂质体中的脂质体紫杉醇的峰面积对比。
39.根据表4和表5中的数据，同样可以对比看出，与低浓度质控品（10ng/ml）同理，在高浓度质控品 (1000ng/ml) 下，经过3次冻融后，同样未见游离紫杉醇的明显升高，收率值为103.8%，也未见脂质体紫杉醇的明显减少，收率值为116.4%，偏差值和收率值也均在接受范围内，且平行组1和平行组2的数据无明显差异，平行性较好，数据可信性好，均表明了脂质体无明显的破裂和渗漏的现象，冻融稳定性较好。
40.二、设置对照组，配制浓度为30ng/ml的脂质体和3750ng/ml的脂质体，对采集的犬血浆样品进行常规技术操作，即制得血浆样品后直接进行固相萃取、蛋白沉淀前处理，没有添加sigmafast蛋白酶抑制剂，也未采取调节ph和冲入氮气等操作，其余操作均与实验组相同，之后采用相同的条件进行超高效液相色谱质谱联用检测，检测血浆样品中的脂质体紫杉醇含量和游离紫杉醇含量，检测得到的犬血浆中游离紫杉醇含量和脂质体紫杉醇峰面积数据如下表6-9所示：表6 浓度为30ng/ml的脂质体样品中游离紫杉醇的峰面积对比表7 浓度为30ng/ml的脂质体样品中脂质体紫杉醇的峰面积对比
表8 浓度为3750ng/ml的脂质体样品中游离紫杉醇的峰面积对比表9 浓度为3750ng/ml的脂质体样品中脂质体紫杉醇的峰面积对比表6为常规技术处理的犬种属基质，脂质体浓度为30ng/ml时，新鲜配制的脂质体中的游离紫杉醇与经过一次、两次、三次冻融以及4小时湿冰加一次冻融后的脂质体中的游离紫杉醇的峰面积对比。
41.表7为常规技术处理的犬种属基质，脂质体浓度为30ng/ml时，新鲜配制的脂质体中的脂质体紫杉醇与经过一次、两次、三次冻融以及4小时湿冰加一次冻融后的脂质体紫杉醇的峰面积对比。
42.表6和表7数据表明，在低浓度质控品（30ng/ml）下，常规技术处理的样品中，无论是先置于湿冰4小时再经1次冻融，还是经2-3次冻融，随着冻融次数的增加，样品中游离紫杉醇的量明显增加，3次冻融后，收率值升高至210.2%，而脂质体紫杉醇的含量则大幅减少，
3次冻融后，收率值降至58.5%，数据偏差值在接受范围内，且平行组1和平行组2的数据无明显差异，平行性较好，数据可信性好，根据数据可明显看出，脂质体有破裂和渗漏的现象，导致紫杉醇大量释出。
43.表8为常规技术处理的犬种属基质，脂质体浓度为3750ng/ml时，新鲜配制的脂质体中的游离紫杉醇与经过一次、两次、三次冻融以及4小时湿冰加一次冻融后的游离紫杉醇的峰面积对比。
44.表9为常规技术处理的犬种属基质，脂质体浓度为3750ng/ml时，新鲜配制的脂质体中的脂质体紫杉醇与经过一次、两次、三次冻融以及4小时湿冰加一次冻融后的脂质体紫杉醇的峰面积对比。
45.表8和表9数据表明，在高浓度质控品（3750ng/ml）下，常规技术处理的样品中，同样的，无论是先置于湿冰4小时再经1次冻融，还是经2-3次冻融，随着冻融次数的增加，样品中游离紫杉醇的量明显增加，3次冻融后，收率值升高至143.6%，而脂质体紫杉醇的含量则大幅减少，3次冻融后，收率值降至76.9%，数据的偏差值在接受范围内，且平行组1和平行组2的数据无明显差异，平行性较好，数据可信性好，可明显看出，脂质体有破裂和渗漏的现象，导致紫杉醇大量释出。
46.综合上述数据对比可以明显看出，常规技术手段处理的犬种属基质样品中，紫杉醇脂质体的冻融稳定性很差，尤其是经多次冻融后，紫杉醇脂质体的收率值锐减，而游离紫杉醇明显升高，可见是紫杉醇脂质体发生了破裂所致。而本发明提供的方法对血浆样品进行处理后，血浆样品中的紫杉醇脂质体稳定性得到明显提升，经三次冻融后，未见明显的破裂和渗透现象，仍能保持良好的稳定性，保证了后续实验的效率和准确性。
47.综上所述，上述各实施例仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限定本发明的保护范围，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，皆应包含在本发明的保护范围内。