专利名称：免疫学检测肝炎的方法
技术领域：
本发明涉及一种检测肝炎病毒等生物活性分子样品的放射性免疫分析方法，它包括固相试剂的制备、放射性标记溶液的制备和自检标准液的制备。
放射免疫分析(RIA)技术中以固相放射免疫分析(SPRIA)最为优异。灵敏度高，特异性强，对乙型肝炎表面抗原(HBsAg)检测的灵敏度达到1ng/ml的水平;操作简便，适合医院临床、一般生物医学实验和防疫系统的应用。有关现有技术可参阅美国专利4514509、中国专利88106425和《原子能科学技术》1981年第2期204页。固相放射免疫分析的不足之处是免疫结合反应的时间较长，致使检测时间长，一般检测一次的时间需要2-3小时。其检测步骤包括1、将样品加入试管中;
2、将固相试剂(包被有抗原或抗体的塑料圆珠)也加入试管中;
3、将试管置45℃水浴中保温1.5小时;
4、用蒸馏水清洗塑料圆珠;
5、再加入用放射性标记的抗原或抗体溶液;
6、再置45℃水浴中保温1小时;
7、再清洗塑料圆珠;
8、将塑料圆珠移入测量管中，测量放射性计数。
固相免疫反应的时间长是由其反应方式造成的。固相放射免疫分析中，固相试剂既是结合部分(B)与游离部分(F)的分离剂，同时又参与免疫结合反应。而这种结合反应又必须在固液两相之间的界面处才能发生，因此决定完成结合反应的主要因素有1、发生免疫反应的两个分子结合的时间;
2、发生免疫反应的两个分子在发生结合前相互接触(碰撞)的机会;
3、液相中的分子转移到固液界面的时间。
前两种因素主要由发生反应的两种免疫剂分子本身的活性和浓度所决定，这主要采用提高免疫试剂质量来改善反应速度。而现有技术中忽略了第三个对反应速度起决定性的因素。
本发明的目的在于设法加快液相中分子移动到固液界面的速度来加速免疫结合反应的时间，从而提供一种快速检测肝炎病毒等生物活性分子的固相放射免疫分析的新方法。
本发明的内容现结合对反应的机理分析描述于下决定液相中分子移动速度的主要因子是1、溶液的粘度，粘度越大其分子的移动速度越慢;
2、固液相界面及液相内部的分子分布的不均一性，即浓度差，浓度差越大，越容易促进其运动;
3、液相中运动分子的形状和运动能量。
本发明为了实现上述目的，综合解决上述三个影响液相中分子运动速度的原因，配制一种加速剂。加速剂由减小粘度的化学试剂(减小粘度剂)和加速沉淀的化学试剂(加速沉淀剂)组成。
本发明也为了减小非特异性结合吸附，提高检测的灵敏度和特异性，在加速剂中还加入减小非特异性结合的化学试剂。
本发明利用可使免疫试剂沉淀的一类物质改变液相中免疫试剂的局部浓度，加速其向固液相界面移动的速度。
本发明利用可降低血清粘度的试剂以减小免疫分子运动的阻力。
本发明利用表面活性剂一类物质以减少免疫剂分子在固相表面的非特异吸附。
以下给出加速剂的三个最佳配方1、(NH4)2SO4∶15%，吐温-20∶0.5%，其余为0.05M，PH7.4的PBS。
2、PEG∶4-10%，吐温-20∶0.1-1%，其余为0.05M，PH7.4的PBS。
3、三氯醋酸∶2-5%，吐温-20∶0.1-1%，其余为0.05M，PH7.4的PBS。
本发明用于固相放射免疫分析技术中组装实用的检测试剂盒，现以组装新的检测乙型肝炎表面抗原(HBsAg)为例来说明本发明的实际应用一、试剂盒的组成1、抗-HBs(McAb)包被珠，即固相试剂;
2、125I-抗-HBs(McAb)液，即放射性标记溶液;
3、阴性对照血清，即自检标准液;
4、阳性对照血清，即自检标准液;
5、加速剂。
二、测定步骤1、将阴性对照、阳性对照和样品各100ml分别加入各自的试管中，接着加入125I-抗-HBs(McAb)50ml和加速剂50ml，充分混匀后加入1颗抗-HBs(McAb)包被珠。
2、45℃的水浴中培育15-30分钟。
3、用蒸镏水洗涤包被珠后，将包被包转入测量管，测定各管的放射性计数。
本发明还可用于组装检测乙肝表面抗体(HBsAb)、乙肝E抗原(HBaAg)、乙肝E抗体(HBeAb)和乙肝核心抗体(HBcAb)等试剂盒。
现将用本发明的新方法的测量结果与用现有方法的测量结果比较于下1、特异性对15份阴性标准液作对照测量，无一例阳性，说明符合标准。
S/N值为对标准阴性的对比值，超过2.1为阳性。
2、灵敏度要求测出1ng/ml的含量为符合标准。
3、精密度要求变异系数C.V.＜15%为符合标准，对新老方法在批内各作10个数据现法1346、1102、1403、1501、1356、1347、1402、1293、1357、1421、C.V.＝7.74%新法1012、986、1124、1038、1121、896、1104、1082、925、1210、C.V＝9.26%从以上对比可见，本发明的测量结果与现有方法的测量结果相一致。主要技术指标均符合要求。在检测HBsAg的应用中，与现有技术相比，除了减少标记物的用量外，更为突出的优点有1、简便现有方法的操作为两步，新方法只需1步，减少操作，缩短时间;
2、快捷现有方法要温育两次，共需150分钟，新法只需15分钟，增快10倍;完成整个测定现有方法至少需要3小时，而新法在半小时内可出结果;
3、统一操作步骤，便于实现自动化，即，在应用本发明后，固相放射免疫分析中的夹心法和竞争法等，其操作均可统一为一种模式，这样，既便于操作者又便于实现自动化。
权利要求
1.一种放射性免疫学检测肝炎的方法，包括固相试剂的制备，放射性标记溶液的制备和自检标准液的制备，本发明的特征在于加入一种设法加速液相中分子移动到固液相界面速度的加速剂。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述的加速剂由减小粘度的化学试剂和加速沉淀的化学试剂组成。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于所述的加速剂还包括减小免疫分子在固相表面的非特异吸附的表面活性剂。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于所述的加速剂的配方为(NH4)2SO4∶15%，吐温-20∶0.5%，其余为0.05M，PH7.4的PBS。
5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于所述的加速剂的配方为PEG4-10%，吐温-20∶0.1-1%，其余为0.05M，PH7.4的PBS。
6.根据权利要求3所述的方法，其特征在于所述的加速剂的配方为三氯醋酸∶2-5%，吐温-20∶0.1-1%，其余为0.05M，PH7.4的PBS。
全文摘要
一种检测肝炎病毒等生物活性分子样品的放射性免疫分析方法。为了加速检测试剂中液相分子移动到固液相界面的速度，在包括固相试剂、放射性标记溶液和自检标准液的检测试剂中还加入一种加速剂。加速剂由减小粘度剂、加速沉淀剂和表面活性剂组成。本发明与现有方法相比，能加速免疫结合反应，实现快速检测的目的，由原来的3小时缩短到半小时。本发明可组装实用的检测试剂盒，能检测HBsAg、HBsAb、HBeAg、HBeAb、HBcAb等病毒。
文档编号G01N33/576GK1058273SQ91105699
公开日1992年1月29日 申请日期1991年8月19日 优先权日1991年8月19日
发明者王京 申请人:王京