专利名称：确定光学样品厚度的方法
技术领域：
本发明涉及定量显微光谱学领域，特别涉及一种用于确定光学显微样品的精确厚度的方法。
在科学技术的许多领域，需要确定小样品中化学物质的浓度。定量显微光谱学就是一种确定物质浓度的方法。在这种情况下，通过简单的公式(1)测量与浓度c相联系的光学吸收A(λ,c)，A(λ,c)=a(λ)cz(1)其中，λ是光波长，a(λ)是同波长相关的吸收系数，z是样品的厚度。
确定浓度中的误差通过公式(2)给出dc=(dcdA)dA+(dcda)da+(dcdz)dz---(2)]]>通过使用现代光电子与电子设备，在吸收测量中的误差可以非常低。对于一种给定物质，吸收系数a(λ)可以通过事先使用厚度在1毫米到10毫米范围的大样品加以精确确定。因此，在测量厚度在亚毫米(sub-mm)范围的小样品的浓度c中的误差，主要由在测量样品厚度中的误差决定，并由公式(3)给出dcc=dzz---(3)]]>公式(3)表明，以1％的精确度确定厚度在10微米以内的显微样品中化学物质的浓度，需要以1％的精确度，即以100纳米的精确度，知道样品的厚度。
制作样品厚度的精度达到100纳米的显微样品容器(container)是可能的，但太昂贵了。而且，这种显微样品容器在存储过程中，当超过存储寿命时会变形，或由于样品的装入而变形，很明显，将样品装入容器以后，在使用时确定样品的确切厚度是切实可行的。因此，需要一种方法与装置来精确测定薄光学样品的厚度。
本发明的目的是提供一种方法与装置，用于在对光学样品进行吸收测量或其它光谱测量时，精确确定此样品的厚度。
按照本发明，上面的目的可以通过提供一种样品容器加以实现，它包括第一和第二光学透明窗口，其中，在第一窗口的内表面具有第一种光学标记(marker)，而在第二窗口的内表面具有第二种光学标记，将样品容器装入光学显微镜中，移动样品容器直到第一种光学标记中的一个被分辨出来被定位在视野中，然后移动样品直到第一种光学标记被准确聚焦，记录下第一个聚焦位置，然后移动样品容器直到第二种光学标记中的一个被分辨出来并被定位在视野中，然后移动样品直到第二种光学标记被准确聚焦，记录下第二个聚焦位置，最后，计算第一个和第二个聚焦位置之间的差值，考虑进样品的折射率以后，这个差值可以用于确定样品的厚度。
在本发明的一个最佳实施例中，显微镜装配有图像接收器，它同图像处理器和计算机相连，用以执行图形分辨程序。显微镜样品台同样品台控制器和计算机相连，用于执行自动聚焦过程。利用这种方法，样品厚度确定的全过程可以实现自动进行。为了识别和区分的目的，第一种和第二种光学标记是不同的。将标记做成贯穿整个窗口区域的规则图形是有好处的。许多不同的不标记形状也是可能的，并且也包含在本发明的范围之内。这些标记可以具有有限尺寸，比如正方形和三角形，但也可以具有无限尺寸，比如线，方波或其它波形。除此以外，基于吸收、反射、散射或其它光学效应的不同标记类型都可以被使用，并都包含在本发明的范围中。
图1是按照本发明的显微光谱学装置的示意图；图2是通过显微镜看到的分别在两个窗口上的两种类型的光学标记，这两种标记相互之间设有重叠图3是通过显微镜看到的分别在两个窗口上的两种类型的光学标记，这两种标记相互之间有重叠图4是虚线形式的光学标记；图5是细实线形式的光学标记。
在一个实施例中，本发明的目的在于，当对光学样品进行吸收测量或其它光谱测量时，一种用于精确确定所述样品厚度的方法，包括a)提供样品容器，包括第一和第二光学透明窗口，在第一光学窗口的内表面具有第一种光学标记，而在第二光学窗口的内表面具有第二种光学标记；b)将光学样品装入样品容器；
c)将样品容器装入光学显微镜；d)移动样品容器，直到第一种光学标记中的一个被分辨出来并被定位于视野中，然后移动样品，直到第一种光学标记被准确聚焦，记录下第一个聚焦位置；e)移动样品容器，直到第二种光学标记中的一个被分辨出来并被定位于视野中，然后移动样品，直到第二种光学标记被准确聚焦，记录下第二个聚焦位置；f)计算第一个和第二个聚焦位置之间的差值；以及g)确定光学样品的厚度。
在另一个实施例中，本发明涉及一种，当对光学样品进行吸收测量或其它光谱测量时，用于精确确定所述样品厚度的装置，其中所述装置是一个光学显微镜，包括用于装载样品的装置，其中所述装置具有第一种和第二种光学标记；用于支撑所述装载样品装置的装置；用于对在所述装载样品的装置中的样品进行照明的装置；用于对在所述装载样品的装置中的第一种和第二种光学标记进行自动聚焦的装置；用于对所述光学样品执行图形分辨程序的装置，其中所述装置包括同图像处理器与计算机相连的图像接收器。
如图1中所述，按照本发明，提供了用于装载样品的样品容器1，包括第一光学透明窗口2和第二光学透明窗口3，这两个窗口被壁4所隔开，壁4决定了位于窗口2和3之间的光学样品的厚度。第一光学窗口2的内表面具有第一种光学标记，第二光学窗口3的内表面具有第二种光学标记。
为了识别和区分的目的，第一种和第二种光学标记是不同的，将标记做成贯穿整个窗口区域的规则图形是有好处的。许多不同的标记形状也是可能的并也还包含在本发明的范围内。这些标记可以具有有限尺寸，比如正方形和三角形，但也可以具有无限尺寸，比如线、方波或其它波形。除此以外，基于吸收、反射、散射或其它光学效应的不同标记类型都可以被使用，并都包括在本发明的范围之内。为了产生这些光学标记，可以使用对于半导体工业和微型机械制造来说非常普通的各种技术。
作为一个例子，图2表示通过显微镜100看到的位于样品容器1的两个窗口上的两类光学标记。在这种情况下，圆形标记101位于第一窗口2，方形标记102位于第二窗口3。这两种标记之间没有重叠。
图3表示通过显微镜200看到的位于两个窗口上的两种光学标记，这两种标记之间有重叠。在这种情况下，空心圆201用作第一种标记，填充方块202用作第二种标记。这使我们可以设计一种软件，甚至在两种标记重叠在一起时也能将它们区分开来。
图4表示通过显微镜300看到的虚线形式的光学标记。沿“东-西”方向的线301位于样品容器1的第一窗口2，沿“南-北”方向的线302位于样品容器1的第二窗口3。
图5表示通过显微镜400看到的实线形式的光学标记。沿“东-西”方向的线401位于样品容器1的第一窗口2，沿“南-北”方向的线402位于样品容器1的第二窗口3。
如图1所示，样品容器1装在光学显微镜8的样品台5上。样品台5由系统计算机7通过样品台控制器单元6在X、Y和Z三个方向加以控制。在图1中建立了X、Y、Z方向。在显微镜领域中，Z方向总是表示在垂直方向的运动。为了在样品中进行吸收测量，显微镜8装配有光源9。当使用吸收式或散射式标记的时候，也同样可以使用此光源。样品溶器1中的样品也可以使用第二个光源10以及分束器11的装配方式(epi configuration)所照明。光源10在使用反射式标记时也是可用的。
按照本发明的装置的最佳实施例也包括图像接收器12，比如电荷耦合器件(CCD照相机)，它同图像处理器13和系统计算机7相连。图像接收器12、图像处理器13、计算机7、以及样品台控制器6的功能组使得我们在将样品装入样品台5后，可以运行一个图形分辨率程序。在一个特定的标记被分辨出来以后，这个功能组还使得我们可以运行一个自动聚焦程序。
在操作过程中，光学样品被装入样品容器1中。然后，位于样品台5上的样品容器1在样品台控制器6的控制下在X和Y方向运动，直到第一种光学标记中的一个被分辨出来并被定位于视野中，最好靠近中心。接下来，连接于样品台5的样品容器1沿Z方向运动，直到第一种光学标记被准确聚焦。这些完成以后，在计算机中记录下第一个聚焦位置。然后，样品容器1在样品台控制器6的控制下在X和Y方向运动，直到第二种光学标记中的一个被分辨出来并被定位于视野中，最好靠近中心。样品容器1在样品台控制器6的控制下再次运动，直到第二种光学标记被准确聚焦，然后记录下第二个聚焦位置。
最后，计算第一个和第二个聚焦位置之间的差值。在考虑进样品的光学折射率之后，这个值就可以被用来确定样品的厚度。在大部分实际情况下，样品浓度对于光学折射率的影响可以忽略。
按照本发明，将标记沉积(deposition)、通过图形辨认(recognition)的标记识别、以及对于两种光标记的自动聚焦步骤结合起来，就提供了一种将样品厚度确定过程自动化的方法。此外，本方法使得可以在与对又薄又小的样品进行吸收测量的区域几乎相同的区域确定样品厚度。因此，可以执行精确的浓度测量。例如，初步可行性实验表明。原度为200微米的液体的厚度可以在±0.05微米的精度被确定。
按照本发明的方法和装置可用来确定液体样品，以及胶状样品、气体或雾状样品的厚度。但是，按照本发明的方法和装置并不仅局限于这样的样品。
本发明的方法和装置也可以用于具有最少2个或2个以上抛光表面的固体光学表明样品。在本发明的这个方面，不需要样品容器，因为固体样品可以直接附着(atrach)或放置在显微镜的载玻片上。同样，光学标记被直接沉积在所感兴趣的两个或两个以上样品表面上。因此，本发明的这个方面特别涉及一种，当对透明固体光学样品进行吸收测量或其它光谱测量时，用于精确确定样品厚度的方法，包括a)提供显微镜玻片；b)将透明固体光学样品放置在载玻片上，此样品具有第一表面和第二表面，第一表面具有第一种光学标记，第二表面具有第二种光学标记；c)将显微镜载玻片装入光学显微镜；d)移动显微镜载玻片，直到第一种光学标记中的一个被分辨出来并被定位于视野中，然后移动样品，直到第一种光学标记被准确聚焦，记录下第一个聚焦位置；e)移动显微镜载玻片，直到第二种光学标记中的一个被分辨出来并被定位于视野中，移动样品，直到第二种光学标记被准确聚焦，记录下第二个聚焦位置；f)计算第一个和第二个聚焦位置之间的差值；
g)确定固体光学样品的厚度。
因此，使用按照本发明的方法，不仅可以以高精度确定绝对样品厚度，而且可以确定样品表面的平行度如何。无论测量液体、胶状、气体或固体样品，只要在显微镜中使用适当的物镜透镜，就没有对样品厚度的限制。
在本发明的一个实施例中，描述了计算机控制的样品台和样品的移动。但是，人工在X、Y和Z方向移动样品，并且对所发现的光学样品种类以及聚焦位置进行视觉观察，同样包含在本发明的精神中。
权利要求
1．一种在对光学样品进行吸收测量或其它光谱测量时，用于精确确定所述样品厚度的方法，包括a)提供包含有第一和第二光学透明窗口的样品容器，第一窗口的内表面具有第一种光学标记，第二窗口的内表面具有第二种光学标记；b)将光学样品装入样品容器中；c)将样品容器装入光学显微镜中；d)移动样品容器，直到第一种光学标记中的一个被分辨出来并被定位于视野中，移动样品，直到第一种光学标记被准确聚焦，记录下第一个聚焦位置；e)移动样品容器，直到第二种光学标记中的一个被分辨出来并被定位于视野中，移动样品，直到第二种光学标记被准确聚焦，记录下第二个聚焦位置；f)计算第一个和第二个聚焦位置之间的差值；以及g)确定光学样品的厚度。
2．按照权利要求1的方法，在所述样品容器中，所述第一种光学标记均匀分布于第一窗口的整个区域，所述第二种光学标记均匀分布于第二窗口的整个区域。
3．按照权利要求1的方法，其中所述样品为液体样品。
4．按照权利要求1的方法，其中所述样品为胶体样品。
5．按照权利要求1的方法，其中所述样品为气体或雾状样品。
6．一种在对透明固体光学样品进行吸收测量或其它光谱测量时，用于精确确定所述样品厚度的方法，包括a)提供显微镜玻片；b)将具有第一表面和第二表面的透明固体光学样品放在载玻片上，第一表面具有第一种光学标记，第二表面具有第二种光学标记；c)将显微镜载玻片装入光学显微镜中；d)移动显微镜载玻片，直到第一种光学标记中的一个被分辨出来并被定位于视野中，移动样品，直到第一种光学标记被准确聚焦，记录下第一个聚焦位置；e)移动显微镜载玻片，直到第二种光学标记中的一个被分辨出来并被定位于视野中，移动样品，直到第二种光学标记被准确聚焦，记录下第二个聚焦位置；f)计算第一个和第二个聚焦位置之间的差值；以及g)确定固体光学样品的厚度。
7．按照权利要求6的方法，其中在所述固体样品中，所述第一种光学标记均匀分布在固体样品的第一表面，所述和二种光学标记均匀分布在固体样品的第二表面。
全文摘要
本发明涉及确定光学显微样品厚度的方法,包括步骤:提供一种包括第一和第二光学透明窗口的样品容器,其中第一窗口和第二窗口的内表面分别具有第一和第二光学标记;将样品容器装入光学显微镜;移动样品容器直到第一光学标记中的一个被分辨出来并定位在视野中,然后移动样品直到第一光学标记被准确聚焦,记录第一个聚焦位置;执行同样过程,记录下第二个聚焦位置;计算第一和第二聚焦位置之间差值,以确定样品的厚度。
文档编号G01B11/06GK1210970SQ98116790
公开日1999年3月17日 申请日期1998年8月3日 优先权日1997年8月29日
发明者克劳斯·W·伯恩特 申请人:贝克顿迪金森公司