专利名称：血液学细胞三分类全血质控物的研制的制作方法
一、现有技术状况存在哪些缺点？血液细胞以白细胞三分类为特征的全血质控物是一种生物制品试剂，是用于医学临床检验检测患者血细胞技术方法上的质量控制标准物，是对在日常检验工作中的所用试剂、操作技术、仪器性能进行质量监测之用品。当我国医学科技与世界卫生组织(WHO)接轨全面实行检验技术质量控制以及引进现代化高科技自动化分析仪以来，其配套的全血质控物都是购买进口品，由于价格昂贵，国内有关科技人员进行了单质成分(分别有白细胞(WBC)、血小板(PLT)、血红蛋白(Hb))的研究和产品投入市场，但监测的只有三项，用途的局限性很大，后来虽有全血质控物(如四川成都通广公司以人血为原料)在市场上出售，但制品质量差，如白细胞直方图形(Histogram)蹋凹、与计数不同步、红细胞平均体积(MCV)极不稳定等缺点，实际应用不能起到质量监控作用。直至目前国内尚未见公开报导全血质控物制作方法及符合质量标准的全血质控物面市。我们采用国际上通用的美国库尔特4C(Coulter-4C)、雅培(ABBOTT-3C)、伯—乐(Bro-Rad-3C)标准全血质控物进行模拟研制，终于取得成功，其制品还有其自身特点。
二、技术配方、生产工艺和优点。
(一)技术配方1、抗凝剂①3.8％枸椽酸钠，②10％EDTA-Na22、PH7.2 0.15mmol/L磷酸盐缓冲液(含氯化钠)。
3、基础液-W在磷酸盐缓冲液内加一定量栒椽酸钠、葡萄糖等。
4、基础液-R含磷酸盐、枸椽酸钠、氯化钠、氯化钾、葡萄糖、ADP、甘露醇、尿素、氟化钠等，PH7.2、mosm340-360。
5、基础液-P含枸椽酸钠、EDTA-Na2、氯化钠、磷缓液等。
试剂2至5按升容量配制，加适量NaN3并进行灭菌处理。
6、固定(半固定)液用戊二醛配成不同含量的适合于假WBC、RBC和PLT的磷酸盐缓冲液。
7、参考全血质控物美国产品库尔特-4C(Coulter Hemato-ctrl4c-plus)；伯-乐(Bio-Rad)和雅培(ABBOTT)-3C(Hemato-ctrl3c-level)全血质控物。
8、原材料禽血，蹄科动物血，人血。
(二)生产工艺A、单质细胞成分制备1、假白细胞(有核红血球)(1)取材无菌操作宰杀，取禽血用3.8％枸椽酸钠抗凝，混匀。
(2)洗涤离心去血浆，除掉PLT和WBC，再用倍量基础液-W离心洗一次，压积成份为有核RBC即假白细胞，适当稀释成悬液。
(3)固定用特定的渗量缓冲液配适宜浓度的戊二醛固定液，按压积细胞与固定液1∶5混匀，振摇2小时，作溶血试验，完全无溶血现象即可。用过量基础液-W离心洗涤2次，并用该液稀释贮存备用，放4至8℃冰箱(有效期一年)。
2、纯红细胞(RBC)制备(1)取材正常人的鲜血(ACD抗凝)(2)纯分①离心除去部分血浆、WBC和PLT；②加基础液-R离心洗1次；③压积RBC适当稀释成悬液，加适宜浓度高分子试剂溶液静置或离心，吸去上层液体，可除去绝大多数WBC和PLT；④用基础液-R离心洗数次，试测RBC悬液，当WBC＜0.5G/RBC 4T/L±，表明纯分效果良好。
(3)护膜(半固定)用基础液-R配成适宜浓度的戊二醛半固定液倍量混合，振摇2小时并放置过夜，基础液洗涤1次，并适当稀释在4至8℃贮存备用(有效期半年)。
3、纯血小板(PLT)制备(1)取材用10％EDTA-Na2盛于无菌容器，临宰动物时收集中段血液，抗凝剂与血约1∶5。
(2)将采集血分瓶，分别加适量基础液-P，离心取富PLT血浆，仪器上试测，当WBC＜0.3G/L为好。
(3)固定用基础液-P配成适宜浓度的戊二醛固定液倍量与富PLT浆混合，振摇2小时并放置过夜，然后用基础液-P离心洗涤1至2次，用该液稀释贮存备用，4至8℃保存(有效期大于半年)。
B、全血质控物制备(1)先行检测各单质物的项目参数。
(2)根据质控需要配成多种类型的全血质控物，如以WBC、RBC、PLT计数项目配高、中、低值；或者以突出三分类的中介群细胞比例为主；或者突出MCV不同参数；或者兼而有之等等。
(3)组配时根据细胞在单位容积内所含浓度的关系进行计算，配成各项目相应的参数值，再在仪器上进行测定，统计处理确定X±S、CV。
(4)无菌操作分装(事先加入抗生素或认为理想的抑菌剂)后，批内抽样在35℃孵育48小时，观察有无细菌生长。有效期以RBC保存效果为准，定为半年。
(5)用作标准的全血质控物，应在最佳条件下，在性能可靠的仪器上，以多个分装瓶的制品，进行多次重复测定，再确定靶值和允许变化范围。
(三)本法质控物的优点1、本文方法WBC代用品能客观反映淋巴细胞群的直方图在50至100fl；160至380fl之间为粒细胞群直方图形，峰突200fl左右；100至160fl间形成一峰谷，为中介细胞群。三群细胞直方图在坐标上分布与其分类比例非常对称，见附图
。直方图与分类比例在仪器上同步显示是全血质控物制作的前提。由于人WBC在体外保存时容易退化变性，国外早已淘汰用人WBC作质控物。
2、本法全血质控物的PLT采用蹄科动物血液，这又有别于国外制品采用人工乳胶微粒，使制品来源广阔易获。
3、本法制品能广泛适用于不同国家品牌的三分类(含二分类)自动分析仪之用。
三、实施方案的实验报告(一)实验研究结果
1、本文全血质控物与进口参考品18个项目参数测定情况比较见表1。表1说明本制品与三家参考品全套项目测定参数其重复性相符，精密度均高，它们的变异系数(CV％)明显低于5％，均符合国际标准(≤5％)。检测结果表明，本品与同类进口质控品质量相符。
表1本全血质控物与进口参考品18项目测定情况比较(仪器Cell-DyN1700)
表注符号“#”表示绝对值。因来源原因，参考品中或缺低值，或缺高值对照。
2、验证检测分送本法制品给具备有不同品牌自动(半自动)细胞分析仪的单位常规条件检测，情况见表2本法制品侧重应用在以WBC三和二分类为特点的Cell-DyN系列仪器上检测，其三系细胞各项目参数与直方图象均规则匹配，结果满意；其次，在库尔特-JT三分类仪上检测，图象显示了三分类区间，但没显示数值，可能与仪器设计原理有关，而RBC和PLT项目的参数和图象对应关系很好；另外，在日本东亚Sysmex-K4500三分类仪上检测，其参数和图象均能对应匹配(据介绍该类仪器质控检测功能已被电脑程序锁定)。由于各实验室使用的溶血剂在渗透压和溶血力度上有较大差异，对WBC亚群分类有一定影响，这是值得注意调控的。
表2本法全血质控物在不同品牌仪器上检测情况比较(制品号980315C)
注①仪器提供；湖北省人民医院，同济医科大学附二医院，省财贸医院。②表列数据出自验证检测单位证明材料(二)讨论1、全血质控物制作构想设计上要求从国情实际出发，采用来源为易获的替代材料，细胞分析仪采用国际通用的电阻抗型检测的18个项目以WBC三分类为标志。研究本着实践—理论—实践的原则首先对进口参考品进行成份分析，知悉除RBC外，WBC和PLT是用禽类血和乳胶颗粒分别代替，其代替物性状用于电脑编程(软件)仿真细胞特征检测参数的效果令人满意。其二、在受此启发下，以细胞生物学特性为线索发现国内禽类血和蹄科动物血成份经技术处理能达到与进口品同样的仿真效果。其三、通过长期形态学观察和仪器检测各项目指标相互印证，从而达到制作设计目的。见前述系列图、表数据资料。
2、关于制作技术问题全血质控物制品由于商业等原因(属于技术专利)没有现成制备方法可循，只有运用细胞生物、生理和生化基本原理具体结合实验解决实际问题。制备WBC成份既要三分类比例恰当，又要求直方图(Histogram)同步显示，其细胞亚群(分类)比例的制备难度大，而这一环节也是全血质控物制作成败的关键。制备RBC其中MCV指标稳定性取决于微妙的护膜强度，处理过程中与各环节的渗透量调控关系密切。国内单质物PLT为国产乳胶小粒，当用作全血配制时，却严重干扰WBC直方图构成，本品选用蹄科动物PLT代替人PLT，主要解决聚集粘连且稳定性好。
本制品使用的试剂各成份都有其特定用途如无机盐类主要用于维持渗透量，葡萄糖除维持渗透量外与ADP有助于RBC保持个体体积不致改变所需能量，甘露醇有一定的抗溶血作用，尿素有利于渗量和PH值、氟化钠可防止糖酵解产生酸性物质，还具有防腐作用等。经许多次的优选配方，现已成功形成系列试剂。
3、从理论上而言，检验标本对象是人，本应采用人血成份的质控物制品。作者曾试制并长期观测(包括他人的制品)人全血质控物性状，发现主要是人WBC形态结构极不稳定，难以保持原态，人鲜血4小时后仪测WBC的直方图和分类即有明显改变，多为中介细胞群增高，粒细胞群左移。当对人鲜血立即固定处理后，可以在一个月左右保持其分类与直方图同步显示，往后直方图形很不规则直至下限呈平坦或低凹抛物线(在雅培CD系列仪器上)。镜下观察各类WBC蒌缩、核固缩、胞膜不全等退化性变。这些变化是因为人WBC膜薄，胞浆相对量多，核分叶、核染色质不均等，即使再固定处理也难保持形态不变。代替物有核RBC，不具有人WBC形态结构特点，胞膜相对较厚，核无分叶，染色质均匀细致，核轴较一致其直径不悬殊，经固定处理细胞原态长期不变，这一替代物制作方法是生物模拟技术应用的体现，又符合库尔特原理。
4、自五十年代库尔特发现血细胞的非传导性在电解质溶液中悬浮着的颗粒通过计数小孔引起电阻变化，从而可进行计数和体积测定，称作库尔特原理(专利技术)。根据这一原理后来制造出血细胞计数仪，它由简单的二参数功能不断发展成现今达二十多参数功能的仪器。目前国内外以电阻抗型仪器检测WBC三分类为特点全套18个项目参数最为实用和普遍。优点是三分类亚群细胞图形间距大、醒目，便于成份分析和异常细胞的筛选。近年来仪器设计中加进了高频电导，激光散射技术，检测功能有所增加，可达到WBC五分类(未完全过关)，但价格昂贵，我们选定研制三分类质控物的目的是基于项目完善，实用和普及，以利全面开展血液质控技术。
全血质控物项目参数的定值(靶值、参考值)，目前国际上尚无统一规定，依各家所喜或为了有所区别，制品的各项目高中低值有较大差别，直方图在不同厂家的仪器上也有所不同。但制品质量标准其项目测定值都统一在变异系数≤5％，各类血细胞在仪器上图象显示既同步又规范。本法制品达到此要求。
5、本制品模拟国外权威性制品制作，严格遵循国际指标标准，经近两年来的实验研究，质量达到国外同类产品水平。
权利要求
本研究是在无现成技术资料情况下，采取对进口制品进行成份分析，然后运用细胞生物、生理和生化学基本原理，本着实践—理论—实践的研究原则，独立建立了一整套全新的制备方法。其制备样本的系列测定和临床实际应用，结果与国际参考品比较以白细胞三分类为标志的血液18个项目的测定参数的精密度、准确度均相符。①试剂配方成份组成；②配制全血质控物成份的禽类血有核红细胞组成(代替的细胞成份)；③蹄科动物血小板代替人血小板；④本法制品白细胞三分类特征是淋巴细胞群直方图在50至100飞升(fl)；160飞升至380飞升之间为粒细胞群直方图形，峰突200飞升左右；100至160飞升间形成一峰谷，为中介细胞群(即单核、嗜酸性和幼稚细胞等)，三群细胞直方图在坐标上分布与其分类比例值对称(在三分类细胞分析仪上)。权利保护关键主要表现在全血质控物在仪器上检测时(以Cell-DyN1700为例)在电脑光屏上呈现的白细胞三分类扫描图象。
全文摘要
血液细胞学三分类全血质控物是一种生物制品试剂,是用于医学临床检验检测血液细胞技术方法上的对使用的试剂、技术操作、仪器性能进行全过程质量监控的标准物品。本申请的制品研制成果是独自建立的全新方法。参考标准品采用国际通用的美国库尔特4C、雅信3C、伯乐3C全血质控物,在同等条件下对比测定结果表明;全血18个项目的参数其精密度、准确度相符;其细胞分布所示的直方图和项目比例值在坐标上都均匀对称。实践证明,该制品达到国际先进水平。另外,该制品的制作原材料,立足于国情,来源易获。
文档编号G01N33/48GK1263266SQ99116350
公开日2000年8月16日 申请日期1999年2月8日 优先权日1999年2月8日
发明者刘剑雄, 宋功成 申请人:刘剑雄, 宋功成