改进的侧流分析的制作方法

专利名称：改进的侧流分析的制作方法
技术领域：
本发明涉及侧流分析，更具体地本发明涉及改进的侧流分析，其中分析物结合剂偶联于检测剂和分析物非特异性试剂。
对流体样品，尤其是体液样品中的细胞和分析物进行定量分析，通常会为医生和病人提供关键的诊断和治疗信息。例如，利用了抗原-抗体反应高特异性的免疫测试方法，就提供了一种测量分析物的方法(Kennedy，D.M.和S.J.Challacombe(编)，酶联免疫吸附测定和其他固相免疫测定理论和实践(ELISAand Other Solid Phase ImmunoassaysTheoretical and Practical Aspects)，John Wiley and Sons，Chichester(1988)。该文献与本文提及的其他文献都被引用作为参考，就如同它们被完全复制那样。这些分析方法也可用于其他应用方面，例如兽医、食品测试或农业应用方面。
可提供样品中分析物的定量测量值的免疫测定方法，早已使用只有在实验室环境下才有的昂贵分析仪而且所用的程序复杂且步骤多。
免疫色谱分析，例如在下列文献中所描述的免疫色谱分析是较简单的，但是不能提供分析物的定量测量值英国2,204,398A；美国专利No.5,096,837、5,238,652和5,266,497；Birnbaum，S.等人，分析生物化学(AnalyticalBiochem.)，206168-171(1992)；Roberts，M.A.和R.A.Durst，分析化学(Analytical Chem.)67482-491(1995)；和Klimov，A.D.等人，临床化学(Clinical Chem.)411360(1995)。相反，这些免疫色谱分析检测是否有高于界定的测试截止水平(cutoff level)的分析物。无法进行定量测定限制了这些分析方法的用途。
Cathy等人在美国专利No.5,660,993中公开了一种一次性的诊断测试装置及其用法。该装置包括一个与至少一个主通道液体相通的加样孔。在液体流动方向上，主通道包括一个与孵育区和废物区液体相通的主试剂区。与主通道液体相通的是至少一个侧向试剂通道。在液体流动方向上，侧向试剂通道含有液体添加孔和侧向试剂区，它们在主通道的孵育区上游某处与主通道液体相通。搅拌装置可被包括在至少一个主的和侧向的试剂区和/或孵育区。毛细阀可位于孵育区上游沿着主试剂通道和侧试剂通道的不同位置，以便控制液体在装置中的流动。这种装置机械结构复杂，因此不适合重复而精确的用途。
Palace等人在国际出版号WO92/12428中公开了一种非滤纸的单步式侧流分析的设计，它使用侧流测试片来分析生物样品中的分析物。在所公开的装置中，采用了三个处于非滤纸式侧流接触的区域样品接受区、标记区和捕获区。含分析物的样品被携带通过标记区，与具有可视分子的分析标记物反应，该分析标记物宜为颗粒并且这些颗粒偶联于对分析物特异的结合剂或者偶联于可与分析物竞争捕获剂的竞争剂。样品和某些可视分子一起继续流动进入捕获区，其中被分析物或竞争剂就被偶联于或捕获于可视分子。过量液体被吸入与捕获区接触的吸收区。可视分子在捕获区显现，就获得了阳性结果。包含可视分子的对照标记物(较佳地可与分析标记物在颜色上区分开)也可被包括在标记区，并且在捕获区单独的对照区域被捕获以证实液体流动是如预计的那样。然而，对照标记物不能修正侧流测试片之间的差异，从而导致测量值的不准确和不一致。对照剂流过捕获区的对照区域这一证据，并不能证明分析的标记部分流过了捕获区的分析物特异性区域。
Eisinger等人的美国专利No.4,943,522公开了一种进行特异性结合配对测定(例如免疫测定)的方法和装置。一种允许非滤纸式侧流的多孔膜被用作分析基质；结合配对的一员被固定在基质上划定的指示区。样品被加在远离指示区的某处，并侧流通过指示区；样品中的任何分析物被固定化的特异性结合成员所结合，并被检测出。然而，这种分析没有任何对照，这会导致测试不准确和产生差错。
Campbell等人的美国专利No.4,703,017公开了一种测试分析物的固相分析法，其中结合剂被负载在固相载体(例如硝酸纤维素)上，而示踪物包括用有色颗粒标记物(如包含了染料的脂质体)标记的配体。该分析的灵敏度高，而且示踪物在分析条件下可在载体上显现出，因此示踪物在测定时就被显现出，而不需要测量仪器也不需要进一步处理。然而，因为无测量仪器，因此人的主观因素被引入分析，导致不准确和产生差错。
Campbell等人的美国专利No.4,743,560公开了一种测试分析物的固相分析法，其中结合剂被负载在固相载体(例如硝酸纤维素)上，而示踪物包括用颗粒标记物(如脂质体)标记的配体，其中包括不直观的可检测标记物。然而，该分析方法没有对照，因此会导致测试不准确和产生差错。
Brooks的美国专利No.5,753,517公开了使用定量免疫测定来测量液体样品中感兴趣分析物的数量的方法，以及用于该测定方法的设备。该测定采用了“快速抗原测量平台”(rapid antigen measurement platform，RAMP)设备。该设备包括一膜片，该膜片是用诸如硝酸纤维素和玻璃纤维之类的材料制成的，有足够的孔隙度且能够被含分析物的液体所润湿，而且允许颗粒通过毛细作用移动。
所公开的膜片具有加样点、接触区和检测区；接触区位于加样点和检测区之间。包埋在接触区的是许多颗粒，例如胶体金颗粒、有机分子、脂质体或有机聚合物乳胶颗粒。颗粒上涂有针对感兴趣分析物的抗体。颗粒可用比色标记物、荧光标记物、发光标记物或其他合适标记物标记以便于检测。检测剂被固定在检测区。检测剂可以是针对感兴趣分析物的抗体、或是感兴趣的分析物本身。该装置还可包括一个或多个下列特征位于加样点之上并覆盖住加样点的加样垫片；位于接触区之上并覆盖住接触区的接触垫片，接触垫片中可包埋有涂着抗体的颗粒。如果有接触垫片，则如公开的那样存在一隔离垫片，并且该隔离垫片位于膜上且位于接触区和接触垫片之间。还公开了毛细垫片，它位于膜上且靠近接触区，使得接触区位于毛细垫片和接触区之间；还公开了内部对照，它包括包埋在接触区的内部对照颗粒、对照检测剂和对照反应区。
该设备包括了内部对照，以便如公开地那样补偿各次测试之间在膜性能方面的差异。该内部对照包括内部对照颗粒、对照检测剂和对照反应区。所公开的内部对照颗粒与涂有抗体的颗粒被一起包埋在接触区。
这种“内部对照颗粒”与涂有抗体的颗粒相类似。如公开的那样，它们涂有相同表面浓度的抗体，不同点在于内部对照颗粒上的抗体是针对对照检测剂的，而该对照检测剂不与针对分析物的抗体反应。所公开的“对照检测剂”是一种不与待测量的分析物、位于涂有抗体的颗粒上的抗体反应，也不与检测剂反应的试剂。对照检测剂被涂在膜上的“对照反应区”。如所公开的那样，对照反应区指膜片上固定有对照检测剂的位点。然而，因为对照和分析物检测剂在本质上是独立的，因此对照移动通过测量基质并不能证明模拟了分析物检测剂的移动。因此，通过测量各测量装置中对照和分析物检测剂的相对反应，会发现这些对照剂在所设计的补偿测试间差异的方法中起的作用很差。
因此，需要有针对上述问题的侧流免疫测定和使用这些测定的方法。
在一方面，本发明涉及一种进行侧流分析(或侧流测定)的方法，它包括让感兴趣的分析物与第一分析物结合剂接触，其中第一分析物结合剂和分析物非特异性试剂被偶联于检测剂。
在另一方面，本发明涉及一种在包括测试片的侧流分析中提高测试平均阳性结果和测试平均阴性结果之间差异的方法，它包括在空间上重新排列测试片上一个或多个对照结合区相对于分析物结合区的位置。
在另一方面，本发明涉及一种在包括测试片的侧流分析中降低侧流分析的变差系数的方法，它包括在空间上重新排列测试片上一个或多个对照结合区相对于分析物结合区的位置。
在另一方面，本发明涉及一种在侧流分析中提高侧流分析重复性的方法，它包括定量位于第一对照区中的第一数量的检测剂；定量位于第二对照区中的第二数量的检测剂；将定量的第一和第二数量的检测剂映射到相对标尺上，得到检测剂的第一相对数量和第二相对数量；以及所进行的映射使得定量的第一数量检测剂与第二数量检测剂之比大于第一相对数量检测剂与第二相对数量检测剂之比。
在一个方面，本发明涉及一种包括测试片的侧流分析，该测试片包括偶联于检测剂的分析物结合剂和分析物非特异性试剂。


图1是本发明一种侧流测试片的剖面图。
如本文所用，术语“分析物”指待定量测定的分子或化合物。分析物的例子包括蛋白质，如激素或其他分泌蛋白质、酶和细胞表面蛋白；糖蛋白；肽；小分子；多糖；抗体(包括单克隆抗体或多克隆抗体及其片段)；核酸；药物；毒素；病毒或病毒颗粒；细胞壁组份；或其他具有表位的化合物。感兴趣的分析物宜具有免疫原性部分，这意味着可产生针对感兴趣分析物该部分的抗体(如下所述)。
为了进行本发明的侧流分析，可使用侧流测试片。图1描述了本发明的一种测试片例子。测试片100包括背衬片102、膜片104、隔离垫片106、偶联物垫片108、测试区110、低对照区112、高对照区114、吸收垫片116和保护性盖片118。测试片100具有远端和近端。合适的测试片式样的例子包括可从ScrippsLaboratories获得的Scripps Laboratories牌侧流免疫测定开发系统。
安装在背衬片102中央的是膜片104。位于膜片104远端且与膜片104有少许重叠的是偶联物垫片108。在背衬片102上位于偶联物垫片108远端且与偶联物垫片108几乎完全重叠的是隔离垫片106。吸收垫片116也位于背衬片102上，吸收垫片116与膜片104接触且位于膜片104的近端。保护性盖片118复合于隔离垫片106、膜片104和吸收垫片116，且与背衬片102相对。
背衬片102可以由稳定的、无孔的材料制成，其强度应足以支承材料和粘于其的测试片。通常，背衬片102基本上不透水。在一个优选例中，背衬片102是用聚合物膜制成的，更佳地是用聚氯乙烯膜制成的。
测试片100还含有吸收垫片116。吸收垫片包含吸收材料，它可吸收因毛细管作用而输送至膜片104末端的溶液。适用作为吸收垫片的材料例子包括纤维素和玻璃纤维。
保护性盖片118复合于膜片104且与背衬片102相对。保护性盖片118保护或覆盖着膜片104、偶联物垫片108、吸收垫片116和非必要的隔离垫片106。保护性盖片118可用总体不透水的材料制成，而且较佳地是半透明或透明的。保护性盖片可以是单层或多层。用作保护性盖片118的优选材料包括透光材料，例如聚酰胺、聚酯、聚乙烯、丙烯酸类材料、玻璃或类似的材料。保护性盖片118可以是透明或不透明的，这取决于所用的检测方法。在一个优选例中，保护性盖片是透光透明的聚酯。
膜片可以用具有如下特性的材料制成有足够孔隙度从而允许在材料表面和内部发生流体的毛细管作用；允许涂有抗体或抗原的颗粒通过毛细管作用而移动(即宜不阻碍颗粒)；可被含分析物的液体所润湿(例如，对于水性液体具有亲水性，对于有机溶剂具有疏水性)。通过例如在美国专利No.4,340,482或No.4,618,533中所述的方法(这些方法描述了将疏水表面转变成亲水表面)，可以改变膜的疏水性从而使膜具有亲水性以便用于水性液体。膜材料的例子包括纤维素、硝酸纤维素、乙酸纤维素、玻璃纤维、尼龙、聚电解质离子交换膜、丙烯共聚物/尼龙、和聚醚砜(polyethersulfone)。在一个优选例中，膜片是用硝酸纤维素制成的。
隔离垫片106可以由吸收材料制成，它能够在将液体样品加至隔离垫片106时，将液体样品输送至偶联物垫片108。优选的材料包括(但并不限于)纤维素、硝酸纤维素、乙酸纤维素、玻璃纤维、尼龙、聚电解质离子交换膜、丙烯共聚物/尼龙、和聚醚砜。
偶联物垫片108与隔离垫片106相复合。偶联物垫片108可以用吸收材料制成。代表性的材料包括纤维素、硝酸纤维素、乙酸纤维素、玻璃纤维、尼龙、聚电解质离子交换膜、丙烯共聚物/尼龙、和聚醚砜。
偶联物垫片含有一群结合于检测剂的第一分析物结合剂和分析物非特异性试剂。在另一例子中，这群试剂也可排他地或非排他地位于测试片上。分析物非特异性试剂被定义为对感兴趣分析物不特异的试剂。第一分析物结合剂是可特异性地结合于感兴趣分析物的试剂。在测试片上可以存在一群以上的结合于检测剂的第一分析物结合剂和分析物非特异性试剂。这些群体可以在组成、位置或其他特性方面相同或不同。
在一个优选例中，第一分析物结合剂是针对感兴趣分析物的抗体。在另一优选例中，如果感兴趣分析物是具有已知特异性的抗体，那么该群体可以含有该分析物(抗体)所针对的抗原。抗体可以是单克隆抗体或多克隆抗体。如本文所用，术语“抗体”也指足以结合于感兴趣分析物的抗体片段。
或者，在优选例中还可使用各种可特异性地结合于感兴趣分析物的分子，例如工程化蛋白、肽、半抗原、或含有抗原(该抗原具有分析物结合位点)的异源混合物的裂解物。P.Holliger等人，Trends in Biotechnology 137-9(1995)；S.M.Chamow等人，Trends in Biotechnology 1452-60(1996)。在另一优选例中，如果感兴趣分析物是配体，那么可使用结合于该配体的受体，反之亦然。
第一分析物结合剂和分析物非特异性试剂被偶联于检测剂。检测剂包括各种不同物质，只要它便于检测与检测剂相结合的第一分析物结合剂。合适的检测剂包括颗粒、发光标记物；比色标记物、荧光标记物；化学标记物；酶；放射性标记物；或射频标记物；金属胶体；和化学发光标记物。
在一优选例中，至少一种第一分析物结合剂和至少一种分析物非特异性试剂被偶联于一种单一检测剂。这种例子包括与至少一种第一分析物结合剂和至少一种分析物非特异性试剂偶联的一群单一的检测剂分子。如下所述，这种例子可降低非特异性结合并且能够修正某些类型的测试差异。
如果使用不同种类的偶联于检测剂的第一分析物结合剂和分析物非特异性试剂，那么可以使用不同的检测剂。例如需要在同一测试片上分析两种不同的有关分析物时，就会产生这种情况。使用两种不同检测剂有利于检测两种不同的有关分析物。例如，当检测剂是荧光剂时，可以选择检测剂使其在不同的波长下发荧光。
在一个优选例中，可检测标记物是颗粒。可用于本发明的颗粒例子包括(但并不限于)胶体金颗粒；胶体硫颗粒；胶体硒颗粒；胶体硫酸钡颗粒；胶体硫酸铁颗粒；金属碘酸盐颗粒；卤化银颗粒；二氧化硅颗粒；胶体(水合)金属氧化物颗粒；胶体金属硫化物颗粒；胶体硒化铅颗粒；胶体硒化镉颗粒；胶体金属磷酸盐颗粒；胶体金属铁酸盐颗粒；涂有有机或无机层的上述任一种胶体颗粒；蛋白质或肽分子；脂质体；或有机聚合物乳胶颗粒，例如聚苯乙烯乳胶珠。优选的颗粒是胶体金颗粒。颗粒大小与膜片的孔隙度有关颗粒宜足够小，从而能因液体的毛细管作用而在膜中被运输。
胶体金颗粒可用任何常规方法制造，例如总结于G.Frens，1973，NaturePhysical Science，24120(1973)中的方法。其他方法描述于美国专利No.5,578,577、5,141,850、4,775,636、4,853,335、4,859,612、5,079,172、5,202,267、5,514,602、5,616,467、5,681,775。
颗粒大小的选择会影响一些因素，例如总溶胶试剂及其偶联物物的稳定性、偶联物垫片108释放颗粒的效率和充分性、反应的速度和充分性。此外，颗粒表面积会影响结合分子之间的空间位阻。
颗粒可以被标记，以协助检测。标记物的例子包括(但并不限于)发光标记物；比色标记物如染料；荧光标记物；或化学标记物，如电活性剂(electroactiveagents)(如亚铁氰化物)；酶；放射性标记物；或射频标记物。
存在于测试片上的颗粒数目可以改变，这取决于颗粒的大小和组成、测试片和膜片的构成成分、以及分析测试的灵敏度水平。颗粒数目的范围通常约为1×109-1×1013个颗粒，尽管也可使用低于1×109个颗粒。在一个优选例中，颗粒数目约为1×1011个颗粒。
还偶联于检测剂的是分析物非特异性试剂。可根据结合于除感兴趣分析物之外的其他物质的稳定性，来选择分析物非特异性试剂。例如，如果感兴趣分析物是抗H.Pylori的抗体，那么分析物非特异性试剂可以是针对在抗H.Pylori抗体中没有或罕有的抗原的抗体。这种结合对于除感兴趣分析物之外的物质而言可以是特异性的，也可以是非特异性的。
在一个优选例中，分析物非特异性试剂可以是抗体，较佳地是兔IgG。抗体可以是单克隆抗体或多克隆抗体。如本文所用，术语“抗体”也指足以结合于感兴趣分析物的抗体片段。或者，较佳地也可使用具有针对感兴趣分析物的非特异性结合位点的诸如工程化蛋白之类的分子。在另一例子中，可使用受体，该受体会特异结合于除感兴趣分析物之外的配体；反之亦然。此外，分析物非特异性试剂可以是抗原、其他有机分子或半抗原，它们被偶联于对感兴趣分析物非特异的蛋白之上。其他有关合适的分析物非特异性试剂的描述，可在美国专利No.5,096,837中找到，并且包括IgG、其他免疫球蛋白、牛血清白蛋白(BSA)、其他白蛋白、酪蛋白、和球蛋白。
在一个优选例中，分析物非特异性试剂包括对照结合剂。选择对照结合剂，使其能特异地结合于除了特异结合于感兴趣分析物的分子之外的其他分子。如下所述，在这种方式下，对照结合剂可结合于对照区。可用作对照结合剂的物质包括上述可用作第一分析物结合剂的物质。在一个优选例中，对照结合剂包括兔抗-二硝基苯酚(抗-DNP)抗体。对照结合剂的其他有利特性包括(但并不限于)整体稳定性、对有关分析物的非特异性、测试的重现性和可预测性、分子大小、与对照剂结合的亲和力。
第一分析物结合剂和分析物非特异性试剂与检测剂的结合可以是共价的或非共价的(例如离子、氢键、范德瓦耳斯力等)。常规的偶合化学和技术可适用于本发明。此外，每一个第一分析物结合剂、检测剂和分析物非特异性试剂都可相互偶联，通过另一者而偶联，或通过接头、载体或间隔基团而偶联。
例如，如果颗粒被用作检测剂，那么第一分析物结合剂和分析物非特异性试剂都可通过非特异吸附而结合于检测剂。或者，可用常规偶联技术将第一分析物结合剂和分析物非特异性试剂共价连于颗粒。或者，可以使用非共价的结合系统，例如生物素-亲和素或甚至对第一分析物结合剂特异的第二抗体，来将检测剂(如荧光标记物)偶联于第一分析物结合剂，而分析物非特异性试剂可直接偶联于第一分析物结合剂。在另一例子中，还可用双官能或多官能试剂将第一分析物结合剂、检测剂和分析物非特异性试剂偶联在一起。偶联于检测剂的第一分析物结合剂和分析物非特异性试剂的数目可随具体例子而变化。例如，可将两份第一分析物结合剂偶联于一份检测剂和一份分析物非特异性试剂。或者，将两种分析物非特异性试剂偶联于一份检测剂和一份第一分析物结合剂。这些配置的其他变化形式对于本领域技术人员而言毫无疑问是可行的，因此被包括在本发明范围之内。
位于测试片100上的是多个检测区120。每个检测区的位置使得自动的或半自动的分析仪器，或者观察者，能够测定侧流分析的确定结果。检测区包括对测量分析的确定结果进行测量的测量区。检测区可包括一个或多个分析物结合区和/或一个或多个对照结合区。
分析物结合区是膜片上含有第二(种)分析物结合剂的区域。一种或多种上述的适用于第一分析物结合剂的物质，可用作分析物结合区中的第二分析物结合剂。在一个优选例中，第一分析物结合剂是可被感兴趣分析物(它是抗体)所识别的抗原。第二分析物结合剂也可是抗原或甚至对感兴趣分析物(抗体)特异的第二种抗体。在另一优选例中，感兴趣分析物是抗原。第二分析物结合剂是抗体，与第一分析物结合剂(当第一分析物结合剂也是抗体时)相比，第二分析物结合剂针对分析物上不同的表位。或者，当分析物具有多拷贝的相同表位时，第二分析物结合剂可以与第一分析物结合剂一样针对相同的表位。
在某些例子中，让一个或多个测量区也含有至少一个对照结合区，对照结合区包含至少一种对照剂。对照剂会特异地结合于对照结合剂，形成对照结合配对。
对照结合配对的一个特殊优点是，它们是内部对照--即与分析物测量结果作比较的对照位于各测试片上。因此，本发明的对照可用于修正测试片-测试片之间的差异。用基于例如对测试片的统计采样而得出的外部对照来进行这种修正是不切实际的。此外，通过使用本发明的对照结合剂和对照剂，可以减小不同测试片在各个批次和各次使用之间的差异。此外，如下所述，还可减低非特异性结合的影响。在使用外部的非测试片对照时，所有这些修正都是难以实现的。
本发明的测量装置可在测试片上具有一个以上的对照结合区。在这种情况下，对照结合区可被用于产生一标准曲线，而大量不同的分析物测量结果就可与该标准曲线进行比较。因此，具有一个以上内部对照，可使侧流分析比常规侧流分析具有更广的动态量程。在优选例中，如下所述，将具有多个对照结合区的测试片与相对比例法结合使用，从而可以将检测到的对照结合配对的数量映射到同一标尺，并根据该标尺得出分析物的数量。
在一个优选例中，本发明测试片有至少一个高对照结合区和至少一个低对照结合区。两个区之间的差异通常为一种浓度。在高对照结合区中的对照剂浓度大于在低对照结合区中的对照剂浓度。因此，在高对照区中的对照结合配对的数量高于低对照区。在给定对照区中的对照结合配对物数量被映射到同一测量标尺上(并可根据该标尺得出分析物的数量)的例子中，可以通过高和低对照结合区中结合配对物的数值而绘制标准曲线。
在其他例子中，可存在2个以上对照结合区。这样所产生的曲线能更好地反映测试中在检测的分析物数量和被映射数量的测量值之间的非线性现象(如下所述)。尽管这些非线性现象原本会影响假定较为线性关系的测试，但是通过使用多个对照区可对其进行校正。
在另一实施例中，一个单个对照区可含有一种以上的对照剂。这在有一群组以上偶联于检测剂的分析物结合剂和分析物非特异性试剂的情况下是有用的。例如，当需要在同一测试片上分析两种或多种感兴趣的分析物时，可以制备两群偶联于检测剂的分析物结合剂和分析物非特异性试剂。对于每群可使用不同的检测剂，从而可以区分感兴趣的两种不同分析物的测量结果。在这种情况下，可能需要使用包含不同对照剂或对照结合配对的对照结合区。
适用于对照剂的物质包括上述适合作为对照结合剂的物质，不同点是对照剂会特异地结合于对照结合剂。例如，在一个优选例中，对照结合剂是兔抗-二硝基苯酚(抗-DNP)IgG，而对照剂是偶联于BSA(牛血清白蛋白)的二硝基苯酚。
对照结合区可位于包含它的测量区的各种不同位置，而含有对照结合区的测量区可位于测试片上的各种不同位置。在不同的测试中，相对于分析物结合区和第一分析物结合剂、分析物非特异性试剂和检测剂群体的贮藏所，来重新排列对照结合区的位置是有利的。例如，当含有该群体的贮藏所位于偶联物垫片时，在某些例子中需要将分析物结合区位于偶联物垫片和对照结合区之间。在另一些例子中，需要将对照结合区位于分析物结合区和偶联物垫片之间。
此外，对照结合区和分析物结合区在测试片上相对液体流动方向的放置次序，会影响分析物结合剂结合于检测区以及对照结合剂结合于对照检测区的绝对量。这种效应会导致对照与分析物检测测量值之比的增大或减小，尤其在测试非常强的阳性样品时。这种改变对测试截止值有影响，如果使用截止值的话；对于截止处的测试精度有影响；或者对总体的测试动态量程和重复性有影响。
在操作中，先获得含有感兴趣分析物的液体样品，再开始进行本发明的测量分析。样品可包括具有如下特性的任何液体能湿润膜片104，支持抗体/抗原反应(即不干扰抗体/抗原的相互作用)，并且其粘度足以让样品移动通过测试片。在一个优选例中，样品是水溶液(例如体液)。
在本发明测试法的第一个例子中，隔离垫片106与含感兴趣分析物的液体样品接触。在隔离垫片106与含感兴趣分析物的液体样品接触之后，测试片100被维持在允许液体通过毛细管作用将感兴趣分析物输送至偶联物垫片108的条件下。
当感兴趣分析物被输送至偶联物垫片108时，存在于液体中的感兴趣分析物就与偶联物垫片108中所含的、偶联于检测剂上的第一分析物结合剂接触。此时，还发生了液体中所含物质与偶联于检测剂的分析物非特异性试剂之间的接触。因为这些接触，同时导致了特异性结合和非特异性结合，从而形成各种复合物。优选地，所有或几乎所有的特异性结合发生在感兴趣分析物和第一分析物结合剂之间。
液体样品的液体毛细管作用，使得结合或未结合的第一分析物结合剂(它偶联于检测剂和分析物非特异性试剂)移动，侧向地移动至膜片104。此外，含有非特异结合的检测剂的复合物会形成并增大，尤其是在样品中存在与其他组份发生非特异结合的各种物质时。毛细管作用也会移动这些复合物，即使它们非常大。
在移动中，保护性盖片118可减少了液体通过蒸发而导致的液体损失以及所导致的蒸发性冷却，这提高了一致性和重复性，尽管这对于本发明的实施并不是必需的。保留合适的液体体积，对于液体在测试片100上的充分流动是至关重要的。防止蒸发性冷却对于测试反应的速度和充分性是有用的。此外，保护性盖片118起到使传染性物质被保留在测试片100的作用。
第一分析物结合剂和其他复合物的移动，会在达到检测区中的测量区时停止，如果测量区包含对感兴趣分析物或对照结合剂特异的第二分析物结合剂，那么第一分析物结合剂和/或对照结合剂，以及任何直接或间接与它们复合的物质，会被固定在测量区。
一旦第一分析物结合剂和/或对照结合剂，以及任何直接或间接与它们复合的物质，被固定在测量区，那么就可用检测剂来检测它们的存在。停滞于测量区的检测剂数量可用常规技术加以定量。例如，光学方法，如测量光散射、单反射、光度计或光电倍增管；放射性(用盖革计数器等进行测量)；导电性或电介质(电容)；电化学法检测所释放的电活性物质，如铟、铋、镓、碲离子[如用Hayes等人(Analytical Chem.661860-1865(1994)所述的方法]，或亚铁氰化物[如用Roberts和Durst(Analytical Chem.67482-491(1995)所提出的方法。其中通过在检测区滴加洗涤剂，使包裹在脂质体中的亚铁氰化物被释放出，然后用电化学法检测释放的亚铁氰化物]。其他常规方法只要合适，也可使用。
一旦检测剂数量被定量，那么这些数量就可被映射到另一测量标尺上。例如，尽管本发明测试的结果是以(光)反射密度(density of reflectance，Dr)形式测量的，但是以其他单位来表示测量结果可能更有意义，例如用RI(相对于对照区的相对强度)。结果还可表示为测量体积中存在的分析物拷贝数。将检测的分析物数量映射到其他测量标尺上，是一种报告本发明测试结果的优选例子。
例如，测试结果可被映射到相对标尺上。对于内部对照，使用相对标尺(例如相对强度(RI))，可以将反射密度(Dr)值转化为RI值。在一个优选例中，低对照的RI值被定为1而高对照的RI值被定为3，尽管这些对照的Dr绝对值之比并不如此。在一个优选例中，Dr绝对值之比至少约为5∶1，而RI之比约为3∶1。
通过这样做法，在各测试片中影响测量Dr绝对值的变化因素，会导致标准曲线在Y轴上下波动，但是对于沿X轴绘制的RI值的影响却较小。这会全面地减小报告数据的可变幅度，即会表现为“负增益”。
例如，如果在分析物的测量数量和分析物的报告数量之间存在负增益，那么在分析物测量数量上的大变化会转化为分析物报告数量上的较小变化。尽管分析物测量数量的内在差异没有改变，但这种方法在某些情况下是有用的。负增益效应减小了某些测试差异度，并且与简单地报告Dr测量值相比，可用于提高测试报告结果的重复性。
除了在连续标尺上报告测试结果(直接地报告所检测分析物的数量，或者将检测的分析物数量映射到标尺再间接地报告测量标度)之外，本发明测试方法还可用于“截止”式分析。如果检测剂在分析物结合区被检测，那么可将测得的检测剂数量与截止值相比较。截止值是高于该数值时测试就被认为阳性的数值；即，感兴趣分析物在液体样品中的存在达到了某种统计置信度。低于截止值时，测试通常被认为非阳性--或者感兴趣分析物并不存在，或者本发明侧流分析不能检测到它的存在。尽管可根据直接测量值(如测得的分析物数量)来建立截止关系，但是如果数据以间接或相对标度来表示那将更有意义。
阴性值和阳性值之间的区别越大，截止式侧流分析越有利。阴性值是当有关分析物在统计意义上不存在时在连续标尺上的报告值。与之相反，阳性值是当有关分析物在统计意义上存在时在连续标尺上的报告值。当这些数值收敛时，能够在统计上区分阳性和阴性的可能性就下降。
在截止处的准确度上升的截止式侧流也是有利的。当在选定的截止处的变异度较小时，阳性被准确地定为阳性以及阴性被准确地定为阴性的可能性就增加。
测试结果可以被变换成上述的“相对”标度或“绝对”标度。绝对标度是以实际物理单位测量的，例如分析物的拷贝数/每毫升液体。用绝对标度表示的测量值，在测试某些疾病或病症是有优选的，例如测试癌症指标时。在这些优选例中，结果可用例如ng/ml之类的单位表示。因此，对照区具有指定浓度值的对照剂。作为相对测量概念的延伸，可以测量一系列已知分析物浓度的标准物的反射强度(density of reflectance，DR)值，并如上所述计算相对于对照的强度(相对强度值)。然后，可将RI值对分析物浓度进行作图，以建立标准曲线，在该曲线中各RI值对应于有关分析物的某个浓度值。然后，样品的RI可在这一数值对应的标准曲线上解读，得出用所需单位表示的结果。
本发明的偶联于检测剂的单群分析物结合剂和分析物非特异性试剂，提供了优于双群式(two population)测定的优点。一种双群式测定包括一群偶联于检测剂的分析物结合剂和另一群偶联于检测剂的分析物非特异性试剂。如下面实施例所示，可根据本发明进行单群式测定，它优于类似的双群式测定。这些优点包括测试方法可使阴性和阳性样品组的测量值分得更开，并且截止准确度也更高。
许多环境因素会影响侧流分析的绝对反应性，其中包括(但并不限于)制造方面的变数、操作者所引入的变数、环境所引入的变数和样品效应。使用常规的侧流分析时，任何这些因素会抑制或可能提高一个测试片相对另一测试片的反应性，从而导致假阴性或假阳性结果。对于这些或其他变数没有对照，会导致很不准确、无重复性、缺乏敏感度和缺乏测试特异性。
侧流分析还会受到多种干扰，它们会影响分析物结合剂或分析物非特异性试剂与对照结合区或分析物结合区之间结合的绝对量。影响因素包括(1)从偶联物垫片上释放分析物结合剂或对照结合剂方面的差异，(2)装置和装置之间在分析物结合群与测试片的非特异结合方面的差异，(3)在测试过程中，因测试片或膜片材料的孔径或分析物结合剂的非特异聚集而导致的分析物结合群通过或沿测试片移动方面的差异。因此，由这些或其他因素而导致的结合绝对测量值的差异，会在常规侧流分析中高得无法接受。
通过实施本发明，可以降低这些差异。使用单群偶联于对照结合剂和检测剂的分析物结合剂，可提供了优于常规测定(其中具有一群含对照结合剂的群体和另一群独立的含分析物结合剂的群体)的多种优点。第一，与常规双群式分析相比，已暴露于分析物非特异性试剂的侧流分析基质的任何部分，也更可能暴露于分析物结合剂。第二，与常规双群式分析相比，任何阻碍或防止分析物非特异性试剂沿着或通过侧流基质运动的机制，也更可能阻碍或防止分析物结合剂的运动。第三，可以选择分析物非特异性试剂以减少分析物结合剂的非特异结合量。
此外，还可通过修饰分析物检测基质的疏水性/亲水性来降低非特异性结合。分析物检测基质颗粒的聚集“自缔合”现象(这会阻碍基质在测试片上的运动)，也可通过选择性质合适的分析物非特异性试剂而加以减少。最终的好处在于，因为只需制备更少的试剂，所以可降低制造成本。
如本文所述，在侧流分析的实践中多个对照区可提供许多潜在好处。额外的对照区可用于扩展分析标准曲线的动态量程，而不论曲线是线性还是非线性的。多个对照区还可用于确定在给定测试中是否存在前带或高剂量弯曲效应(hookeffect)。如果存在这种效应，那么可建议用户稀释样品以便准确地测定有关分析物的浓度。
本发明的侧流分析可用于各种不同用途。例如，该分析可用于分析人类疾病，例如传染性疾病、或任何其他涉及可识别表位的人类疾病(如癌症、自身免疫疾病、心血管病症和病理)。该分析还可用于兽医、食品测试、农业和精细化学应用。本发明的侧流分析可用各种不同方法进行，包括使用侧流分析测试设备，例如在＿＿＿日提交的申请号为No.＿＿＿(案卷号No.19669-702)，名称为“侧流分析方法及设备”的未审定专利申请中所述的设备，该文献在此引用作为参考。在一个优选例中，侧流分析测试设备包括可从BlackHawk BioSystems(San Ramon，CA)得到的ReLIATM测试设备。
对于本领域的技术人员而言，很明显可以在不背离本发明精神和范围的情况下，对本发明的装置和方法作各种改动和修改。因此，本发明覆盖了本发明的这些改动形式，只要它们在所附权利要求或等价形式的范围内。此外，下列实施例是为了阐明要求保护的本发明，而不是用于限制要求保护的本发明的范围。
实施例实施例1如下制备Helicobacter pylori(幽门螺旋菌)单群偶联物用100mM碳酸钾将600毫升16nm胶体金(Frens，G.，Nature(London)Phys.Sci.，24120(1973))调至pH9.5。将溶液置于搅拌马达上的聚丙烯烧杯中。然后制备兔抗-DNP和Helicobacter pylori抽提物的混合物，每种试剂的含量为完全封阻因氯化钠引起的胶体金聚集反应而所需含量的两倍(Geoghegan，W.D.等人，J.Histochem.Cytochem.251187(1977))。
在室温下，将混合物(12毫升)搅拌加至胶体金，蛋白质与胶体金的吸附进行10分钟。时间结束时，加入12毫升0.2微米过滤处理过的牛血清白蛋白的去离子水溶液，继续在室温下再搅拌30分钟。然后，将胶体金偶联物置于250毫升离心瓶中，在室温和13000rpm(27000×g)下，在Sorvall RC-5C离心机的GSA离心头中离心30分钟。时间结束时，吸去上清液，通过回旋混合和超声波处理将胶体金偶联物分散在剩余液体中。
然后用含0.1％PEG(MW 20,000)的10mM硼酸钠(pH9.0)(简称为“硼酸盐/PEG”)，将胶体金偶联物稀释至约600毫升，并再次如上进行离心。在离心结束时，上清液被吸去，通过回旋混合和超声波处理将胶体金偶联物分散在剩余液体中。
再用硼酸盐/PEG将胶体金偶联物稀释至约600毫升，然后如上进行最后一次离心。在离心结束时，通过回旋混合和超声波处理将胶体金偶联物分散在剩余液体中，然后用硼酸盐/PEG稀释至约15毫升。接着，偶联物溶液经0.2微米过滤处理，并贮藏于4℃。
产量是15毫升原料，在520纳米处的光密度为26.64。
实施例2如下制备HIV单群偶联物用100mM碳酸钾将300毫升16nm胶体金(Frens，G.，Nature(London)Phys.Sci.，24120(1973))调至pH 9.5。将溶液置于搅拌马达上的聚丙烯烧杯中。然后制备兔抗-DNP和HIV包膜抗原env-131-辣根过氧化物酶偶联物的混合物，每种试剂的含量为完全封阻因氯化钠引起的胶体金聚集反应而所需含量的两倍(Geoghegan，W.D.等人，J.Histochem.Cytochem.251187(1977))。
在室温下，将混合物(4.5毫升)搅拌加至胶体金，蛋白质与胶体金的吸附进行10分钟。时间结束时，加入6毫升0.2微米过滤处理过的牛血清白蛋白的去离子水溶液，继续在室温下再搅拌30分钟。然后，将胶体金偶联物置于250毫升离心瓶中，在室温和13000rpm(27000×g)下，在Sorvall RC-5C离心机的GSA离心头中离心60分钟。时间结束时，吸去上清液，通过回旋混合和超声波处理将胶体金偶联物分散在剩余液体中。
然后用含0.1％PEG(MW 20,000)的10mM硼酸钠(pH 9.0)(硼酸盐/PEG)，将胶体金偶联物稀释至约300毫升，并再次如上进行离心。在离心结束时，上清液被吸去，通过回旋混合和超声波处理将胶体金偶联物分散在剩余液体中。
再次用含0.1％PEG(MW 20,000)的10mM硼酸钠(pH 9.0)(硼酸盐/PEG)，将胶体金偶联物稀释至约300毫升，并如上进行最后一次离心。在离心结束时，通过回旋混合和超声波处理将胶体金偶联物分散在剩余液体中。然后用硼酸盐/PEG稀释至约10毫升。接着，偶联物溶液经0.2微米过滤处理，并贮藏于4℃。
产量是9.5毫升原料，在520纳米处的光密度为26.74。
实施例3如下制备对照偶联物用100mM碳酸钾将1200毫升41nm胶体金(Frens，G.，Nature(London)Phys.Sci.，24120(1973))调至pH 9.5。将溶液置于搅拌马达上的聚丙烯烧杯中。然后制备兔抗-DNP的溶液，试剂的含量为完全封阻因氯化钠引起的胶体金聚集反应而所需含量的两倍(Geoghegan，W.D.等人，J.Histochem.Cytochem.251187(1977))。
在室温下，将溶液(12毫升)搅拌加至胶体金，蛋白质与胶体金的吸附进行10分钟。时间结束时，加入24毫升0.2微米过滤处理过的牛血清白蛋白的去离子水溶液，继续在室温下再搅拌30分钟。然后，将胶体金偶联物置于250毫升离心瓶中，在室温和13000rpm(27000×g)下，在Sorvall RC-5C离心机的GSA离心头中离心60分钟。时间结束时，吸去上清液，通过回旋混合和超声波处理将胶体金偶联物分散在剩余液体中。
然后用含0.1％PEG(MW 20,000)的10mM硼酸钠(pH 9.0)(硼酸盐/PEG)，将胶体金偶联物稀释至约1200毫升，并再次如上进行离心。在离心结束时，上清液被吸去，通过回旋混合和超声波处理将胶体金偶联物分散在剩余液体中。
再次用硼酸盐/PEG将胶体金偶联物稀释至约1200毫升，并如上进行最后一次离心。在离心结束时，通过回旋混合和超声波处理将胶体金偶联物分散在剩余液体中。然后用硼酸盐/PEG稀释至约42毫升。接着，偶联物溶液经0.2微米过滤处理，并贮藏于4℃。
产量是42毫升原料，在520纳米处的光密度为11.76。
实施例4如下制备Helicobacter pylori偶联物用100mM碳酸钾将140毫升16nm胶体金(Frens，G.，Nature(London)Phys.Sci.，24120(1973))调至pH 9.5。将溶液置于搅拌马达上的聚丙烯烧杯中。然后制备Helicobacter pylori抽提物(含量为完全封阻因氯化钠引起的胶体金聚集反应而所需含量的两倍)和非特异性兔IgG(含量为完全封阻氯化钠诱导的胶体金聚集反应而所需含量的两倍)的溶液(Geoghegan，W.D.等人，J.Histochem.Cytochem.251187(1977))。
在室温下，将溶液(2.8毫升)搅拌加至胶体金，蛋白质与胶体金的吸附进行10分钟。时间结束时，加入2.8毫升0.2微米过滤处理过的牛血清白蛋白的去离子水溶液，继续在室温下再搅拌30分钟。然后，将胶体金偶联物置于250毫升离心瓶中，在室温和13000rpm(27000×g)下，在Sorvall RC-5C离心机的GSA离心头中离心30分钟。时间结束时，吸去上清液，通过回旋混合和超声波处理将胶体金偶联物分散在剩余液体中。
然后用含0.1％PEG(MW 20,000)的10mM硼酸钠(pH 9.0)(硼酸盐/PEG)，将胶体金偶联物稀释至约140毫升，并再次如上进行离心。在离心结束时，上清液被吸去，通过回旋混合和超声波处理将胶体金偶联物分散在剩余液体中。
再次用硼酸盐/PEG将胶体金偶联物稀释至约140毫升，并如上进行最后一次离心。在离心结束时，通过回旋混合和超声波处理将胶体金偶联物分散在剩余液体中。然后用硼酸盐/PEG稀释至约5毫升。接着，偶联物溶液经0.2微米过滤处理，并贮藏于4℃。
产量是4.5毫升原料，在520纳米处的光密度为28.4。
实施例5如下制备HIV检测偶联物用100mM碳酸钾将400毫升16nm胶体金(Frens，G.，Nature(London)Phys.Sci.，24120(1973))调至pH 9.5。将溶液置于搅拌马达上的聚丙烯烧杯中。然后制备HIV包膜抗原env-131-辣根过氧化物酶偶联物(含量为完全封阻因氯化钠引起的胶体金聚集反应而所需含量的两倍)和非特异性兔IgG(含量为完全封阻氯化钠诱导的胶体金聚集反应而所需含量的两倍)的溶液(Geoghegan，W.D.等人，J.Histochem.Cytochem.251187(1977))。
在室温下，将溶液(4.26毫升)搅拌加至胶体金，蛋白质与胶体金的吸附进行10分钟。时间结束时，加入8毫升0.2微米过滤处理过的牛血清白蛋白的去离子水溶液，继续在室温下再搅拌30分钟。然后，将胶体金偶联物置于250毫升离心瓶中，在室温和13000rpm(27000×g)下，在Sorvall RC-5C离心机的GSA离心头中离心60分钟。时间结束时，吸去上清液，通过回旋混合和超声波处理将胶体金偶联物分散在剩余液体中。
然后用含0.1％PEG(MW 20,000)的10mM硼酸钠(pH 9.0)(硼酸盐/PEG)，将胶体金偶联物稀释至约400毫升，并再次如上进行离心。在离心结束时，上清液被吸去，通过回旋混合和超声波处理将胶体金偶联物分散在剩余液体中。
再次用硼酸盐/PEG将胶体金偶联物稀释至约400毫升，并如上进行最后一次离心。在离心结束时，通过回旋混合和超声波处理将胶体金偶联物分散在剩余液体中。然后用硼酸盐/PEG稀释至约15毫升。接着，偶联物溶液经0.2微米过滤处理，并贮藏于4℃。
产量是12毫升原料，在520纳米处的光密度为26.66。
实施例6根据如下程序制备测试片。对微孔STHF背衬硝酸纤维素片(2.5厘米×20厘米)进行涂覆，即用Bio Dot XYZ3000分配平台并且生物喷口(Biojet)的工作频率为120Hz的情况下，以20.83nl/滴和0.5μl/cm将一个抗原条带和两个对照条带按纵向涂于硝酸纤维素上。对照抗原是位于含0.05％Tween 20的磷酸盐缓冲液(PBS)中的二硝基苯酚化的牛血清白蛋白(DNP-BSA)。对于各测试，高对照可合适地以150-500微克/毫升的范围进行涂覆，而低对照可合适地以15-100微克/毫升的范围进行涂覆。对于各测试，抗原可在含洗涤剂的磷酸盐缓冲溶液中以0.5-4毫克/毫升的范围进行涂覆。可将还原剂(如DTT和/或乙二胺四乙酸(EDTA))加至抗原溶液中，如果存在活性巯基的话。在实施例23中所用的测试片，HIV-env-131是以2毫克/毫升PBS(含2mM EDTA，10mM DTT，0.2％十二烷基磺酸钠(SDS))的浓度进行涂覆，高对照涂覆浓度是300微克/毫升，而低对照涂覆浓度是25微克/毫升。
然后，片材在强风温箱中于37℃干燥1小时，在含10mg/ml BSA、1％(w/v)PEG8000、3％(w/v)甘露醇、0.3％(w/v)明胶、0.01％(w/v)叠氮化钠和0.05％(w/v)十二烷基硫酸钠的PBS溶液中封闭15分钟。接着在强风温箱中于37℃再干燥1小时。涂覆的片材以干燥形式在室温下贮藏于箔袋中。
Gelman 8980玻璃纤维垫片通过如下方式进行预封闭将其浸入PBS溶液(含10mg/ml BSA、2mg/ml兔IgG、1％(w/v)Triton X-100、2.5％(w/v)蔗糖和0.3％(w/v)聚乙烯吡咯烷酮K-30)，然后在强风温箱中干燥1.5小时。预封闭的偶联物垫片用根据实施例2制备的HIV OMNITM偶联物，或根据实施例1制备的Helicobacer pylori OMNITM偶联物进行涂覆，它们是通过将等体积的偶联物原液(OD 520约26)与PBS(含20mg/ml BSA、4mg/ml兔IgG、2％(w/v)Triton X-100、5％(w/v)蔗糖和0.6％(w/v)聚乙烯吡咯烷酮K-30)混合而成。然后加入1/40体积的20×PBS，溶液经0.2微米过滤处理，然后在室温和27英寸汞柱的真空下脱气1小时。用Bio Dot XYZ3000分配平台并且单生物喷口的工作频率为120Hz的情况下，以104.17nl/滴和2.5μl/cm的速度，将偶联物的混合物按纵向涂于预封闭过的偶联物垫片上。偶联物的涂覆图案是每厘米4线，并且在每个3厘米×10厘米的垫片上涂覆3个图案。涂覆后的垫片在2托和室温下真空干燥1小时，然后切割成1厘米×10厘米的小块，每块含一个4线的图案。
测试片是这样制备的按图1所示的结构，将一片2.5厘米×20厘米的背衬硝酸纤维素片、一片1.8厘米×20厘米Gelman 133型吸收垫片、两片1厘米×10厘米的涂有偶联物的垫片(并排放置)和一片2厘米×20厘米GelmanCytosep 1662片，固定在一片涂有粘合剂且厚0.010’’的6厘米×20厘米乙烯背衬片上(G＆L Precision Die Cutting)。用背面涂有粘合剂的透明聚酯膜(G&LPrecision Die Cutting)覆盖测试片，从Cytosep片上方2毫米覆盖至吸收垫片上方。用Bio Dot Cutter 3000TM切片机，从组装好的片材上切下0.5厘米宽的测试片。
实施例7用于该实施例的测试片，在高对照区涂有300微克/毫升偶联于二硝基苯酚的牛血清白蛋白(BSA-DNP)，在低对照区涂有25微克/毫升BSA-DNP，并且在分析物结合区(即抗原区)涂有Helicobacter pylori抽提物溶液(在280纳米处的光密度为2.70)。这些条带区在测试片上的次序是低对照区最接近偶联物垫片，分析物结合区(即抗原区)位于低对照区和高对照区之间，而高对照区离偶联物垫片最远且离吸收垫片最近。如实施例6所述，对硝酸纤维素片进行涂覆并制备测试片。偶联物垫片的制备是通过混合0.968毫升实施例3所述的偶联物、0.681毫升实施例4所述的偶联物、1.868毫升PBS(含20毫克/毫升BSA、2％TritonX-100、5％蔗糖、0.6％聚乙烯吡咯烷酮K-30和4毫克/毫升兔IgG)、0.094毫升20×PBS和0.185毫升10mM硼酸盐(pH 9.0，含0.1％PEG(MW20000))。如实施例6所述，将混合物涂在预封闭过的偶联物垫片上。
测试是这样进行的将含测试片的测试盒(cassette)置于ReLIATM仪上，该仪器已被设置好可运行检测H.pylori(幽门螺旋菌)的测试并读取数据。按提示，通过加入25微升H.pylori阴性adsol浆样品(n＝12)而开始测试，然后加入3滴洗涤缓冲液(PBS，含0.05％Triton X-100，0.5％PEG(20000)，0.1％叠氮化钠和2mM EDTA)。测试片温度被设为37℃，并在15分钟后对测试片进行读数。
结果如下
>实施例8用于该实施例的测试片，在高对照区涂有300微克/毫升偶联于二硝基苯酚的牛血清白蛋白(BSA-DNP)，在低对照区涂有25微克/毫升BSA-DNP，并且在分析物结合区(即抗原区)涂有Helicobacter pylori抽提物溶液(在280纳米处的光密度为2.70)。这些条带区在测试片上的次序是低对照区最接近偶联物垫片，分析物结合区(即抗原区)位于低对照区和高对照区之间，而高对照区离偶联物垫片最远且离吸收垫片最近。如实施例6所述，对硝酸纤维素片进行涂覆并制备测试片。偶联物垫片的制备是通过混合1.0毫升实施例1所述的偶联物、1.0毫升PBS(含20毫克/毫升BSA、2％Triton X-100、5％蔗糖、0.6％聚乙烯吡咯烷酮K-30和4毫克/毫升兔IgG)、0.050毫升20×PBS。如实施例6所述，将混合物涂在预封闭过的偶联物垫片上。
测试是这样进行的将含测试片的测试盒置于ReLIATM仪上，该仪器已被设置好可运行检测H.pylori的测试并读取数据。按提示，通过加入25微升H.pylori阴性adsol浆样品(n＝12)而开始测试，然后加入3滴洗涤缓冲液(PBS，含0.05％Triton X-100，0.5％PEG(20000)，0.1％叠氮化钠和2mM EDTA)。测试片温度被设为37℃，并在15分钟后对测试片进行读数。
结果如下
实施例9用于该实施例的测试片，在高对照区涂有300微克/毫升偶联于二硝基苯酚的牛血清白蛋白(BSA-DNP)，在低对照区涂有25微克/毫升BSA-DNP，并且在分析物结合区(即抗原区)涂有Helicobacter pylori抽提物溶液(在280纳米处的光密度为2.70)。这些条带区在测试片上的次序是低对照区最接近偶联物垫片，分析物结合区(即抗原区)位于低对照区和高对照区之间，而高对照区离偶联物垫片最远且离吸收垫片最近。如实施例6所述，对硝酸纤维素片进行涂覆并制备测试片。偶联物垫片的制备是通过混合0.968毫升实施例3所述的偶联物、0.681毫升实施例4所述的偶联物、1.868毫升PBS(含20毫克/毫升BSA、2％TritonX-100、5％蔗糖、0.6％聚乙烯吡咯烷酮K-30和4毫克/毫升兔IgG)、0.094毫升20×PBS和0.185毫升10mM硼酸盐(pH 9.0，含0.1％PEG(MW20000))。如实施例6所述，将混合物涂在预封闭过的偶联物垫片上。
测试是这样进行的将含测试片的测试盒置于ReLIATM仪上，该仪器已被设置好可运行检测H.pylori的测试并读取数据。按提示，通过加入25微升H.pylori阴性adsol浆样品(n＝12)而开始测试，然后加入3滴洗涤缓冲液(PBS，含0.05％Triton X-100，0.5％PEG(20000)，0.1％叠氮化钠和2mM EDTA)。测试片温度被设为37℃，并在15分钟后对测试片进行读数。
结果如下
实施例10用于该实施例的测试片，在高对照区涂有300微克/毫升偶联于二硝基苯酚的牛血清白蛋白(BSA-DNP)，在低对照区涂有25微克/毫升BSA-DNP，并且在分析物结合区(即抗原区)涂有Helicobacter pylori抽提物溶液(在280纳米处的光密度为2.70)。这些条带区在测试片上的次序是分析物结合区(即抗原区)最接近偶联物垫片，低对照区位于分析物结合区(即抗原区)和高对照区之间，而高对照区离偶联物垫片最远且离吸收垫片最近。如实施例6所述，对硝酸纤维素片进行涂覆并制备测试片。偶联物垫片的制备是通过混合1.0毫升实施例1所述的偶联物、1.0毫升PBS(含20毫克/毫升BSA、2％Triton X-100、5％蔗糖、0.6％聚乙烯吡咯烷酮K-30和4毫克/毫升兔IgG)和0.050毫升20×PBS。如实施例6所述，将混合物涂在预封闭过的偶联物垫片上。
测试是这样进行的将含测试片的测试盒置于ReLIATM仪上，该仪器已被设置好可运行检测H.pylori的测试并读取数据。按提示，通过加入25微升H.pylori阴性adsol浆样品(n＝12)而开始测试，然后加入3滴洗涤缓冲液(PBS，含0.05％Triton X-100，0.5％PEG(20000)，0.1％叠氮化钠和2mM EDTA)。测试片温度被设为37℃，并在15分钟后对测试片进行读数。
结果如下
实施例11用于该实施例的测试片，在高对照区涂有300微克/毫升偶联于二硝基苯酚的牛血清白蛋白(BSA-DNP)，在低对照区涂有25微克/毫升BSA-DNP，并且在分析物结合区(即抗原区)涂有Helicobacter pylori抽提物溶液(在280纳米处的光密度为2.70)。这些条带区在测试片上的次序是低对照区最接近偶联物垫片，分析物结合区(即抗原区)位于低对照区和高对照区之间，而高对照区离偶联物垫片最远且离吸收垫片最近。如实施例6所述，对硝酸纤维素片进行涂覆并制备测试片。偶联物垫片的制备是通过混合0.968毫升实施例3所述的偶联物、0.681毫升实施例4所述的偶联物、1.868毫升PBS(含20毫克/毫升BSA、2％TritonX-100、5％蔗糖、0.6％聚乙烯吡咯烷酮K-30和4毫克/毫升兔IgG)、0.094毫升20×PBS和0.185毫升10mM硼酸盐(pH 9.0，含0.1％PEG(MW20000))。如实施例6所述，将混合物涂在预封闭过的偶联物垫片上。
测试是这样进行的将含测试片的测试盒置于ReLIATM仪上，该仪器已被设置好可运行检测H.pylori的测试并读取数据。按提示，通过加入25微升BBI PMH201混合效价组样品(n＝7)而开始测试，然后加入3滴洗涤缓冲液(PBS，含0.05％Triton X-100，0.5％PEG(20000)，0.1％叠氮化钠和2mM EDTA)。测试片温度被设为37℃，并在15分钟后对测试片进行读数。
结果如下
实施例12用于该实施例的测试片，在高对照区涂有300微克/毫升偶联于二硝基苯酚的牛血清白蛋白(BSA-DNP)，在低对照区涂有25微克/毫升BSA-DNP，并且在分析物结合区(即抗原区)涂有Helicobacter pylori抽提物溶液(在280纳米处的光密度为2.70)。这些条带区在测试片上的次序是低对照区最接近偶联物垫片，分析物结合区(即抗原区)位于低对照区和高对照区之间，而高对照区离偶联物垫片最远且离吸收垫片最近。如实施例6所述，对硝酸纤维素片进行涂覆并制备测试片。偶联物垫片的制备是通过混合1.0毫升实施例1所述的偶联物、1.0毫升PBS(含20毫克/毫升BSA、2％Triton X-100、5％蔗糖、0.6％聚乙烯吡咯烷酮K-30和4毫克/毫升兔IgG)和0.050毫升20×PBS。如实施例6所述，将混合物涂在预封闭过的偶联物垫片上。
测试是这样进行的将含测试片的测试盒置于ReLIATM仪上，该仪器已被设置好可运行检测H.pylori的测试并读取数据。按提示，通过加入25微升BBI PMH201混合效价组样品(n＝7)而开始测试，然后加入3滴洗涤缓冲液(PBS，含0.05％Triton X-100，0.5％PEG(20000)，0.1％叠氮化钠和2mM EDTA)。测试片温度被设为37℃，并在15分钟后对测试片进行读数。
结果如下
实施例13用于该实施例的测试片，在高对照区涂有300微克/毫升偶联于二硝基苯酚的牛血清白蛋白(BSA-DNP)，在低对照区涂有25微克/毫升BSA-DNP，并且在分析物结合区(即抗原区)涂有Helicobacter pylori抽提物溶液(在280纳米处的光密度为2.70)。这些条带区在测试片上的次序是低对照区最接近偶联物垫片，分析物结合区(即抗原区)位于低对照区和高对照区之间，而高对照区离偶联物垫片最远且离吸收垫片最近。如实施例6所述，对硝酸纤维素片进行涂覆并制备测试片。偶联物垫片的制备是通过混合0.968毫升实施例3所述的偶联物、0.681毫升实施例4所述的偶联物、1.868毫升PBS(含20毫克/毫升BSA、2％TritonX-100、5％蔗糖、0.6％聚乙烯吡咯烷酮K-30和4毫克/毫升兔IgG)、0.094毫升20×PBS和0.185毫升10mM硼酸盐(pH 9.0，含0.1％PEG(MW20000))。如实施例6所述，将混合物涂在预封闭过的偶联物垫片上。
测试是这样进行的将含测试片的测试盒置于ReLIATM仪上，该仪器已被设置好可运行检测H.pylori的测试并读取数据。按提示，通过加入25微升BBI PMH201混合效价组样品(n＝7)而开始测试，然后加入3滴洗涤缓冲液(PBS，含0.05％Triton X-100，0.5％PEG(20000)，0.1％叠氮化钠和2mM EDTA)。测试片温度被设为37℃，并在15分钟后对测试片进行读数。
结果如下
实施例14用于该实施例的测试片，在高对照区涂有300微克/毫升偶联于二硝基苯酚的牛血清白蛋白(BSA-DNP)，在低对照区涂有25微克/毫升BSA-DNP，并且在分析物结合区(即抗原区)涂有Helicobacter pylori抽提物溶液(在280纳米处的光密度为2.70)。这些条带区在测试片上的次序是分析物结合区(即抗原区)最接近偶联物垫片，低对照区位于分析物结合区(即抗原区)和高对照区之间，而高对照区离偶联物垫片最远且离吸收垫片最近。如实施例6所述，对硝酸纤维素片进行涂覆并制备测试片。偶联物垫片的制备是通过混合1.0毫升实施例1所述的偶联物、1.0毫升PBS(含20毫克/毫升BSA、2％Triton X-100、5％蔗糖、0.6％聚乙烯吡咯烷酮K-30和4毫克/毫升兔IgG)和0.050毫升20×PBS。如实施例6所述，将混合物涂在预封闭过的偶联物垫片上。
测试是这样进行的将含测试片的测试盒置于ReLIATM仪上，该仪器已被设置好可运行检测h.pylori的测试并读取数据。按提示，通过加入25微升BBI PMH201混合效价组样品(n＝7)而开始测试，然后加入3滴洗涤缓冲液(PBS，含0.05％Triton X-100，0.5％PEG(20000)，0.1％叠氮化钠和2mM EDTA)。测试片温度被设为37℃，并在15分钟后对测试片进行读数。
结果如下
实施例15用于该实施例的测试片，在高对照区涂有300微克/毫升偶联于二硝基苯酚的牛血清白蛋白(BSA-DNP)，在低对照区涂有25微克/毫升BSA-DNP，并且在分析物结合区(即抗原区)涂有Helicobacter pylori抽提物溶液(在280纳米处的光密度为2.70)。这些条带区在测试片上的次序是低对照区最接近偶联物垫片，分析物结合区(即抗原区)位于低对照区和高对照区之间，而高对照区离偶联物垫片最远且离吸收垫片最近。如实施例6所述，对硝酸纤维素片进行涂覆并制备测试片。偶联物垫片的制备是通过混合0.968毫升实施例3所述的偶联物、0.681毫升实施例4所述的偶联物、1.868毫升PBS(含20毫克/毫升BSA、2％TritonX-100、5％蔗糖、0.6％聚乙烯吡咯烷酮K-30和4毫克/毫升兔IgG)、0.094毫升20×PBS和0.185毫升10mM硼酸盐(pH 9.0，含0.1％PEG(MW20000))。如实施例6所述，将混合物涂在预封闭过的偶联物垫片上。
测试是这样进行的将含测试片的测试盒置于ReLIATM仪上，该仪器已被设置好可运行检测H.pylori的测试并读取数据。按提示，通过加入25微升随机血清样品(n＝10)而开始测试，然后加入3滴洗涤缓冲液(PBS，含0.05％TritonX-100，0.5％PEG(20000)，0.1％叠氮化钠和2mM EDTA)。测试片温度被设为37℃，并在15分钟后对测试片进行读数。
结果如下
实施例16用于该实施例的测试片，在高对照区涂有300微克/毫升偶联于二硝基苯酚的牛血清白蛋白(BSA-DNP)，在低对照区涂有25微克/毫升BSA-DNP，并且在分析物结合区(即抗原区)涂有Helicobacter pylori抽提物溶液(在280纳米处的光密度为2.70)。这些条带区在测试片上的次序是低对照区最接近偶联物垫片，分析物结合区(即抗原区)位于低对照区和高对照区之间，而高对照区离偶联物垫片最远且离吸收垫片最近。如实施例6所述，对硝酸纤维素片进行涂覆并制备测试片。偶联物垫片的制备是通过混合1.0毫升实施例1所述的偶联物、1.0毫升PBS(含20毫克/毫升BSA、2％Triton X-100、5％蔗糖、0.6％聚乙烯吡咯烷酮K-30和4毫克/毫升兔IgG)和0.050毫升20×PBS。如实施例6所述，将混合物涂在预封闭过的偶联物垫片上。
测试是这样进行的将含测试片的测试盒置于ReLIATM仪上，该仪器已被设置好可运行检测H.pylori的测试并读取数据。按提示，通过加入25微升随机血清样品(n＝10)而开始测试，然后加入3滴洗涤缓冲液(PBS，含0.05％TritonX-100，0.5％PEG(20000)，0.1％叠氮化钠和2mM EDTA)。测试片温度被设为37℃，并在15分钟后对测试片进行读数。
结果如下
实施例17用于该实施例的测试片，在高对照区涂有300微克/毫升偶联于二硝基苯酚的牛血清白蛋白(BSA-DNP)，在低对照区涂有25微克/毫升BSA-DNP，并且在分析物结合区(即抗原区)涂有Helicobacter pylori抽提物溶液(在280纳米处的光密度为2.70)。这些条带区在测试片上的次序是低对照区最接近偶联物垫片，分析物结合区(即抗原区)位于低对照区和高对照区之间，而高对照区离偶联物垫片最远且离吸收垫片最近。如实施例6所述，对硝酸纤维素片进行涂覆并制备测试片。偶联物垫片的制备是通过混合0.968毫升实施例3所述的偶联物、0.681毫升实施例4所述的偶联物、1.868毫升PBS(含20毫克/毫升BSA、2％TritonX-100、5％蔗糖、0.6％聚乙烯吡咯烷酮K-30和4毫克/毫升兔IgG)、0.094毫升20×PBS和0.185毫升10mM硼酸盐(pH 9.0，含0.1％PEG(MW20000))。如实施例6所述，将混合物涂在预封闭过的偶联物垫片上。
测试是这样进行的将含测试片的测试盒置于ReLIATM仪上，该仪器已被设置好可运行检测H.pylori的测试并读取数据。按提示，通过加入25微升随机血清样品(n＝10)而开始测试，然后加入3滴洗涤缓冲液(PBS，含0.05％TritonX-100，0.5％PEG(20000)，0.1％叠氮化钠和2mM EDTA)。测试片温度被设为37℃，并在15分钟后对测试片进行读数。
结果如下
实施例18用于该实施例的测试片，在高对照区涂有300微克/毫升偶联于二硝基苯酚的牛血清白蛋白(BSA-DNP)，在低对照区涂有25微克/毫升BSA-DNP，并且在分析物结合区(即抗原区)涂有Helicobacter pylori抽提物溶液(在280纳米处的光密度为2.70)。这些条带区在测试片上的次序是分析物结合区(即抗原区)最接近偶联物垫片，低对照区位于分析物结合区(即抗原区)和高对照区之间，而高对照区离偶联物垫片最远且离吸收垫片最近。如实施例6所述，对硝酸纤维素片进行涂覆并制备测试片。偶联物垫片的制备是通过混合1.0毫升实施例1所述的偶联物、1.0毫升PBS(含20毫克/毫升BSA、2％Triton X-100、5％蔗糖、0.6％聚乙烯吡咯烷酮K-30和4毫克/毫升兔IgG)和0.050毫升20×PBS。如实施例6所述，将混合物涂在预封闭过的偶联物垫片上。
测试是这样进行的将含测试片的测试盒置于ReLIATM仪上，该仪器已被设置好可运行检测H.pylori的测试并读取数据。按提示，通过加入25微升随机血清样品(n＝10)而开始测试，然后加入3滴洗涤缓冲液(PBS，含0.05％TritonX-100，0.5％PEG(20000)，0.1％叠氮化钠和2mM EDTA)。测试片温度被设为37℃，并在15分钟后对测试片进行读数。
结果如下<
实施例19用于该实施例的测试片，在高对照区涂有300微克/毫升偶联于二硝基苯酚的牛血清白蛋白(BSA-DNP)，在低对照区涂有25微克/毫升BSA-DNP，并且在分析物结合区(即抗原区)涂有Helicobacter pylori抽提物溶液(在280纳米处的光密度为2.70)。这些条带区在测试片上的次序是低对照区最接近偶联物垫片，分析物结合区(即抗原区)位于低对照区和高对照区之间，而高对照区离偶联物垫片最远且离吸收垫片最近。如实施例6所述，对硝酸纤维素片进行涂覆并制备测试片。偶联物垫片的制备是通过混合0.968毫升实施例3所述的偶联物、0.681毫升实施例4所述的偶联物、1.868毫升PBS(含20毫克/毫升BSA、2％TritonX-100、5％蔗糖、0.6％聚乙烯吡咯烷酮K-30和4毫克/毫升兔IgG)、0.094毫升20×PBS和0.185毫升10mM硼酸盐(pH 9.0，含0.1％PEG(MW20000))。如实施例6所述，将混合物涂在预封闭过的偶联物垫片上。
测试是这样进行的将含测试片的测试盒置于ReLIATM仪上，该仪器已被设置好可运行检测H.pylori的测试并读取数据。按提示，通过加入25微升样品(如下所述)而开始测试，然后加入3滴洗涤缓冲液(PBS，含0.05％Triton X-100，0.5％PEG(20000)，0.1％叠氮化钠和2mM EDTA)。测试片温度被设为37℃，并在15分钟后对测试片进行读数。
结果如下
实施例20用于该实施例的测试片，在高对照区涂有300微克/毫升偶联于二硝基苯酚的牛血清白蛋白(BSA-DNP)，在低对照区涂有25微克/毫升BSA-DNP，并且在分析物结合区(即抗原区)涂有Helicobacter pylori抽提物溶液(在280纳米处的光密度为2.70)。这些条带区在测试片上的次序是低对照区最接近偶联物垫片，分析物结合区(即抗原区)位于低对照区和高对照区之间，而高对照区离偶联物垫片最远且离吸收垫片最近。如实施例6所述，对硝酸纤维素片进行涂覆并制备测试片。偶联物垫片的制备是通过混合1.0毫升实施例1所述的偶联物、1.0毫升PBS(含20毫克/毫升BSA、2％Triton X-100、5％蔗糖、0.6％聚乙烯吡咯烷酮K-30和4毫克/毫升兔IgG)和0.050毫升20×PBS。如实施例6所述，将混合物涂在预封闭过的偶联物垫片上。
测试是这样进行的将含测试片的测试盒置于ReLIATM仪上，该仪器已被设置好可运行检测H.pylori的测试并读取数据。按提示，通过加入25微升样品(如下所述)而开始测试，然后加入3滴洗涤缓冲液(PBS，含0.05％Triton X-100，0.5％PEG(20000)，0.1％叠氮化钠和2mM EDTA)。测试片温度被设为37℃，并在15分钟后对测试片进行读数。
结果如下
实施例21用于该实施例的测试片，在高对照区涂有300微克/毫升偶联于二硝基苯酚的牛血清白蛋白(BSA-DNP)，在低对照区涂有25微克/毫升BSA-DNP，并且在分析物结合区(即抗原区)涂有Helicobacter pylori抽提物溶液(在280纳米处的光密度为2.70)。这些条带区在测试片上的次序是低对照区最接近偶联物垫片，分析物结合区(即抗原区)位于低对照区和高对照区之间，而高对照区离偶联物垫片最远且离吸收垫片最近。如实施例6所述，对硝酸纤维素片进行涂覆并制备测试片。偶联物垫片的制备是通过混合0.968毫升实施例3所述的偶联物、0.681毫升实施例4所述的偶联物、1.868毫升PBS(含20毫克/毫升BSA、2％TritonX-100、5％蔗糖、0.6％聚乙烯吡咯烷酮K-30和4毫克/毫升兔IgG)、0.094毫升20×PBS和0.185毫升10mM硼酸盐(pH 9.0，含0.1％PEG(MW20000))。如实施例6所述，将混合物涂在预封闭过的偶联物垫片上。
测试是这样进行的将含测试片的测试盒置于ReLIATM仪上，该仪器已被设置好可运行检测H.pylori的测试并读取数据。按提示，通过加入25微升BBI PMH混合效价组样品(n＝4)而开始测试，然后加入3滴洗涤缓冲液(PBS，含0.05％Triton X-100，0.5％PEG(20000)，0.1％叠氮化钠和2mM EDTA)。测试片温度被设为37℃，并在15分钟后对测试片进行读数。
结果如下
实施例22用于该实施例的测试片，在高对照区涂有300微克/毫升偶联于二硝基苯酚的牛血清白蛋白(BSA-DNP)，在低对照区涂有25微克/毫升BSA-DNP，并且在分析物结合区(即抗原区)涂有Helicobacter pylori抽提物溶液(在280纳米处的光密度为2.70)。这些条带区在测试片上的次序是分析物结合区(即抗原区)最接近偶联物垫片，低对照区位于分析物结合区(即抗原区)和高对照区之间，而高对照区离偶联物垫片最远且离吸收垫片最近。如实施例6所述，对硝酸纤维素片进行涂覆并制备测试片。偶联物垫片的制备是通过混合1.0毫升实施例1所述的偶联物、1.0毫升PBS(含20毫克/毫升BSA、2％Triton X-100、5％蔗糖、0.6％聚乙烯吡咯烷酮K-30和4毫克/毫升兔IgG)和0.050毫升20×PBS。如实施例6所述，将混合物涂在预封闭过的偶联物垫片上。
测试是这样进行的将含测试片的测试盒置于ReLIATM仪上，该仪器已被设置好可运行检测H.pylori的测试并读取数据。按提示，通过加入25微升样品(如下所述)而开始测试，然后加入3滴洗涤缓冲液(PBS，含0.05％Triton X-100，0.5％PE6(20000)，0.1％叠氮化钠和2mM EDTA)。测试片温度被设为37℃，并在15分钟后对测试片进行读数。
结果如下
上面实施例的数据可总结如下。在实施例7-22中测试了4种分析格式。这4种分析格式格式1独立的含对照结合剂的颗粒偶联物群以及含分析物结合剂的颗粒偶联物群，且分析物结合区位于高对照区和低对照区之间；格式2独立的含对照结合剂的颗粒偶联物群以及含分析物结合剂的颗粒偶联物群，且高对照区和低对照区位于分析物结合区和偶联物垫片之后；格式3含对照结合剂和分析物结合剂的颗粒的OMNITM偶联物群，且分析物结合区位于高对照区和低对照区之间；格式4含对照结合剂和分析物结合剂的颗粒的OMNITM偶联物群，且高对照区和低对照区位于分析物结合区和偶联物垫片之后；按格式对结果进行分析，列于表1-5。
表1以HC/LC的CV％表示<
表2对阴性样本的结果，以Dr平均值(分析物结合区)/低对照区的Dr平均值表示
表3对阳性样本的结果，以Dr平均值(分析物结合区)/低对照区的Dr平均值表示
表4总体扩展，以表3平均值/表2平均值表示
表5在截止处的分析精确性(S/CO 0.9-1.2)
从这些表格中可看出，独立的各颗粒群和OMNITM偶联物群的不同配置，以及对照结合区和分析物结合区的不同配置，会产生不同的结果。对于测试H.pylori，格式2的HC/LC之比的变差系数最低而且对H.pylori阴性样品的读数最低。相反，格式3产生的对H.pylori阳性样品的读数最高。最后，格式4在指定的截止值处的精确性最好，而且H.pylori阴性样品和H.pylori阳性样品的测量值的扩展也最大。
因此，对于截止式测试H.pylori，格式4似乎是最佳选择。
实施例23用于该实施例的格式2和格式4测试片，在高对照区涂有300微克/毫升偶联于二硝基苯酚的牛血清白蛋白(BSA-DNP)，在低对照区涂有25微克/毫升BSA-DNP，并且在分析物结合区(即抗原区)涂有2毫克/毫升的HIV包膜蛋白env-131溶液。这些条带区在测试片上的次序是分析物结合区(即抗原区)最接近偶联物垫片，低对照区位于分析物结合区(即抗原区)和高对照区之间，而高对照区离偶联物垫片最远且离吸收垫片最近。如实施例6所述，对硝酸纤维素片进行涂覆并制备测试片。
对于格式2测试片，偶联物垫片在0.1M磷酸钠(pH 7.4，含0.5M氯化钠、1％(w/v)酪蛋白、1mM EDTA、1％(w/v)Triton X-100、0.1％(w/v)叠氮化钠、0.05％(w/v)硫酸庆大霉素、0.1％(w/v)酵母提取物、0.05％(w/v)大肠杆菌提取物、1％(w/v)BSA、0.3％(w/v)聚乙烯吡咯烷酮、0.05％SDS、2.5％蔗糖和2mg/ml兔IgG)中预封闭，然后在37℃干燥1.5小时。偶联混合物的制备是通过混合0.908毫升实施例3所述的偶联物、1.440毫升实施例5所述的偶联物混合物和1.388毫升10mM硼酸盐(pH 9.0，含0.1％PEG(MW20000))。如实施例6所述，将混合物涂在预封闭过的偶联物垫片上。
对于格式4的测试片，偶联物垫片的制备是通过混合1.0毫升实施例1所述的偶联物、1.0毫升PBS(含20毫克/毫升BSA、2％Triton X-100、5％蔗糖、0.6％聚乙烯吡咯烷酮K-30和4毫克/毫升兔IgG)和0.050毫升20×PBS。如实施例6所述，将混合物涂在预封闭过的偶联物垫片上。
测试是这样进行的将含测试片的测试盒置于ReLIATM仪上，该仪器已被设置好可运行检测HIV的测试并读取数据。按提示，通过加入25微升样品(HIV阳性或HIV阴性)而开始测试，然后加入3滴洗涤缓冲液(PBS，含0.05％TritonX-100，0.5％PEG(20000)，0.1％叠氮化钠和2mM EDTA)。测试片温度被设为37℃，并在15分钟后对测试片进行读数
在上述实施例中，使用单群的偶联于分析物结合剂和对照结合剂的检测剂，显示出优于独立双群式所代表的现有技术。本发明的单群格式的优点在于，它可提高阴性与阳性样品群之间的分离。单群式还通过降低非特异性结合和提供更佳的流动控制机制，改善了截止处的精确度。与双群式方法相比，结果导致更高的分析灵敏度和特异性。
此外，使用多个对照区以及能够将结果表示为相对于对照条带的相对强度，这都有助于分析测试的重复性和精确度。在本发明的单群式方法中，与独立的第一分析物检测颗粒群和对照检测颗粒群相比，这可以通过更佳地控制测试差异的来源而加以实现。当然，尽管含有单群偶联于检测剂的第一分析物结合剂和分析物非特异性试剂在某些情况下是优异的，但是本发明也包括具有多群(两群或更多)偶联于检测剂的第一分析物结合剂和分析物非特异性试剂的例子。
在测试片上对照结合区和分析物结合区相对于流动方向的放置次序，在上述实施例中会影响测试性能。对于Helicobacter pylori和HIV而言，从偶联物垫片至吸收垫片的最佳测试结构似乎都是分析物结合区(即抗原区)、低对照区和高对照区。然而，这并不意味着在其他测试中不能通过不同的区结构来获得最佳结果，因而本发明也具体地包括这些其他配置。
权利要求
1.一种进行侧流分析的方法，其特征在于，它包括让感兴趣分析物与第一分析物结合剂接触，其中第一分析物结合剂和分析物非特异性试剂被偶联于检测剂。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，至少一种第一分析物结合剂或分析物非特异性试剂被共价连于检测剂。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，至少一种第一分析物结合剂或分析物非特异性试剂被非共价偶联于检测剂。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，感兴趣分析物包括蛋白质；糖蛋白；肽；小有机分子；多糖；抗体或其片段；核酸；药物；毒素；病毒或病毒颗粒；细胞壁组份；或其他具有表位的化合物。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，蛋白质包括激素或其他分泌蛋白质、酶和细胞表面蛋白，而抗体包括单克隆抗体和多克隆抗体。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，感兴趣分析物具有免疫原性部分。
7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，测试片包含第一分析物结合剂、检测剂和分析物非特异性试剂。
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，测试片具有膜片。
9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，测试片具有偶联物垫片，偶联物垫片含有第一分析物结合剂、检测剂和分析物非特异性试剂，而且偶联物垫片与膜片接触且位于膜片远端。
10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，测试片具有与膜片复合在一起的保护性盖片。
11.如权利要求1所述的方法，其特征在于，第一分析物结合剂包括针对感兴趣分析物的抗体；具有分析物结合位点的工程化蛋白、肽、半抗原、或裂解物；针对感兴趣分析物的受体；针对感兴趣分析物的配体；或针对感兴趣分析物的抗原。
12.如权利要求11所述的方法，其特征在于，针对感兴趣分析物的抗体包括单克隆抗体、多克隆抗体、或足以结合于感兴趣分析物的抗体片段。
13.如权利要求1所述的方法，其特征在于，检测剂包括颗粒、发光标记物；比色标记物、荧光标记物；化学标记物；酶；放射性标记物；或射频标记物。
14.如权利要求13所述的方法，其特征在于，检测剂包括颗粒。
15.如权利要求14所述的方法，其特征在于，颗粒包括胶体金。
16.如权利要求1所述的方法，其特征在于，分析物非特异性试剂包括抗体、具有对感兴趣分析物的非特异性结合位点的工程化蛋白、可特异结合于除感兴趣分析物之外的配体的受体、可特异结合于除感兴趣分析物之外的受体的配体、抗原、其他有机分子、半抗原、IgG、其他免疫球蛋白、牛血清白蛋白(BSA)、其他白蛋白、酪蛋白、和球蛋白。
17.如权利要求16所述的方法，其特征在于，抗体包括单克隆抗体、多克隆抗体、或足以结合于感兴趣分析物的抗体片段。
18.如权利要求16所述的方法，其特征在于，分析物非特异性试剂包括兔IgG。
19.如权利要求1所述的方法，其特征在于，分析物非特异性试剂包括对照结合剂。
20.如权利要求1所述的方法，其特征在于，对照结合剂包括抗体、具有对感兴趣分析物的非特异性结合位点的工程化蛋白、可非特异结合于除感兴趣分析物之外的配体的受体、可非特异结合于除感兴趣分析物之外的受体的配体、抗原、其他有机分子、半抗原、IgG、其他免疫球蛋白、牛血清白蛋白(BSA)、其他白蛋白、酪蛋白、和球蛋白。
21.如权利要求19所述的方法，其特征在于，对照结合剂包括兔抗-二硝基苯酚IgG。
22.如权利要求7所述的方法，其特征在于，测试片具有至少一个检测区。
23.如权利要求22所述的方法，其特征在于，至少一个检测区包含至少一个测量区。
24.如权利要求23所述的方法，其特征在于，至少一个测量区包含至少一个分析物结合区和至少一个对照区。
25.如权利要求24所述的方法，其特征在于，对照区含有对照剂。
26.如权利要求25所述的方法，其特征在于，对照剂特异地结合于对照结合剂，但不特异地结合于感兴趣分析物或第一分析物结合剂，对照结合剂也不特异结合于第二分析物结合剂。
27.如权利要求26所述的方法，其特征在于，对照剂包括可偶联于BSA的二硝基苯酚。
28.如权利要求25所述的方法，其特征在于，对照剂包括不特异结合于感兴趣分析物的抗体；具有非特异性结合位点的工程化蛋白、肽、半抗原、或裂解物；对感兴趣分析物非特异的受体；对感兴趣分析物非特异的配体；或对感兴趣分析物非特异的抗原。
29.如权利要求24所述的方法，其特征在于，分析物结合区包含第二分析物结合剂。
30.如权利要求29所述的方法，其特征在于，第二分析物结合剂包括针对感兴趣分析物的抗体；具有分析物结合位点的工程化蛋白、肽、半抗原、或裂解物；针对感兴趣分析物的受体；针对感兴趣分析物的配体；或针对感兴趣分析物的抗原。
31.如权利要求7所述的方法，其特征在于，测试片具有多个对照区。
32.一种在包括测试片的侧流分析中提高测试平均阳性结果和测试平均阴性结果之间差异的方法，其特征在于，它包括在空间上重新排列测试片上一个或多个对照结合区相对于分析物结合区的位置。
33.一种在包括测试片的侧流分析中降低侧流分析的变差系数的方法，其特征在于，它包括在空间上重新排列测试片上一个或多个对照结合区相对于分析物结合区的位置。
34.一种在侧流分析中提高侧流分析重复性的方法，其特征在于，它包括定量位于第一对照区中的第一数量的检测剂；定量位于第二对照区中的第二数量的检测剂；将定量的第一和第二数量的检测剂映射到相对标尺上，得到检测剂的第一相对数量和第二相对数量；以及所进行的映射使得定量的第一数量检测剂与第二数量检测剂之比大于第一相对数量检测剂与第二相对数量检测剂之比。
35.如权利要求34所述的方法，其特征在于，定量的第一数量检测剂与定量的第二数量检测剂之比至少约为5∶1，而第一相对数量检测剂与第二相对数量检测剂之比至少约为3∶1。
36.一种侧流分析，它包括测试片，其特征在于，该测试片包括偶联于检测剂的分析物结合剂和分析物非特异性试剂。
37.如权利要求36所述的侧流分析，其特征在于，至少一种分析物结合剂或分析物非特异性试剂被共价连于检测剂。
38.如权利要求36所述的侧流分析，其特征在于，至少一种分析物结合剂或分析物非特异性试剂被非共价偶联于检测剂。
39.如权利要求36所述的侧流分析，其特征在于，感兴趣分析物包括蛋白质；糖蛋白；肽；小有机分子；多糖；抗体或其片段；核酸；药物；毒素；病毒或病毒颗粒；细胞壁组份；或其他具有表位的化合物。
40.如权利要求39所述的侧流分析，其特征在于，蛋白质包括激素或其他分泌蛋白质、酶和细胞表面蛋白，而抗体包括单克隆抗体和多克隆抗体。
41.如权利要求36所述的侧流分析，其特征在于，感兴趣分析物具有免疫原性部分。
42.一种试剂盒，其特征在于，它包含权利要求36所述的侧流分析。
43.一种方法，它包括进行侧流分析以测定与人类疾病、或兽医、食品测试、农业和精细化学应用有关的感兴趣分析物，其特征在于，该侧流分析是权利要求36所述的侧流分析。
44.如权利要求1所述的方法，其特征在于，第一分析物结合剂和分析物非特异性试剂在进行侧流分析之前被偶联于检测剂。
全文摘要
公开了一种侧流分析,它包括将分析物结合剂和分析物非特异性试剂偶联于检测剂。还公开了制备和使用该分析的方法,以及改进这类分析的性能的方法。
文档编号G01N33/543GK1254844SQ9912437
公开日2000年5月31日 申请日期1999年11月23日 优先权日1998年11月23日
发明者A·J·波利托, R·M·塞耶, R·K·德尼罗, G·H·谢拉 申请人:普莱克斯生物系统股份有限公司