一种六神曲发酵过程近红外在线质量检测方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及一种六神曲发酵过程近红外在线质量检测方法。
【背景技术】
[0002] 六神曲是一味最具代表性的传统中药发酵炮制品，是由苦杏仁、赤小豆、鲜青富、 鲜苍耳草、鲜辣寥等，加入面粉（或麦款）混合后经发酵而制成的曲剂，历史悠久，应用广 泛。
[0003] 发酵技术在中药炮制过程中的应用具有悠久的历史，它是指在一定的湿度和温度 条件下，经处理或净制后的药材或药材拌加辅料等，利用酶和微生物的分解催化作用，使药 物发泡、生衣的炮制方法。
[0004] 目前，对六神曲的传统发酵炮制过程的控制多凭借主观经验，控制技术滞后，缺乏 客观的指标和有效的方法，六神曲发酵产品的质量稳定性不佳，不同批次产品之间的质量 差异较大。采用现代发酵工艺生产的六神曲及其他中药发酵炮制品，也仅仅是对发酵过程 的温度、湿度等工艺参数进行控制，而对生产的主体一-处于动态变化的发酵物料并不进 行相关质量指标的检测，待发酵结束后才对产品进行质量控制指标的检测，判断产品是否 合格，而此时发酵炮制品的质量已然形成，即使产品不合格此时也无法施加影响。因此，目 前六神曲的发酵工艺中尚无法通过生产过程的控制来改变发酵炮制品的质量，推动其朝向 合格的方向发展。
[0005] 此外，传统发酵工艺生产的六神曲质量的鉴定尚无完善的指标。近些年，针对六神 曲的质量控制开展了大量研究工作，目前的研究多集中在将淀粉酶与蛋白酶活性作为六神 曲的质量控制指标。淀粉酶与蛋白酶活力的测定有多种方法，常用的有化lin-酪法与DNS 法，该些方法均需耗费一定的时间，且均用于对发酵炮制最终产品的质量控制，而无法对六 神曲的生产过程进行有效控制。
[0006] 为了实时了解发酵过程中间产品质量的动态变化，有利于通过工艺参数的控制优 化中间产品质量的发展方向，从而提高终产品的质量合格率，需要建立一种六神曲发酵过 程质量指标的在线检测方法。
【发明内容】
[0007] 本发明的目的在于提供一种六神曲发酵过程质量指标的在线检测方法，从而有利 于实时了解发酵过程中间产品质量的动态变化，有利于通过工艺参数的控制优化中间产品 质量的发展方向，从而提高终产品的质量合格率。
[000引本发明的目的是通过如下技术方案实现的：
[0009] 一种六神曲发酵过程中质量指标的在线检测方法，包括如下步骤：
[0010] (1)在六神曲发酵过程不同时间点取样；
[0011] (2)采用漫反射方式获取每个样品的近红外光谱数据；分别测定每个样品的蛋白 酶活力和/或淀粉酶活力；
[0012] (3)采用最小二乘支持向量机法（Least squares-suppo;rt vector machine, LS-SVM)、偏最小二乘法（Partial Least Squares method,化巧或神经网络 (Neutral network)建立样品的近红外光谱数据与蛋白酶和/或淀粉酶活力之间的关系， 优选采用最小二乘支持向量机法，得到基于近红外光谱的酶活力预测模型；
[0013] (4)采用上述基于近红外光谱的酶活力预测模型实现六神曲发酵过程中质量指标 的在线检测。
[0014] 所述质量指标通常是指酶的活力，如蛋白酶和/或淀粉酶的活力。
[0015] 步骤（1)中，所述六神曲发酵过程可采用常规方法进行，例如采用传统多菌种混 合的自然发酵。
[0016] 在本发明优选的实施方案中，所述六神曲发酵为采用单菌种的纯种发酵。与传统 的自然发酵相比，纯种发酵的过程不会发生其他微生物污染，物料中酶活力不断升高，从而 避免不断升高的酶活力受到干扰。不同时间点样品的酶活力从零逐渐增加到最大值，酶活 力分布范围较广，有利于提升所建模型的稳健性。
[0017] 所述菌种可W为本领域常规使用的发酵菌种，例如枯草芽抱杆菌炬acillus subtilis)、毕赤酵母（Pichia Hansen)、赛氏曲霉（Aspergillusversicolor)等。
[0018] 步骤（1)中，所述六神曲发酵过程的取样，可W是在同一六神曲发酵过程中取样， 也可W在同时或先后进行的不同的六神曲发酵过程中取样，没有具体限制，只要能够得到 酶活力所处的不同阶段且构成范围足够大的样品即可。
[0019] 步骤（1)中，所述六神曲发酵过程多于一个时，各六神曲发酵过程可采用相同或 不同的发酵培养基，优选采用不同的发酵培养基。采用不同的培养基，一方面可进一步扩大 样品中淀粉酶和蛋白酶活力的分布范围，另一方面，从不同培养基的发酵过程中的不同时 间点取样，所得样品用于蛋白酶和淀粉酶分析时，其背景不同，进一步扩大了预测模型的适 用范围。
[0020] 所述发酵培养基可采用任何常规使用的培养基，例如面粉、麦款或根据需要采用 二者不同比例的混合物。
[0021] 在本发明一种优选的实施方案中，分别采用面粉与麦款1:1的混合物和全面粉进 行六神曲的发酵过程，并从该两个不同发酵过程中的不同时间点取样。
[002引步骤（1)中，所述样品的取样时间点没有严格要求，只要能够得到酶活力所处的 不同阶段且构成范围足够大的样品即可。
[0023] 优选地，W发酵全程时间的1/50-1/15,优选为发酵全程时间的1/40-1/20,更优 选为发酵全程时间的1/35-1/25为间隔时间取样；每次取样量为1-20个，优选为1-15个， 更优选为1-10个，再优选为1-8个。该样的取样方式可W保证所取的样品的酶活力所处的 阶段不同且构成范围足够大，使样品中酶活力分布足够均匀，W利于建立可靠的模型。
[0024] 步骤（2)中，优选地，所述近红外光谱的波长范围选自400-2500nm波长范围内。
[0025] 步骤（2)中，淀粉酶活力、蛋白酶活力均为六神曲发酵过程中最常用的质量检测 指标。可W根据实际需要选择采用的哪种指标，例如可淀粉酶活力、蛋白酶活力其中之 一作为检测指标，也可W同时测定淀粉酶和蛋白酶二者的活力作为检测指标。
[0026] 步骤（2)中，所述蛋白酶活力和淀粉酶活力可采用本领域已有的测定方法。优选 地，采用化lin-酪法测定样品的蛋白酶活力，采用DNS法测定样品的淀粉酶活力。该两种 方法的具体操作方法是本领域技术人员熟知的，在此不寶述。
[0027] 步骤（3)中，所述最小二乘支持向量机法、偏最小二乘法和神经网络均具有本领 域公知的含义。
[002引其中，最小二乘支持向量机法是支持向量机法的拓展之一，它将支持向量机 (Suppcxrt vector machine)中的不等式约束改为等式约束，且将误差平方和损失函数作 为方法建立的代价度量，把求解二次规划问题转化为求解线性方程组问题，提高了求解 的速度和收敛的精度。其具体方法为，首先用非线性映射函数(.)把样本从原始空间 映射到特征空间华（.），在高维特征空间构造最优化目标函数，用拉格朗日法进行目标函 数的转换，最后由最小二乘法求出模型的参数，得到预测模型，例如文献Least Squares Support Vector Machines (J. A. K. Suykens, T. Van Gestel, J. De Brabanter, B. De Moor, J. Vandewalle,, World Scientific, Singapore, 2002 (ISBN 981-238-151-1), pp. 98-99)所记 载的方法：
[0029]
【主权项】
1. 一种六神曲发酵过程中质量指标的在线检测方法，包括如下步骤： (1) 在六神曲发酵过程不同时间点取样； (2) 采用漫反射方式获取每个样品的近红外光谱数据；分别测定每个样品的蛋白酶活 力和/或淀粉酶活力； (3) 采用最小二乘支持向量机法、偏最小二乘法或神经网络，优选采用最小二乘支持向 量机法建立样品的近红外光谱数据与蛋白酶、和/或样品的近红外光谱数据与淀粉酶活力 之间的相关关系，得到基于近红外光谱的酶活力预测模型； (4) 采用上述基于近红外光谱的酶活力预测模型实现六神曲发酵过程中质量指标的在 线检测。
2. 根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，步骤（1)中，所述六神曲发酵为采用 单菌种的纯种发酵。
3. 根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，步骤（1)中，所述六神曲发酵过程分 别采用面粉与麦麸1:1的混合物、全面粉两种培养基进行发酵，并从所述两个发酵过程中 的不同时间点取样。
4. 根据权利要求1-3任一项所述的检测方法，其特征在于，步骤（1)中，以发酵全程时 间的1/50-1/15,优选为发酵全程时间的1/40-1/20,更优选为发酵全程时间的1/35-1/25 为间隔时间取样；每次取样量为1-20个，优选为1-15个，更优选为1-10个，再优选为1-8 个。
5. 根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，步骤（2)中，所述近红外光谱的波长 范围选自400-2500nm波长范围内。
6. 根据权利要求5所述的检测方法，其特征在于，步骤（2)中，采用Folin-酚法测定样 品的蛋白酶活力，采用DNS法测定样品的淀粉酶活力。
7. 根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，步骤（3)中，近红外光谱数据采用 MATLAB R2011b分析软件进行处理，采用扩展多元散射校正法对光谱数据进行预处理。
8. 根据权利要求7所述的检测方法，其特征在于，步骤（3)中，将取样的样本划分入校 正集与验证集，以校正集样本的化学测量值与模型预测值的相关系数Rc和校正均方差作 为指标评价模型的拟合效果及内部稳健性，以验证集样本的化学测量值与模型预测值的相 关系数Rp和预测均方差为指标评价模型的预测性能。
9. 根据权利要求8所述的检测方法，其特征在于，采用Kennard-Stone样本划分法将取 样样本划分入校正集与验证集。
10. 根据权利要求9所述的检测方法，其特征在于，步骤⑶中，可以采用5折交叉验证 法、10折交叉验证法或20折交叉验证法，优选采用10折交叉验证法，选择模型的最佳潜变 量因子数。
【专利摘要】本发明公开了一种六神曲发酵过程中质量指标的在线检测方法，包括：(1)在六神曲发酵过程不同时间点取样；(2)采用漫反射方式获取每个样品的近红外光谱数据；分别测定每个样品的蛋白酶活力和/或淀粉酶活力；(3)采用最小二乘支持向量机法、偏最小二乘法或神经网络，优选采用最小二乘支持向量机法建立样品的近红外光谱数据与蛋白酶、和/或样品的近红外光谱数据与淀粉酶活力之间的相关关系，得到基于近红外光谱的酶活力预测模型；(4)采用上述基于近红外光谱的酶活力预测模型实现六神曲发酵过程中质量指标的在线检测。本发明方法具有实时、快速，可用于生产过程质量控制，应用范围广、适用性好等优点。
【IPC分类】G01N21-359
【公开号】CN104596984
【申请号】CN201510002633
【发明人】史新元, 戚岑聪, 林兆洲
【申请人】北京中医药大学
【公开日】2015年5月6日
【申请日】2015年1月5日