一种用于监测血管重构现象的方法与试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种用于监测血管重构现象的方法，以及涉及相应的用于监测血管重 构现象的试剂盒。
【背景技术】
[0002] 冠脉血管架桥是将病人自体静脉移植到冠状动脉替代原有病变的动脉血管的一 种常见外科手术方法，是目前临床治疗因冠脉粥样硬化导致心肌梗死最重要手段之一。由 于移植血管在一年内有15%、3~5年内有30%、5~10年内有50%的移植血管出现重阻 塞，导致移植手术最终失败，给家庭、给社会以及经济造成很到损失。人们对于如何防止移 植后血管重阻塞的机制迄今仍不清楚。
[0003] 目前，人们普遍认为，移植血管组织重构主要是由于血管平滑肌细胞的增殖过多、 死亡过少而形成，因而人们对移植血管的病理生理变化的干预研宄要么只是监视细胞增殖 及相应机制，要么只是观察血管组织的细胞死亡及机制。
【发明内容】
[0004] 本发明突破了传统上对于血管重构现象只监视细胞增殖或者只监视细胞凋亡的 方法，首次提出了一种新的用于监控血管重构现象的方法，同时对细胞增殖和细胞凋亡进 行观察，能够更有效地对移植血管的病理生理变化进行干预研宄。
[0005] 本发明所述的用于监测血管重构现象的方法是基于发明人的最新研宄成果，即血 管重构（包括移植静脉动脉化以及移植静脉粥样硬化过程）并不只是过去人们认识的细胞 过度增生而细胞凋亡抑制，而是细胞大量增生的同时，细胞凋亡也大量出现。本发明的实验 结果表明：一部分细胞（原来存在于血管壁上的干细胞或成纤维细胞）接受外来刺激后立 马开始分化和增生，继而开始合成大量的细胞外基质，分布到细胞外的血管膜上，使得血管 壁快速增加变厚，以快速抗衡和适应外来压力对管壁的伤害。与此同时，原有的血管壁上的 成熟的平滑肌细胞在突发外来伤害因素（如高血压产生的机械牵张力以及糖尿病高血糖 产生的AGEs等）作用下，细胞出现损伤进而通过凋亡的形式而被清除。在通过凋亡清理完 第一批受损伤细胞后，新生的细胞在经历了大量细胞外基质合成后亦会变得衰老，最终也 会通过凋亡的形式而被清除。只要外来伤害因子持续存在，血管的细胞（干细胞等）会不 断被激活而出现细胞的增殖和合成细胞外基质，血管也随之变厚，同时完成了功能的细胞 亦会衰老并经由凋亡途径而被清除。如此出现了血管中既可见有细胞大量增殖，亦可见其 它细胞出现大量凋亡。因而，细胞增殖越多，细胞调亡也就越多，最终血管重构速度也就越 快。由此建立本发明所述的用于监测血管重构现象的方法，通过对细胞增殖和凋亡同时原 位三重检测（增殖细胞、凋亡细胞和静息细胞）来更有效和更准确的监测血管重构现象。
[0006] 根据本发明的一个【具体实施方式】所述的用于监测血管重构现象的方法，包括以下 步骤：
[0007] A.体外培养的血管平滑肌细胞进行因素处理而制备成细胞爬片；
[0008] B.用清洗液清洗，加入固定液覆盖染色标本，置于_20°C固定10分钟；
[0009] C.用清洗液清洗，加入脱膜液覆盖染色标本，20_25°C孵育10分钟；
[0010] D.用清洗液清洗，加入封闭液覆盖染色标本，置于湿盒中孵育30分钟；
[0011] E.用含1 % BSA的PBS缓冲液稀释细胞核增殖抗原Ki67,稀释浓度为1 :200,将稀 释好的液体覆盖染色标本，置于湿盒中4°C孵育过夜；
[0012] F.用清洗液清洗，加入Cy3标记荧光二抗，参考稀释浓度为1 :200,置于湿盒内室 温孵育2小时；
[0013] G.用清洗液清洗，加入预先配制的体积比为1 :9的凋亡酶试剂和凋亡标记试剂， 20-25 °C保持1小时；
[0014] H.用稀释浓度为I :200的细胞核复染试剂进行复染，20-25°C染色10分钟，用清 洗液清洗；
[0015] I.甘油封片，焚光显微镜观察。
[0016] 根据本发明的另一个【具体实施方式】所述的用于监测血管重构现象的方法，包括以 下步骤：
[0017] A.将血管组织制备成石蜡切片；
[0018] B.石蜡切片于60°C烤片2小时，依次置于二甲苯、100%乙醇、95%乙醇、75%乙 醇、50%乙醇和去离子水中各3分钟；
[0019] C.用清洗液清洗，加入固定液覆盖染色标本，置于湿盒内孵育30分钟；
[0020] D.用清洗液清洗，加入封闭液覆盖染色标本，置于湿盒中孵育2小时；
[0021] E.使用含1 % BSA的TBS缓冲液稀释细胞核增殖抗原Ki67,稀释浓度为1 :200,将 稀释好的液体覆盖染色标本，置于湿盒中4°C孵育过夜；
[0022] F.用清洗液清洗，加入Cy3标记荧光二抗，参考稀释浓度为1 :200,置于湿盒内 20-25°C孵育2小时；
[0023] G.用清洗液清洗，加入预先配制的体积比为1 :9的凋亡酶试剂和凋亡标记试剂， 20-25 °C保持1小时；
[0024] H.用稀释浓度为I :200的细胞核复染试剂进行复染，20-25°C染色10分钟，用清 洗液清洗；
[0025] I.甘油封片，焚光显微镜观察。
[0026] 根据本发明所述的用于监测血管重构现象的方法的进一步特征，所述清洗液是 PBS缓冲液。
[0027] 根据本发明所述的用于监测血管重构现象的方法的进一步特征，在各步骤中用清 洗液清洗时，至少清洗3次，每次清洗5分钟。
[0028] 根据本发明所述的用于监测血管重构现象的方法的进一步特征，所述固定液是甲 醇，在使用前置于-20 °C预冷。
[0029] 根据本发明所述的用于监测血管重构现象的方法的进一步特征，所述脱膜液是含 有 0· 25% Triton X-100 的 PBS 缓冲液。
[0030] 根据本发明所述的用于监测血管重构现象的方法的进一步特征，所述封闭液是 5% BSA0
[0031] 根据本发明所述的用于监测血管重构现象的方法的进一步特征，所述凋亡酶试剂 是末端脱氧核苷酸转移酶，所述凋亡标记试剂是核苷酸混合物。
[0032] 根据本发明所述的用于监测血管重构现象的方法的进一步特征，所述细胞核复染 试剂为 DAPI，即 4'，6-二脒基 _2_ 苯基吲噪（4'，6-diamidino_2-phenylindole)。
[0033] 本发明的另一目的是提供一种用于监测血管重构现象的试剂盒。
[0034] 本发明所述的用于监测血管重构现象的试剂盒，包括：清洗液，为PBS缓冲液；固 定液，为甲醇；脱膜液，为含有〇. 25% Triton X-100的PBS缓冲液；封闭液，为5% BSA ;抗 体：Ki67 -抗，Cy3标记荧光二抗；抗体稀释液：含1 % BSA的PBS缓冲液；含1 % BSA的TBS 缓冲液；凋亡酶试剂，为末端脱氧核苷酸转移酶；凋亡标记试剂，为核苷酸混合物；细胞核 复染试剂，为DAPI。
[0035] 目前用于监测血管重构现象的试剂盒只有以下两种：（1)检测细胞增殖的；（2)检 测细胞凋亡的。本发明所述的试剂盒不同于现有的两种试剂盒，它能同时检测细胞增殖、细 胞凋亡以及静息状态细胞，对增殖细胞、凋亡细胞和静息细胞进行原位三重检测。
[0036] 本发明所述的试剂盒的应用范围包括：血管重构的调控，包括冠脉架桥后移植血 管的病理生理变化以及诱导向动脉化的检测与观察。静脉移植到冠状动脉后在动脉压力作 用下发生结构和功能的变化，在此过程中，血管壁的细胞会出现细胞大量增殖，并合成细胞 外基质大量积存于管壁，于此同时，施行功能后的细胞继而大量凋亡。并且细胞增殖得越 多，凋亡也就越多，结果是移植血管粥样硬化越快。本试剂盒可以检测到上述管壁细胞的变 化，可同时显示增殖细胞、凋亡细胞以及静息细胞。
[0037] 本发明所述的方法与试剂盒的检测原理是：细胞或组织在体内代谢产物的刺激作 用下，会同时发生细胞增殖和凋亡，如果增殖信号强于凋亡信号，细胞向增殖通路发展，相 反，则细胞凋亡，组织内的细胞增殖和凋亡最终将导致组织的结构重构，进而影响功能。本 试剂盒首先通过细胞周期内Ki67抗体和细胞反应，标记增殖细胞，其次使用末端脱氧核苷 酸转移酶和凋亡细胞进行反应，从而标记凋亡细胞，所有细胞核都可与DAPI结合，因而除 了 Ki67和凋亡阳性细胞外其余均为静息细胞。根据细胞核标记细胞计数细胞总数以及各 种细胞在全部细胞中所占比分，进而做到同时观察细胞和组织内增殖、凋亡以及静息细胞 数量和分布情况。
[0038] 适用范围：基础与临床研宄中体外培养细胞爬片、细胞涂片和各类组织切片中的 组织细胞同时出现细胞增殖、凋亡以及静息情况研宄。
[0039] 特异性：本试剂盒主要标记细胞增殖周期中Ki67和凋亡过程中DNA双链片段，从 而可以和细胞坏死以及由细胞毒性药物或辐射导致的DNA单链片段相鉴别，因此特异性较 尚。
[0040] 检测时间：培养细胞因素处理后或血管移植后15~30小时，不包括细胞培养、刺 激、动物模型制备、切片时间。
【附图说明】
[0041] 图1是细胞爬片标本，图中红色箭头所指为Ki67阳性细胞（细胞增殖，红色），绿 色箭头为TUNEL阳性细胞（细胞凋亡，绿色）以及蓝色箭头所指静息细胞。
[0042] 图2是移植静脉石蜡切片标本，图中红色箭头所指为Ki67阳性细胞（细胞增殖， 红色），绿色箭头为TUNEL阳性细胞（细胞凋亡，绿色）以及蓝色箭头所指静息细胞。
【具体实施方式】
[0043] 实施例1 :小鼠颈总动脉压诱导的静脉移植模型实验
[0044] 1.材料：
[0045] 显微止血钳、血管夹、聚乙烯套管、眼科镊、眼科剪。
[0046] 2.方法：
[0047] 手术器械消毒后，麻醉小鼠（10g/L戊巴比妥钠50mg/kg腹腔内注射），同时给予硫 酸阿托品1.7mg/kg肌注（3.4yL/g)以保持呼吸道顺畅。整个手术过程在体视显微镜下操 作。取仰卧位，暴露颈部并固定于手术台上。从小鼠颈中部自下颁骨水平至胸骨顶端的纵 行切口，剪除右侧胸骨乳突肌，尽可能长地分离右侧颈总动脉，8 - 0丝线在其中点两端结 扎后，从中点处剪开。断端穿过聚乙烯套管，用显微止血夹钳夹血管和套管，去掉血管断端 的结扎线，将部分血管外翻套于套管上，8 - 0丝线结