一种三七活血化瘀活性的检测方法
【技术领域】
[0001] 本申请涉及中药材三七的质量控制领域，具体是涉及一种用于评估三七活血化瘀 活性的检测方法，特别是涉及一种三七的抗血小板凝聚的生物活性检测方法。
【背景技术】
[0002] 三七[panax Notogrnseng(Burk)F · H · Chen]又名参三七、田七、南方人参，是五 加科人参属植物，其根、叶、花等均具有药用价值。三七味甘、微苦，性温，归肝、胃、心、小肠 经，具有止血、散瘀、消肿、止痛、补虚、强壮等功效，主治咯血、衄血、外伤出血、跌打肿痛等。 医学家李时珍在《本草纲目》中认为三七能治一切血病。清朝医家赵学敏在《本草纲日拾 遗》中写到："人参补气第一，三七补血第一，味同而功亦等"。三七主产于云南、广西及四川 等地，云南省文山州为其原产地和主产地。据有关文献记载，三七使用历史近600年，栽培 历史近500年。主要含有三七总皂苷及其它物质。根据研究资料证实三七总皂苷能有效改 善血液循环的血流动力学，降低血液粘度，降低血脂等为现在常用药物。三七总皂苷是活血 化淤的药物，已有药物成品。
[0003] 现有技术中李春玲的《三七总皂苷的提取及纯化新工艺研究》中详细介绍了三七 总皂苷的各种提取和纯化工艺。
[0004] 目前评价药物活血化瘀活性的方法有很多，常用的有活化部分凝血酶法（APTT)、 125I-标记栓块溶解法、大鼠急性心肌缺血实验、小鼠急性脑缺血缺氧实验、小鼠体内血栓形 成实验、小鼠断头存活实验、家兔体外抗血小板凝聚实验等。
[0005] 郭玉东等建立了舒血宁注射液（银杏叶提取物）体外抑制血小板聚集的生物活性 测定法用于补充银杏提取物的质量控制方法。主要以抑制家兔血小板聚集作用来考察显示 舒血宁注射液量效关系和效价测定，标准物质选取了金纳多注射液。
[0006] CN1698629A公开了一种三七总皂苷口腔速释制剂，其中每片制剂含有三七总皂苷 0.02-0. 08g。其中三七总皂苷（血塞通）口腔速释制剂的活血化瘀作用的检测方法是采用 TT、PT、APTT、FIB测定试剂盒，来测量对大鼠血凝及血小板聚集的影响，按比浊法测定ADP 诱导的血小板聚集率，ADP的终浓度为6mol/l。然而，该方法也是定性指出三七总皂苷能抑 制ADP诱导的血小板聚集。
[0007] CN1228960A公开一种血塞通胶囊，药液按重量每粒含有三七总皂苷40-250mg，并 含有溶剂和稳定剂。其中采用血小板聚集仪来进行抗凝血实验。然而，该专利仅指出三七 具有抗凝血活性，并没有公开一种简单、廉价、方便的测定三七活性的检测方法，特别是涉 及量反应平行线法。
【发明内容】
[0008] 本申请的目的是提供一种用于评估三七活血化瘀活性的方法，特别是提供一种用 于评估三七生物活性的检测方法。
[0009] 本申请采用量反应平行线法。药物对生物体所引起的反应随着药物剂量的增加产 生的量变可以测量者，称量反应。量反应检测用平行线测定法，要求在一定剂量范围内，S和 T的对数剂量X和反应或反应的特定函数y呈直线关系，当S和T的活性组分基本相同时， 两直线平行。此方法简单易行，平行性好，效率高，成本低廉。
[0010] 具体地，本申请提供一种用于评估三七活血化瘀活性的方法，所述方法以三七抑 制体外血小板聚集的效价P t来评估三七活血化瘀活性，所述P τ按照2010年版《中国药典》 生物检测统计法项下的量反应平行线法（3 ·3)法计算三七供试品的效价及实验误差，可信 限率FL%不得超过40 %，优选地不超过20 %。其中抑制血小板聚集的含三七皂苷类供试品 溶液的浓度在0. l_6mg/mL之间。
[0011] 在本领域中，已有授权专利CN103352069A公开了一种用于评估何首乌及其中药 制剂肝毒性效价检测方法，其生物毒性效价的计算按照量反应平行线法。
[0012] 另有专利CN102662037公开了一种龙血竭的生物活性检测方法，其采用量反应平 行线法来测定龙血竭的血小板抑制率和血浆复钙时间（PRT)。龙血竭为百合科植物剑叶龙 血树的含脂木材经提取得到的树脂，完全不同于三七。
[0013] 现有技术并没有将量反应平行线法用于三七的活血化瘀活性的测定，更没有对于 公开检测方法中具体参数，所述参数对于更直观、快速有效地反应生物活性和疗效至关重 要。
[0014] 本发明另一方面是提供一种经简单、快速提取三七的方法，从而得到苷类，并进行 检测的方法，从而用于评估三七的活血化瘀生物活性。
[0015] 本发明是由以下方案实现的：
[0016] 所述生物活血化瘀效价检测方法包括下述步骤：
[0017] a.配制供试品溶液
[0018] 制备二七提取物；
[0019] 用生理盐水或者磷酸盐缓冲液配置所述三七提取物供试品溶液，优选地用生理盐 水配置所述三七供试品溶液，超声助溶30min后，离心取上清，以微孔滤膜过滤除菌，备用， 优选地用0. 22 μ m微孔滤膜过滤除菌；
[0020] b.配制标准品溶液
[0021] 用生理盐水或者磷酸盐缓冲液配置所述标准物质溶液，所述标准物质为三七皂苷 标准物质按比例混合物、三七总皂苷标准物质、三七总皂苷冻干粉，优选三七总皂苷冻干 粉；
[0022] c.测定
[0023] 将标准物质溶液和血小板悬液两者加入到安瓿瓶中并混匀，然后将所述混匀的悬 液300 μ L加至血小板聚集仪的供试品池中，用血小板聚集仪来记录经标准物质抑制血小 板聚集的曲线；
[0024] 将三七供试品溶液和血小板悬液两者加入到安瓿瓶中并混匀，然后将所述混匀的 悬液300 μ L加至血小板聚集仪的供试品池中，用血小板聚集仪来记录经三七抑制血小板 聚集曲线；
[0025] d.生物活血化瘀效价计算
[0026] Pt=AtXR
[0028] 其中Pt为效价，AT为估计效价，由于目前三七药材及其制剂在《中国药典》2010年 版及国外药典上未见效价的规定，因此假设对照品（S)的A t效价为lOOU/mL ;R是S和T等 反应剂量（ds、dT)的比值，r是S和T相邻高低剂量组的比值（本发明r的比值范围也在 1:0. 7~1:0. 5之间），ds、士为S (标准物质）和T (三七供试品）的等反应剂量。1，2, 3顺 次由小剂量到大剂量。三个剂量对应高、中、低三个药物效应，且应调整S和T最大剂量比 例，保证二者药物效应差别不大。
[0029] 所述方法以三七抑制体外血小板聚集的效价Pt来评估三七活血化瘀活性，所述P τ 按照2010年版《中国药典》生物检测统计法项下的量反应平行线法，通过中国药典生物检 测统计软件计算三七供试品的效价及实验误差，可信限率FL%不得超过40%，优选地不超 过20%其中抑制血小板聚集的含三七皂苷类供试品溶液的浓度在0. 1~6mg/mL之间。
[0030] 其中，如下获得所述未经药物干预的血小板聚集曲线：
[0031] 将血小板悬液放入血小板聚集仪的供试品池中，用血小板聚集仪来记录未经药物 干预的诱导剂诱导的血小板聚集曲线，记录时间为300s，即得到所述未经药物干预的血小 板聚集曲线。
[0032] 在一些实施方式中，所述血小板悬液可以来源于大鼠、家兔和健康的两周内未服 用过抗凝药物的成年人。优选地，血小板悬液来源于大鼠。
[0033] 可以如下获得所述血小板：
[0034] 取动物血样，200Xg离心，吸取上清液作为富血小板血浆（PRP)，剩余全血 2000 X g离心，取上清液即为贫血小板血浆（PPP)。亦可将PRP使用血小板洗涤液洗涤，制 得洗涤血小板。优选，所述取血为大鼠腹腔注射戊巴比妥钠麻醉，以枸橼酸纳抗凝腹主动脉 取血。
[0035] 在一些实施方式中，可以如下获得所述未经药物干预的血小板聚集曲线：
[0036] 将血小板悬液放入血小板聚集仪的供试品池中，用血小板聚集仪来记录未经药物 干预的诱导剂诱导的血小板聚集曲线，记录时间为300s，即得到所述未经药物干预的血小 板聚集曲线。
[0037] 本领域的技术人员应当认识到，获得未经三七干预的血小板聚集曲线是为了检验 实验系统的可行性，亦可获得三七对血小板聚集的抑制率。
[0038] 在一些实施方式中，所述用于获得未经药物干预的血小板聚集曲线或经三七干预 的血小板聚集曲线的血小板数量范围为30-80万/ μ L，优选地为40万/ μ L。
[0039] 发明人通过实验对诱导剂进行了筛选，从ADP、胶原、花生四烯酸、凝血酶筛选出凝 血酶。
[0040] 在一些实施方式中，所述用于获得未经药物干预的血小板聚集曲线或经三七干预 的血小板聚集曲线的诱导剂为凝血酶。
[0041] 在一些实施方式中，所述三七供试品为三七提取物或三七总皂苷提取物。