用于富集和分离具有的浓度在若干对数级上的细胞的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及磁性的流式细胞术。
【背景技术】
[0002]在用于流式细胞术的目前已知方法中，借助于通道中的额外的液体流来使细胞集中在主通道的中心中并且因此被分离(鞘流原理)。此分离使得有可能在后续测量步骤中计数细胞(例如通过光学或阻抗滴定装置)。通过磁性标记待定量的颗粒，有可能在实际定量之前从复杂样本中分离和富集所述颗粒。
[0003]然而，为了维持此技术的功能性，需要产生鞘流的大量的额外液体。此方法还与具有例如稀释步骤和离心步骤的进一步制备相关，这些制备也与污染风险相关。稀释步骤对于使计数率与细胞计数器的(即计数器的)磁传感器的最小和最大计数率匹配而言是必要的。
[0004]待实现的目标在于提供一种装置和一种方法，通过所述装置和所述方法能够更快速地且以更小的污染风险进行细胞术测量，例如，确定细胞样本的浓度。
【发明内容】
[0005]此目标通过根据本申请权利要求1的根据本发明用于流式细胞术测量的装置来实现。此外，所述目标通过根据申请权利要求10的根据本发明的方法来实现。本发明的有利改进由从属权利要求详细说明。
[0006]本发明是基于在闭合系统内进行多个富集步骤的概念。这通过根据本发明的装置的通道的结构设计和通过使用所述通道中的偏转装置而变得可能的。本发明使能进行具有多于10的数次幂的浓度(例如10至10000个细胞/微升)的细胞的靶向富集和分离。特别地，本发明使得有可能能够在单个测量过程中测量可能的多于10的多次幂的细胞浓度。即使在计数器的受限制的动态响应的情况下，这也允许在复杂样本内的单个微流体通道中覆盖较大的动态范围，而无需先前稀释、分离或富集步骤。
[0007]为此目的，根据本发明的用于流式细胞术测量的装置包括室和通道，其中所述通道包括磁传感器并且设置在所述室的下游。所述室和所述通道形成闭合系统，其中所通道的轴线沿着所述通道的流动方向延伸。如果所述室直接汇合至所述通道中，则存在闭合系统。所述装置特征在于磁体，更具体地在于永磁体和偏转装置，所述磁体和所述偏转装置两者均布置在所述通道的预定侧处。在此，所述偏转装置具有至少一个区段。每个区段布置在通道的浓度区域中。每个区段具有用于引导细胞朝向轴线的装置。偏转装置由此能够实现磁性标记细胞的富集，所述细胞通过各个浓度区域中的磁体被拉至通道的一侧，至所述轴线上且这些细胞沿着所述轴线被引导至磁传感器。
[0008]以上论述的目标同样由根据本发明的用于富集对于流式细胞术的细胞样本中待检测的细胞类型的细胞的方法来实现。在此首先提供待检测的细胞类型的磁性标记细胞。标记细胞被富集在根据本发明的装置的实施例的通道中。为此目的，标记细胞借助于通道中的磁体被拉至所述通道的预定侧上。在通道中的层流的情况下，那里的细胞中的至少一些通过偏转装置被引导至轴线，所述轴线沿所述通道的流动方向延伸，并且由此富集在所述轴线上。这使能实现细胞的有效富集。因此，即使复杂样本(即含有许多不同细胞和其它颗粒(例如蛋白质)的未纯化样本)也能够用于无中间步骤的流式细胞术，特别是以未稀释的方式。
[0009]提供磁性标记细胞能够包括标记所述细胞。在此，可使用两种标记变型。
[0010]在第一种变型中，待检测的细胞可在培养步骤中通过在装置的室中混合和/或搅拌标记物(具体地，对于待检测的细胞类型具有特异性的至少一种抗体，所述抗体连接至至少一种磁性标记物)和细胞样本来进行标记。此变型优选地在达14个细胞/微升的较小总细胞浓度的情况下使用。在这种情况下，布置在所述室的侧上的磁体能够有助于混合和/或搅拌过程。
[0011]在所述装置的一个实施例中，磁体对应地布置在所述室的预定侧处，所述磁体有助于混合和/或搅拌过程。
[0012]在具有更大总细胞浓度(例如达16个细胞/微升)的细胞样本的情况下，可替代地，有可能在通道中提供在制备期间对于待检测的细胞类型具有特异性的至少一种抗体，所述抗体与至少一种磁性标记物相连接。当使用布置在通道的一侧上的磁体在所述通道中产生磁场时，抗体在所述通道的所述侧处富集。紧接着，细胞样本被引入至通道中，且由此使至少一种特异性抗体与细胞样本的以层流方式流经所述通道的所述侧的那一部分相接触。因此，在此部分中包含细胞的部分标记，而无需稀释或纯化步骤。因此，在层流系统中实现所需细胞的逐层标记。可替代地，还能够借助于设置在那里的磁体在室中进行此类部分标记。
[0013]因此，在流体流的情况下，仅一层(即细胞样本的限定部分，例如所需细胞的1%)在闭合系统中被磁性标记。
[0014]偏转装置能够具有一个或多个导向元件，其作为用于引导区段中的细胞的装置，所述导向元件例如形成凹槽并且将标记细胞引导至轴线。在根据本发明的装置的尤其有利的实施例中，偏转装置的至少一个区段包括布置成与轴线成角度的导向元件，其作为用于引导细胞的装置。以一起或独立的方式，所述导向元件形成在流动方向上渐缩的至少一个漏斗形状。这使磁性标记细胞能偏转至通道的轴线，且由此使能实现富集。
[0015]以示例的方式，如果它完全或部分地包括铁磁性材料，则在装置的另一实施例中至少一个导向元件能够形成在流动方向上渐缩的V形，从而促进磁性标记细胞的磁泳导向。
[0016]额外地或者可替代地，所述导向元件中的至少两个能够配置成对于多个细胞的壁并且能够布置成在流动方向上沿轴线偏置，且由此形成朝向所述轴线的机械引导，这是凭借形成对于细胞的运动路径的边界来实现的。
[0017]额外地，磁性腹板能够沿通道的轴线布置，特别地设置在相同轴线水平处的两个导向元件之间。因此，促进在通道的轴线上的磁性标记细胞的引导。
[0018]优选地，通道的至少两个浓度区域具有不同的构型。细胞样本能够由此在多个对数级中富集。这样能够实现的是能够通过具有受限制的动态响应的计数器来测量存在的富集。
[0019]以示例的方式，所述至少两个浓度区域能够在预定侧与同所述预定侧相对的一侧之间的通道的预定高度方面有所不同。因此，在每个浓度区域中确定限定体积。不同浓度区域中的不同体积引起在偏转元件中在富集之前通过通道的磁体进行细胞的第一富集，使得统计学上有意义的和限定的细胞数量在给定浓度下的每个富集步骤中是可调整的。
[0020]相比之下，通道宽度优选地对于所有浓度区域是恒定的。在恒定通道宽度的情况下，额外地或可替代地，所述至少两个浓度区域能够在偏转装置的预定宽度(如垂直于轴线所测量的)和/或所述偏转装置沿通道的轴线的各个区段的长度方面有所不同。这些尺寸确定偏转装置的汇流面积，即影响富集的程度。
[0021]在根据本发明的方法的一个实施例中，借助于磁传感器在偏转装置下游的轴线上进行细胞术，具体地细胞计数。使用这样，有可能例如确定细胞样本的浓度。
[0022]在这种情况下，借助于偏转装置下游的细胞术确定细胞样本的浓度优选地包括借助于磁传感器对来自至少一个浓度区域且流经轴线上的富集的细胞进行计数。针对至少一个浓度区域，从在计数富集的细胞时确立的浓度区域的计数值、浓度区域的体积以及浓度区域中的偏转装置的区段的宽度来确立细胞样本的浓度。这是有效和节省时间的测量，其的评估是快速可用的。自然地，在此选择至少浓度区域，针对所述浓度区域出现对于统计学相关陈述而言足够大并且小于由计数器能够可靠记录的最大计数率的计数器值。
[0023]可能需要确立在给定时间当前计数的细胞所属的浓度区域。在所述方法的另一实施例中，针对其确立计数器值的各个浓度区域是基于磁传感器的计数过程的已确立的时间来确立的。因此有可能引起时间间隔分配至校准装置中的浓度区域。在某些情况下应考虑流速。
【附图说明】
[0024]下面，将基于附图以具体的示例性实施例再一次更详细地解释本发明。在附图中:
图1示出根据本发明的装置的实施例在截面中的简图，
图2示出根据本发明的装置的通道的简图，其中图1A示出示意性的截面，且图1B示出通道的示意性顶视图，
图3示出偏转装置的不同实施例的简图，其中图3A示出具有机械导向件的偏转装置的透视图，并且图3B和图3C示出具有磁泳导向件的偏转装置在每种情况下的示意性顶视图，图4示出在根据本发明的方法的实施例中紧接着引入细胞样本之后(图4A)和施加磁场之后(图4B)通道中的细胞样本的简图，
图5示出阐明在根据本发明的方法的实施例中通道中的细胞的富集的简图，其中图5A示出在一个时间点通道的顶视图，且图5B示出在不同时间偏转装置的区段的顶视图，以及图6示出其中在根据本发明的方法的实施例中测定细胞浓度以及在不同时间的通道的四个部段的简图。
【具体实施方式】
[0025]以下更详细解释的示例性实施例代表本发明的优选实施例。在图中，功能上等效的元件具有相同的附图标记。图中的坐标系K和K’帮助定向，其中竖直轴线“z”和与其垂直的水平轴线“X”简化截面中的取向(图1A)，并且其中水平轴线“X”和与水平轴线“X”和竖直轴线“z”垂直的轴线“y”简化示例性通道14的顶视图