一种戊肝IgG抗体检测试剂盒及其制备方法和应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种戊型肝炎病毒（肥V)IgG抗体试剂盒及其检测方法，特别是涉及 一种基于间接标记的非竞争免疫分析原理，定性检测人血清样本中戊型肝炎病毒IgG抗体 的方法及其相应的检测试剂盒。
【背景技术】
[0002] 戊型肝炎是一种由戊型肝炎病毒化巧atitisEVirus,肥V)引起，经粪、口途径传 播的急性肠胃道传染病，主要流行于亚洲、非洲和拉了美洲等发展中国家和地区。戊肝和甲 肝在我国及其他发展中国家均十分常见，10年前，在我国的上海和新疆两地分别发生了甲 肝和戊肝的暴发流行，发病人数均超过10万。两者在临床症状、传播途径W及转归方面极 为相似，但是戊肝发病W青壮年为主，病情较重，病死率较高，特别是孕妇的病死率可高达 10%~40%。戊肝较甲肝患者发病年龄大，病程长，黄痘程度深，与其他肝炎病毒的重叠或 混合感染率高。我国是病毒性肝炎高发区，据统计，在急性病毒性肝炎中，戊型肝炎发病率 为3. 4%~20. 5%，平均为8. 6%，对人民健康与劳动生产力的危害甚大。除了人类可感染 肥V外，近年来还发现猪感染肥V。1997年首次在美国报道，凡大于3周龄的猪100 %都可 检测到抗-肥V、肥VRNA等血清标记物。现已明确全球都存在猪肥V感染，其存在的意义尚 不明确，可能与人类感染有关。
[0003] 肥V成球形，直径27~34nm，基因组是单股正链RNA，长约7. 5kB，由5'非编码区、 编码区和3'非编码区组成。编码区包括3个开放读码框架（0RF)。0RF1位于基因组的5' 端，长5,079bp，为非结构区基因，编码病毒复制所需要的RNA聚合酶、蛋白酶和解旋酶等； 0RF2及0RF3位于基因组的3'端，0RF2长1，98化P，编码病毒的结构蛋白；0RF3长369bp， 含有可被中和抗体所识别的抗原表位。随着戊型肝炎病毒分子克隆技术的成功建立，W重 组蛋白作为抗原来检测肥V抗体的技术正在逐步完善，同时肥V的生物学性状也在进一步 了解中。
[0004] 目前，国内外尚未有W铜系元素标记的间接法测定戊型肝炎病毒IgG抗体的技术 用于检测人血清IgG抗体的报道。
[0005] 本试剂盒采用时间分辨免疫英光分析法（Time-resolvedImmunofluorometric Assay,TRIFMA)，应用铜系元素作为示踪剂，标记抗原或抗体，根据铜系元素莖合物的发光 特点，用时间分辨技术测量英光，同时检出波长和时间两个参数进行信号分辨，可有效地排 除非特异性英光的干扰，极大的提高了灵敏度，具有特异性强、稳定性好、精密性高、重复性 好等优点。虽然时间分辨免疫英光分析法相对传统的RIA(RadioImmunoassay,放射免疫分 析）或E1LISA巧nzyme-linkedImmuno油sorbentassay,酶联免疫分析）检测灵敏度有很大 的提高，与化IA烟lemiluminescenceImmunoassay,化学发光免疫）相比也有一定的优势， 但也存在一些缺点，如对环境洁净程度要求较高，因为空气中灰尘可能会导致本底偏高。
【发明内容】
[0006] 本发明要解决的技术问题是提供一种基于稀±元素标记的间接法测定戊型肝炎 病毒IgG抗体的方法及其相应的检测试剂盒。该检测试剂盒克服了大分子（如；酶）标记 抗体的缺点，具有灵敏度高、稳定性好、成本低廉等优点，从而显著改善了戊型肝炎病毒IgG 抗体检测的特异性、灵敏度和稳定性，同时大幅降低了成本。
[0007] 为解决上述技术问题，本发明提供一种戊肝IgG抗体检测试剂盒，所述试剂盒包 括W下组分：
[000引包被反应板；包被肥V基因重组抗原的固相材料；
[000引标记物：用信号生成物质标记的鼠抗人IgG单克隆抗体；
[0010] 浓缩洗液：含Tween-20、防腐剂的Tris缓冲液；
[0011] 增强液；含有邻苯二甲酸氨钟、冰醋酸、曲拉通、莖合剂组分，将信号生成物质解离 到溶液中，便于检测英光信号；
[001引分析缓冲液；含化C1、酪蛋白钢盐、防腐剂，用于稀释标记物；
[001引样本稀释液；含化C1、酪蛋白钢盐、防腐剂，用于标本的稀释；
[0014] 阴性对照：含磯酸盐、小牛血清，用于验证临床标本的无反应性；
[0015] 阳性对照；含磯酸盐、小牛血清和肥V-IgG抗体，用于验证临床标本的有反应性。
[0016] 作为本发明优选的技术方案，所述肥V基因重组抗原的包被浓度为150-4(K)ng/ mL。
[0017] 所述信号生成物质，包括：酶、英光物质、稀±离子、化学发光物质、电化学发光物 质；其中，酶，包括：辣根过氧化物酶、碱性磯酸酶；英光物质，包括：异硫氯酸英光素FITC、 英光素；稀±离子，包括：Eu3\Sm3+Jb3\Dy3+及其莖合物配基；化学发光物质，包括；丫巧醋 及其衍生物；电化学发光物质，包括；多环芳姪类、醜阱类、联化巧类化合物W及Η联化巧 钉邮(bpy)3]2+。
[0018]作为本发明优选的技术方案，所述标记物为馆标记物20X，是保存于化is缓冲液 中的Eu3+标记的鼠抗人IgG单克隆抗体，临用前1:20稀释使用。
[0019] 所述肥V基因重组抗原包括通过基因工程技术制备的戊型肝炎病毒基因重组抗 原，或通过合成方法制备的戊型肝炎病毒基因重组抗原；所述固相材料包括；微孔反应板、 试管、塑料颗粒或塑料微粒、磁微粒、或其它不同大小、形状的塑料制品。
[0020] 此外，本发明还提供一种上述试剂盒的制备方法，包括如下步骤：
[0021] 第一步，制备包被肥V基因重组抗原的固相材料；
[0022] 第二步，用信号生成物质标记鼠抗人IgG单克隆抗体。
[0023] 第一步具体步骤包括：
[0024] (1)将肥V基因重组抗原溶解于包被缓冲液后，浸泡固相材料，静置20~30小时； 其中，包被缓冲液是0. 1MP册.0 (±0. 2)的PBS，包被体积为100μL/孔缓冲液，其中，该缓 冲液中含有：0.01%SDS;
[002引 似用含表面活性剂的缓冲液洗涂步骤（1)制备的肥V基因重组抗原包被的固相 材料后，加入含酪蛋白的缓冲液（即封闭液），室温静置18~24小时，其中酪蛋白的缓冲 液包含了 0. 05mol/L抑7. 8 + 0. 2,含0. 5%酪蛋白钢盐、10%藏糖、0. 05%Nar^的TSA缓冲 液；
[0026] (3)弃去缓冲液，干燥固相材料，从而完成肥V基因重组抗原包被固相材料的制 备。
[0027] 在第二步中，将抗小分子物质抗体或其他能与小分子结合的物质，通过过贿酸钢 法与酶结合在一起；或将抗小分子物质抗体或其他能与小分子结合的物质与带有反应官能 团的英光物质或化学发光物质混合，使它们结合在一起。在双功能官能团存在下，将抗小分 子物质抗体或其他能与小分子结合的物质与酶、英光物质或化学发光物质混合，使它们结 合在一起。标记的方法包括：
[002引 （1)基于有机化学原理的小分子物质与蛋白质或多肤之间的连结方法；
[0029] 如直接使用连接有反应活性官能团的小分子物质与TP抗原反应；或通过活化方 式（如活化撰基为駿基）在小分子物质或TP抗原引入反应活性官能团，再与TP抗原或小 分子物质反应；
[0030] (2)基于酶化学和基因重组技术的小分子物质与蛋白质或多肤之间的连结方法。 如通过酶化学和基因重组技术直接在重组TP抗原上引入小分子物质，完成重组TP抗原的 标记。
[0031] 作为本发明优选的技术方案，第二步具体为：
[003引 （1)将鼠抗人IgG单克隆抗体用超纯水调整至1. 0~4.Omg/mU温度为20~25°C 范围内，透析过夜；
[003引 似室温条件下，按照标馆比例1:2~1:4(馆：蛋白），用纯化水完全溶解 化-DTTA，滴加到透析后的鼠抗人IgG单克隆抗体溶液中，揽拌混匀5-10分钟，然后室温避 光静置24小时±2小时；
[0034] (3)待标记物反应时间完成后，采用层析柱分离，分管收集流出液，流出液即为馆 标记原液。
[0035] 此外，本发明还提供该试剂盒在检测戊肝IgG抗体中的应用，包括如下步骤：
[0036] 第一步，在所述包被肥V基因重组抗原的固相材料中先加入样本稀释液，然后将 样品或阴阳性对照按顺序加入相应微孔，再于室温下振荡反应；
[0037] 第二步：在微孔内加入用信号生成物质标记的鼠抗人IgG单克隆抗体后，室温振 荡；
[0038] 第Η步，在每个微孔内加入增强液，室温振荡；
[0039] 第四步，用时间分辨英光检测仪进行英光强度测定。
[0040] 上述应用的原理是；利用固相材料表面的肥V基因重组抗原及小分子物质标记的 二抗（鼠抗人IgG单克隆抗体）与样本中的抗人肥VIgG抗体发生免疫反应，形成夹必复 合物；固相肥V抗原一抗-肥VIgG-馆标记物巧标记的鼠抗人IgG单克隆抗