一种同时测定山楂中芦丁和槲皮素含量的方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于检测分析技术领域，涉及化学物质的高效液相色谱法，特别涉及一种 同时测定山楂中芦丁和槲皮素含量的方法。
【背景技术】
[0002] 山楂为蔷薇科植物山里红（Crateguspinnatif idaBge · var ·ma jorN·E · Br ·)或山楂 (CrateguspinnatifidaBge.)的干燥成熟果实。味酸、甘，性微温，归脾、胃、肝经;具有消食 健胃、行气散瘀、化浊降脂的功效，用于肉食积滞、胃脘胀满、泻痢腹痛、瘀血经闭、产后瘀 阻、心腹刺痛、胸痹心痛、疝气疼痛、高脂血症（国家药典委员会.中华人民共和国药典（一 部）[M].北京：中国医药科技出版社，2010:29-30)。山楂中主要含有黄酮类、有机酸类化学 成分，其中黄酮类化合物含量较高，包括牡荆素、牡荆素鼠李糖苷、金丝桃苷、槲皮素、芦丁 等。现代药理活性研究表明山楂中黄酮类成分具有降压、降血脂、治疗高脂血症急性坏死性 胰腺炎以及抗氧化的作用，并且广泛应用于临床(李敏，霍燕燕，刘梅，等.山楂总黄酮提取 及其抗氧化作用[J].光谱实验室，2013，30(6) :3145-3148)。临床研究验证山楂黄酮提取物 具有抗癌作用(柳嘉，DavidGlenPOPOVICH，景浩.山楂黄酮提取物的抗氧化活性和对癌细胞 生长抑制作用[J].食品科学，2010,31(3) :220-223)，对预防心肌缺血也有较好作用(周玲， 邓琳，赵浞.山楂总黄酮抗心肌缺血作用及机制[J].中国生化药物杂志，2011，32(6):475-477)。
[0003] 鉴于山楂中芦丁和槲皮素的药用范围非常广泛，为了有效地评价山楂及其相应制 剂的质量，有必要研究并开发一种同时测定山楂中芦丁和槲皮素含量的方法。
【发明内容】
[0004] 本发明人通过大量试验研究并摸索，最终建立了一种可同时测定山楂中芦丁和槲 皮素含量的高效液相色谱法，该法测定快速、简单，准确性高、重现性好，填补了现有技术的 空白。
[0005] 因此，本发明的目的在于提供一种同时测定山楂中芦丁和槲皮素含量的方法。具 体地，本发明的目的是这样实现的：
[0006] -种同时测定山楂中芦丁和槲皮素含量的方法，采用高效液相色谱法，以流动相A 和流动相B进行梯度洗脱，按体积比计流动相的梯度设置如下：
L0008J 所述的流动相A为甲醇，所述的流动相B为磷酸水浴液，所述的磷酸水浴液的质量 分数为0.4%~0.8%。
[0009]进一步地优选地，如上所述同时测定山楂中芦丁和槲皮素含量的方法，按体积比 计流动相的梯度设置如下：
L0011J 所述的磷酸水浴液的质量分数为〇. 5%。
[0012] 进一步地优选地，如上所述同时测定山楂中芦丁和槲皮素含量的方法，其中所述 高效液相色谱法的色谱柱选用AgiLentEcLipseXDB_C18柱(250mm X 4.6mm，5μηι)。
[0013] 进一步地优选地，如上所述同时测定山楂中芦丁和槲皮素含量的方法，其中所述 高效液相色谱法的检测波长为330-350nm。
[0014] 进一步地优选地，如上所述同时测定山楂中芦丁和槲皮素含量的方法，其中所述 高效液相色谱法的检测波长为340nm。
[0015] 进一步地优选地，如上所述同时测定山楂中芦丁和槲皮素含量的方法，其中所述 高效液相色谱法的的流速为1. OmL/min，柱温为30°C。
[0016] 在本发明的一个最优选的实施例中，如上所述同时测定山楂中芦丁和槲皮素含量 的方法，其中所述高效液相色谱法的色谱柱选用AgiLentEcLipseXDB-C18柱（250mmX 4.6mm，5μηι)，检测波长为340nm，流速为1. OmL/min，柱温为30°C，按体积比计流动相的梯度 设置如下：
[0018] 所述的流动相A为甲醇，所述的流动相B为0.5%质量分数的磷酸水溶液。
[0019] 与现有技术相比，本发明方法简单、准确性高、重复性好，可用于同时测定山楂中 芦丁和槲皮素的含量，为山楂饮片及其相关制剂的质量评价和含量检测提供了快速、准确 的方法。
【具体实施方式】
[0020] 以下通过实施例形式，对本发明涉及的检测方法作进一步的详细说明，但不应将 此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例，凡基于本发明上述内容所实现的技术 均属于本发明的范围。
[0021] 山楂饮片主要含有黄酮及其苷类成分，本文选择黄酮类活性成分芦丁和槲皮素进 行试验，建立用HPLC同时测定山楂中芦丁和槲皮素含量的方法。采用甲醇-0.5%磷酸水溶 液梯度洗脱，出峰较快，精密度、准确度及重复性均良好，为山楂中芦丁和槲皮素的质量评 价提供了 一个可行方法。具体实施如下：
[0022] (1)芦丁对照品溶液的制备
[0023]称取芦丁对照品6. Omg，精密称定6 . lmg，置2mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻 度，摇匀，即得每lmL含3.05mg的芦丁对照品溶液。
[0024] (2)槲皮素对照品溶液的制备
[0025]称取槲皮素对照品5 . Omg，精密称定4.8mg，置2mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容至 刻度，摇匀，即得每lmL含2.4mg的槲皮素对照品溶液。
[0026] (3)混合对照品溶液的制备
[0027] 精密吸取芦丁对照品溶液lmL、槲皮素对照品溶液lmL于10mL容量瓶中，用甲醇溶 液稀释至刻度，即得2种组分的混合对照品溶液(含芦丁浓度为305yg/mL，槲皮素浓度为240 yg/mL)，5°C冷藏保存备用。
[0028] (4)供试品溶液的制备
[0029]取山楂粗粉（过3号筛）约2. Og，置于锥形瓶中，加入50mL甲醇，称重。超声提取 40min，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过。取续滤液，0.45μπι微孔滤膜 过滤，即得供试品溶液。
[0030] (5)色谱条件
[0031 ]色谱柱为AgiLentEcLipseXDB-C18柱（250mmX4·6mm，5μm);流动相:A相为甲醇， Β相为0.5 %磷酸水溶液，洗脱梯度:0~15min，甲醇-0.5 %磷酸水(20:80); 16~25min甲醇-0 · 5%磷酸水(40:60);检测波长:340nm;流速1 · Oml/min;柱温:30°C;进样量:20yL。
[0032]以供试品溶液为样品，按照上述色谱条件进行分析，取20yL进样，结果芦丁在 5.2min时达到最大洗脱峰，槲皮素在15.6min时达到最大洗脱峰，出峰时间在25min内，且两 峰出峰时间分布均匀，分离度好。
[0033] (6)线性关系考察
[0034] 精密吸取混合对照品溶液0 · 1、0 · 2、0 · 4、0 · 6、0 · 8、1 · OmL，分别置于20mL容量瓶中 以甲醇稀释至刻度，摇匀，配成不同浓度的对照品溶液，按照步骤(5)的色谱条件进行分析， 分别取20yL进样，记录芦丁和槲皮素的色谱峰面积，结果见表1。以对照品溶液浓度(X)为横 坐标，峰面积为纵坐标(Y)，进行线性回归，得回归方程，结果见表2。
[0035] 表1线性关系考察试验
[0036]
[0037] 表2标准曲线和线性范围
[0038]
[0039] (7)精密度试验
[0040] 精密吸取混合对照品溶液20yL，按步骤(5)的色谱条件平行测定6次，测得芦丁和 槲皮素的峰面积，见表3，结果表明，仪器进样精密度良好。
[0041] 表3精密度试验(n = 6)
[0042]
[0043] (8)重复性试验
[0044] 精密称取同一批次的供试品6份，分别按上述步骤(4)供试品溶液制备方法制备， 测定芦丁和槲皮素的峰面积，见表4,结果证明，此方法重复性良好。
[0045] 表4重复性试验(n = 6)
[0046]
[0047] (9)稳定性试验
[0048]精密吸取同一供试品溶液，分别于0、2、4、6、8、121!进样测定峰面积。测得芦丁和槲 皮素的峰面积，见表5,结果表明，供试品溶液在室温下12h内稳定。
[0049] 表5稳定性试验(n = 6)
[0050]
[0051] (10)加样回收率试验
[0052]分别精密称定已知含量的山楂饮片粉末（含芦丁 0.139mg/g，槲皮素0.078mg/g) (过3号筛)6份，各加入适量的对照品，按步骤(4)方法制备供试品溶液，按步骤(5)的色谱条 件分别进样分析，测定峰面积，计算平均加样回收率和RSD，结果见表6、表7。
[0053] 表6芦丁加样回收率试验(n = 6)
[0054]
[0055] 表7槲皮素加样回收率试验(η = 6)
[0056]
[0057] (11)样品含量测定
[0058]精密称取山楂饮片样品6批，按步骤(4)方法制备供试品溶液，按照步骤(5)的色谱 条件进行测定。记录芦丁和槲皮素的色谱峰面积，根据峰面积积分值，采用外标法计算出各 组分的含量，结果见表8。
[0059] 表8山楂饮片中芦丁和槲皮素的含量测定(η = 6)
[0060]
[0061]
[0062]需要说明的是，本发明在前期的试验中考察流动相系统及比例（甲醇-水、甲醇-0.5 %磷酸水、甲醇-0.1 %磷酸水系统），结果表明甲醇-水(30:70)、甲醇-0.1 %磷酸水(40: 60)等度洗脱效果均不好，出峰时间均大于30min。另外，流动相梯度的选择试验中，发明人 曾考察了0~2011^11甲醇-0.5%磷酸水（25:75)，20~3011^11甲醇-0.5%磷酸水（30:70) ;0-20min甲醇-0.5%磷酸水（22:78)，20~3011^11甲醇-磷酸水（35:65);0-1511^11甲醇-0.5%磷 酸水(20:80)，15-25min甲醇-0.5 %磷酸水(40:60);结果表明以甲醇-0.5 %磷酸水进行梯 度洗脱，0~15min，甲醇-0 · 5 %磷酸水(20:80); 16~25min甲醇-0 · 5 %磷酸水(40:60)，在流 速1 .OmL/min的情况下，梯度洗脱，出峰时间在25min内，且两峰出峰时间分布均匀，分离度 好。
【主权项】
1. 一种同时测定山植中芦下和搬皮素含量的方法，其特征在于，采用高效液相色谱法， W流动相A和流动相B进行梯度洗脱，按体积比计流动相的梯度设置如下：'^所述的流动相为甲醇，所述的流动相B为憐酸水溶液，所述的憐酸水溶液的质量分数为I 0.4% ~0.8%。2. 根据权利要求1所述同时测定山植中芦下和搬皮素含量的方法，其特征在于，按体积 比计流动相的梯度设置如下：所述的憐酸水溶液的质量分数为0.5 %。3. 根据权利要求1所述同时测定山植中芦下和搬皮素含量的方法，其特征在于，所述高 效液相色谱法的色谱柱选用AgiLent EcLipse XDB-C18柱(250mmX4.6mm，5皿）。4. 根据权利要求1所述同时测定山植中芦下和搬皮素含量的方法，其特征在于，所述高 效液相色谱法的检测波长为330-350nm。5. 根据权利要求4所述同时测定山植中芦下和搬皮素含量的方法，其特征在于，所述高 效液相色谱法的检测波长为340nm。6. 根据权利要求1所述同时测定山植中芦下和搬皮素含量的方法，其特征在于，所述高 效液相色谱法的的流速为1. OmL/min，柱溫为30°C。
【专利摘要】本发明提供了一种同时测定山楂中芦丁和槲皮素含量的方法，采用高效液相色谱法，以流动相A和流动相B进行梯度洗脱，所述的流动相A为甲醇，所述的流动相B为磷酸水溶液，所述的磷酸水溶液的质量分数为0.4％～0.8％。本发明方法简单、准确性高、重复性好，可用于同时测定山楂中芦丁和槲皮素的含量，为山楂饮片及其相关制剂的质量评价和含量检测提供了快速、准确的方法。
【IPC分类】G01N30/02
【公开号】CN105548380
【申请号】CN201510902345
【发明人】段占娥, 赵雪梅
【申请人】段占娥
【公开日】2016年5月4日
【申请日】2015年12月8日