用于从维生素d结合蛋白解离维生素d的溶液、相关的检测方法及用图
【技术领域】
[0001] 本发明涉及检测维生素D的技术领域。更具体地，本发明提供了氟代烷基表面活性 剂与醇的联合用于从维生素D结合蛋白释放维生素D和/或其代谢物之一的用途，包含这样 的联合的溶液，使用这样的联合检测/定量维生素D和/或维生素D的至少一种代谢物的体外 方法，以及用于通过免疫测定使用这样的联合来检测/定量的试剂盒。
[0002] 维生素D是参与许多人体和动物体生物学过程的重要物质。其中，已知生物学活性 的维生素D尤其调节来自肠道的钙固定，以及骨矿化，并且其影响许多其他代谢途径，例如 胰岛素系统。维生素D的缺乏或过量可产生许多后果。特别是，已知维生素D缺乏导致严重的 疾病，如骨质疏松和软骨病。
[0003] 此外，过量的维生素D(特别是由于过度施用)具有毒性。特别是，高水平的维生素D 可导致由于肠道钙吸收的增加引起的高钙血症。维生素D的其他毒性作用表现为血压升高， 胃肠问题，如厌食、恶心，通常随后伴有尿的过度产生、烦渴、疲劳、神经紧张、瘙痒或甚至是 肾衰竭。
[0004] 如申请W0 2012/091569中所提到的，近年来已经发现，维生素D调节免疫系统并且 降低炎症。该申请还表明，维生素D能够防止结肠、卵巢和乳房的癌症。
[0005] 因此，能够测量或定量维生素D，即确定其浓度，从而揭示任何潜在的缺陷或过量， 这是重要的。
[0006] 维生素D以两种形式存在于有机物中，即以下列出的式的维生素D2(钙化醇）和维 生素D3(胆钙化醇）（其中维生素D中的位置编号按照留醇命名法）。
[0007] 维生素D2(钙化醇）：
[0009] 维生素D3(胆钙化醇）：
[0011] 维生素02是维生素D的外源形式，其来源于食物。维生素D3是维生素D的内源形式， 其由生物体在来自阳光的紫外线对皮肤的作用下产生。由皮肤产生的维生素D 3与维生素D 结合蛋白结合，该维生素D结合蛋白将其运输至肝。这两种形式也可以来源于营养补充剂。 产生了维生素D的多种代谢物。特别是，发生了两步代谢，第一步在于产生25-羟基维生素D (D 2或D3)，随后产生1,25-二羟基维生素D(D2或D3)。
[0012] 测量维生素D自身的量受到的关注有限，因为其浓度作为膳食的函数而剧烈波动。 这同样适用于1，25_二羟基维生素D代谢物，其以相当低的浓度存在并且也波动。
[0013] 维生素D的循环形式主要是25-羟基维生素D型的代谢物。因此，获得关于患者的维 生素D的总浓度的信息的优选方式是测定25-羟基维生素D。
[0014] 25-羟基维生素D或更概括而言维生素D及其代谢物与维生素D结合蛋白（DBP)的结 合使得测定其组分复杂化。为了获得充分的测定，有必要通过使DBP与半抗原解离来从DBP 释放待检测的半抗原。因此，已经提出多种溶液用于在解离DBP之后和检测之前获得维生素 D及其代谢物的释放。
[0015] 已经开发了专利申请W0 2007/039194和专利申请W0 2012/091569中列出的多种 技术。仅仅将它们中的一些在下文列出。
[0016] 在申请W0 99/67211中具体使用的旧技术在于制备血浆或血清样品，以通过乙醇 沉淀测定维生素D。然后，除去沉淀，以回收含有维生素D的可溶代谢物的乙醇上清液。过去 经常使用借助于醇或另一有机溶剂(如乙腈)的沉淀。然而，该技术不能够自动化，并且需要 许多手工操作（向血清加入溶剂、混合、离心、回收有机相、在柱上或另外干燥，再悬浮于液 体溶剂），因此由于在操作者之间观察到的高度变化而使其最近被废弃。
[0017] 专利申请W0 2007/039194提出使用含有5体积％至30体积％-种或多种两性试剂 和任选的0.7体积％至8体积％的短链醇(&-C3)的溶液，所述一种或多种两性试剂选自二甲 基亚砜(DMS0)和液体有机酰胺的。该文件中使用的两性化合物是毒性的或如果其为DMS0时 甚至是危险的物质。
[0018] Future Diagnostics的专利申请W0 2011/122948和W0 2012/091569描述了能够 从维生素D的结合蛋白释放维生素D并且使用了氟代烷基表面活性剂的免疫测定和试剂。申 请人已经使用了该溶液，但是发现所获得的解离仍然是不充分的。
[0019] 本发明的目标是提供了易于实施并且导致在解离维生素D结合蛋白（DBP)后维生 素D及其代谢物有效释放，随后能够使它们被充分检测并定量的更有效的解离技术。
[0020] 在本发明的上下文中，目标是提供一种从维生素D结合蛋白（DBP)解离维生素D或 其一种代谢物的新的溶液，其比Future Diagnostics在其专利申请W0 2011/122948和TO 2012/091569中提出的现有技术的技术更加有效。此外，本发明中描述的溶液没有呈现出尤 其是在专利申请W0 2007/039194所提出的溶液的毒性问题。
[0021] 在本文中，本发明提供了至少一种氟代烷基表面活性剂(且特别是全氟代烷基表 面活性剂)和至少一种具有1至4个碳原子的醇用于从维生素D结合蛋白解离维生素D和/或 维生素D代谢物的用途。与区别仅在于缺乏醇的类似使用相比，这样的结合使用使其能够显 著增加维生素D或其一种代谢物从维生素D结合蛋白解离的速率。在本发明的用途中，将氟 代烷基表面活性剂(且特别是全氟代烷基表面活性剂)和具有1至4个碳原子的醇掺入包含 与维生素D结合蛋白结合的维生素D和/或维生素D代谢物(称为分析物或维生素D分析物）的 液体样品。因此，用于解离的分析物与氟代烷基表面活性剂和醇两者接触，它们当一起使用 时能够比使用相同的氟代烷基表面活性剂本身实现更大的解离。氟代烷基表面活性剂(且 特别是全氟代烷基表面活性剂)和具有1至4个碳原子的醇的联合使用导致维生素D结合蛋 白与维生素D和/或其一种代谢物之间的有效解离。
[0022] 具体地，氟代烷基表面活性剂与醇以如下量使用，该量使得当表面活性剂为固体 时该表面活性剂的重量或当其为液体时该表面活性剂的体积除以醇的体积的百分比比值 在10%至60%的范围内，优选在15%至40%的范围内，且更优选在15%至30%的范围内。固 体或液体性质在环境温度下(特别是在22°C下)和在环境压力下(特别在1013百帕(hPa))评 估。
[0023] 有利地，氟代烷基表面活性剂选自全氟羧酸、全氟磺酸及其盐，并且特别选自全氟 己酸、全氟庚酸和全氟辛酸及其盐。全氟己酸(perfluorohexanoic acid)也称为全氟羊油 酸(perfluorocaproic acid)或十一氟己酸；其化学文摘社(CAS)注册号为307-24一4。全 氣辛酸(perfluorooctanoic acid)也称为全氣羊脂酸(perfluorocaprylie acid)或十五 氟辛酸;其CAS号为335-67-1。总的来说，这些全氟代烷酸的盐是固体，而对应的游离酸是 液体。
[0024] 全氟己酸(可呈盐形式)是优选的氟代烷基表面活性剂，因为其与更长链的氟代烷 基表面活性剂相比，显示出更好的降解度。
[0025]在优选的方式中，所用的醇具有1至3个碳原子，并且选自甲醇、乙醇、正丙醇和异 丙醇。甲醇是本发明优选的醇，因为其可在解离之后进行的测定的结果再现性方面获得更 好的表现，并且在改进解离和获得的结果的再现性方面提供了良好的折中。
[0026]在尤其有利的方式中，解离用全氟己酸和甲醇进行。
[0027] 在本发明的上下文中，解离可以是在额外的表面活性剂的存在下进行，所述额外 的表面活性剂特别选自基于氧化乙烯和氧化丙烯的嵌段共聚物、聚山梨醇酯和聚乙二醇 醚。
[0028] 举例来说，实施本发明以从维生素D结合蛋白解离25-羟基维生素D，并且特别是 25-羟基维生素D2和/或25-羟基维生素D3。
[0029] 醇和氟代烷基表面活性剂可以分别掺入需要获得解离的样品中，或它们可以同时 掺入。在这样的情况下，使用被称为"解离"溶液的单个溶液，以使操作最小化。
[0030] 本发明还提供了包括至少一种氟代烷基表面活性剂(且特别是全氟代烷基表面活 性剂)和至少一种具有1至4个碳原子的醇的溶液。
[0031] 这样的溶液可以被称为是水性的（aqueous)，并且它们包含大量的水，这通常表示 相对于溶液的总体积占大于80体积％。
[0032]有利地，这样的溶液包括：
[0033] 当表面活性剂为液体时的体积或当其为固体时的重量相对于溶液的总体积表示 的氟代烷基表面活性剂的百分比在0.1%至3%的范围内，优选1%至2%的范围内的表面活 性剂。在同等优选的方式中，这样的溶液包括体积相对于溶液的总体积的百分比在0.5%至 1 〇%的范围内，并且优选在2%至7%的范围内的醇。
[0034] 参照用途陈述的涉及醇和氟代烷基表面活性剂的选择及它们的相对量的相同优 选方案适用于本发明的解离溶液。
[0035] 在有利的变化方案中，本发明的解离溶液还含有另一种表面活性剂，其选自基于 氧化乙烯和氧化丙烯的嵌段共聚物、聚山梨醇酯和聚乙二醇醚。在试图不受限于结果的任 何特定理解的情况下，这样的额外的表面活性剂可提高待测定的维生素D或其代谢物的溶 解度。这样的额外的表面活性剂(如Pluronic?F-127,其为对应于基于氧化乙烯和氧化丙 烯的嵌段共聚物的多元醇)特别用于提高结果的再现性。发现，最终测定更加可靠。通过非 限制性实例，可以在解离溶液中的优选在〇. 1 %至3% (相对于解离溶液的总体积，按体积 计)范围内的浓度使用Pluronic? F-127。
[0036] 通常，本发明的解离溶液被缓冲，尤其被缓冲至6至8范围内的pH。
[0037] 诊断领域中常规使用的缓冲液可以被掺入溶液，以获得所需范围的pH并且使其稳 定。举例来说，可以使用磷酸缓冲盐水(PBS)缓冲液或tris缓冲液(三羟甲