Hplc法测定氯霉素-苯氧乙醇制剂中有效成分含量的工艺的制作方法
【专利摘要】本发明涉及一种HPLC法测定氯霉素?苯氧乙醇制剂中有效成分含量的工艺，测定氯霉素?苯氧乙醇溶液中氯霉素和苯氧乙醇含量。选用高效液相色谱仪；流动相甲醇?水75:75；双波长测定法：氯霉素检测波长278nm、苯氧乙醇检测波长265nm；通过对照品求得回归方程；外标法计算含量。结果：氯霉素和苯氧乙醇均在0.01?100mg·ml?1浓度范围有良好线性关系（r=0.9999）。本发明的有益效果是，用HPLC法测定测定氯霉素?苯氧乙醇溶液中氯霉素和苯氧乙醇含量，方法简便、快捷、可靠。
【专利说明】
HPLC法测定氯霉素-苯氧乙醇制剂中有效成分含量的工艺
技术领域
[0001] 本发明涉及一种HPLC法测定氯霉素-苯氧乙醇制剂中有效成分含量的工艺，即测 量其中氯霉素和苯氧乙醇的含量。
【背景技术】
[0002] 氯霉素-苯氧乙醇溶液又称氯苯溶液，是我院研制应用五十多年的外用制剂，主要 外用清创消毒、清洗疮口、烧烫伤外创面，疗效确切，不良反应少，本品最大特点是清创杀菌 外用不给患者带来疼痛感。因此作为制剂在本院配制，其有效成分氯毒素和苯氧乙醇的重 量浓度均为〇. 1-10%，苯扎溴铵的浓度为〇. 1%-2%。报制剂批准文号时，该制剂氯毒素和苯氧 乙醇含量测量采用紫外分光光度法测，现有因该药品中两主要成分氯霉素和苯氧乙醇测定 时选择的最大吸收波长分别为278nm和265nm，本身就相互影响，各自有干扰吸收，又受药品 中抑菌剂新洁尔灭的干扰(新洁尔灭是苯扎溴铵的水溶液），更加造成干扰结果不准确、重 现性差、稳定性不好，同时采取的方法比较繁琐耗时长。
[0003] 现有技术具体缺陷：1采用原荧光分析法时，为了去除药品中抑菌剂新洁尔灭的干 扰，需要在药品配过程中等氯霉素和苯氧乙醇投料置好后，暂时不添加抑菌剂时取半成品， 通过荧光分析法测定测定氯霉素和苯氧乙醇含量，符合后，再添新洁尔灭。造成配置过程不 连续。2原荧光分析法不能有效准确测定最后成品的含量，造成主管部门抽检时没法准确 评价药品的质量。3耗时长、干扰大、结果不准确。
【发明内容】
[0004] 本发明为了弥补现有技术的不足，提供了一种配置过程连续、检测含量准确、耗时 短、抗干扰的HPLC法测定氯霉素-苯氧乙醇制剂中有效成分含量的工艺。
[0005] 本发明是通过如下技术方案实现的： 本发明的HPLC法测定氯霉素-苯氧乙醇制剂中有效成分含量的工艺，其特征在于:包括 以下步骤： 首先，配制对照品溶液:配制已知浓度并且浓度不同的氯霉素和苯氧乙醇的混合溶液， 其中添加有一定数量的抑菌剂； 然后，对照品溶液的检测：采用高效液相色谱仪检测对照品吸收度，记录波长Amax= 278nm时氯霉素的吸收度，和Amax=265nm时苯氧乙醇的吸收度，以峰面积吸收度为纵坐标 (Y)，以浓度为横坐标(X)，进行绘制色谱图，X、Y均为已知，通过对照品求得回归方程。
[0006] 最后，供试品溶液的检测:将供试品稀释到符合检测要求，采用高效液相色谱仪检 测稀释液的吸收度，记录波长Xmax=278nm时氯霉素的吸收度Y，和Amax=265nm时苯氧乙醇的 吸收度Y，代入回归方程，根据Y计算X就可求得氯霉素和苯氧乙醇的含量。
[0007] 回归方程为，波长Amax=278nm的氯霉素吸收度Y=24 ? 76X+0 ? 4021，波长Amax=265nm 苯氧乙醇吸收度Y=18 ? 21X-0 ? 1905。
[0008] 氯霉素和苯氧乙醇的浓度范围为〇.〇l-l〇〇mg/ml时，有良好的线性关系。
[0009] 色谱条件:采用高效液相色谱仪，色谱柱为4(^1(^;[111120(]18柱4.6111111\15〇111111，511111， 柱温为室温，检测波长为双波长，氯霉素检测波长278nm，苯氧乙醇检测波长265nm，进样量 为l〇y 1，流动相为甲醇-水体积比75:75，流速为0.5-2ml/min。
[0010] 对照品溶液的配制：精密称取105°C干燥至恒重的氯霉素对照品，100°C干燥至恒 重的苯氧乙醇对照品，量取一定数量和浓度的抑菌剂新洁尔灭，共同置于一个棕色容量瓶 中，加纯化水振摇溶解，再加至刻度度机械振动15min至溶解完全作为对照品储备液，精密 量取一定体积的溶液至另一棕色容量瓶中，加流动相稀释至刻度摇匀，达到可检测浓度，作 为对照品； 线性关系的确定:分别取上述配好的对照品贮备溶液，取不同体积的10份，分别放入一 定容积的棕色容量瓶中，加流动相甲醇-水容积比75:75至刻度摇匀，分别按上述色谱条件 进样检测，记录波长Xmax=278nm时氯霉素的吸收度，和Amax=265nm时苯氧乙醇的吸收度，色 谱图以峰面积吸收度为纵坐标(Y)，以浓度为横坐标(X)，进行绘制，吸收度Y为已知，通过对 照品求得回归方程，波长Xmax=278nm的氯霉素吸收度Y=24 ? 76X+0 ? 4021，波长Amax=265nm苯 氧乙醇吸收度Y=18.21X-0.1905，线性关系指标r=0.9999，检测次数n=10次。
[0011]供试品溶液的检测:精密量取供试品溶液一定数量至一定容积的棕色容量瓶中， 加纯化水至刻度摇匀溶解至完全，再取稀释一次后的一定数量的溶液至一定容积的另一棕 色容量瓶中加流动相至刻度摇匀，作为供试品溶液；如果仍然达不到检测要求，则继续稀 释;按上述色谱条件进样检测，记录波长Xmax=278nm时氯霉素的吸收度，和Amax=265nm时苯 氧乙醇的吸收度Y，代入回归方程，根据Y计算X就可求得氯霉素和苯氧乙醇的含量。
[0012]本发明的有益效果是，采取高效液相色谱法(HPLC)用于混合溶液中有效成分的含 量测定，该方法简便、快捷、准确、稳定性好、重现性好，具体如下：1能够直接在最后成品测 定药品中氯霉素和苯氧乙醇的含量，并且测量准确，耗时短。2避免了氯霉素和苯氧乙醇在 其比较临近各自最大吸收波长处278nm和265nm相互干扰。3使不同批次间质量能保持一致 和准确，提高药品质量安全、有效。4便于推广药品进一步的开发。
【附图说明】
[0013]图1是检测波长A=278nm对照品图谱，图2是检测波长A=265nm对照品图谱，图3 是空白溶液色谱图。
【具体实施方式】
[0014]附图为本发明的一种具体实施例。
[0015] -、仪器与试药 1.1仪器Agrlentl 100高效液相色谱仪(配三元栗、二级管陈列检测仪、在线脱气机、色 谱工作站），WP3-3000(Rs)型自动进样器，BP211D分析天平。
[0016] 1.2试药氯霉素对照品（南京白敬辛制药有限责任公司，批号132104)，苯氧乙醇对 照品（瑞士Fluca公司，批号1431021 )，甲醇为色谱醇，水为超纯水。
[0017] 1.3方法:选用AgrlentllOO高效液相色谱仪;WP3-3000(Rs)型自动进样器;流动相 甲醇-水75:75;双波长测定法:氯霉素检测波长278nm、苯氧乙醇检测波长265nm;通过对照 品求得回归方程;外标法计算含量。结果:氯霉素和苯氧乙醇均在〇. 〇 1 -1 〇〇mg/ml浓度范围 有良好线性关系(r=0.9999)。结论用HPLC法测定测定氯霉素-苯氧乙醇溶液中氯霉素和苯 氧乙醇含量，方法简便、快捷、可靠。
[0018] 二、具体方法与结果 1色谱条件采用AgrlentllOO高效液相色谱仪，色谱柱为Acclcciml20C18柱(4.6mmX 150mm，5_)，柱温为室温，检测波长为双波长，氯霉素278nm，苯氧乙醇265nm，进样量为10y 1，流动相为甲醇-水75:75(容量比），流速为0.5-2ml/min-l。
[0019] 2对照品溶液制备和检测精密称取105°C干燥至恒重的氯霉素对照品50.00mg， 量取2ml重量浓度为5%的新洁尔灭溶液，100 °C干燥至恒重的苯氧乙醇对照品50.0 Omg，共同 置于100ml棕色容量瓶中，加纯化水振摇溶解，再加至刻度度机械振动15min至溶解完全作 为对照品储备液，精密量取l〇ml溶液至100ml棕色容量瓶中，加流动相至刻度摇匀作为对照 品。
[0020]分别取上述配好的对照品备溶液2ml、4ml、5ml、6ml、8ml、10ml、13ml、15ml、 17ml、20ml至20ml棕色容量瓶中，加流动相甲醇-水(容积比75:75)至刻度摇匀，得到的溶液 氯霉素和苯氧乙醇重量浓度分别为0.005、0.01、0.0125、0.015、0.02、0.025、0.0325、 0.0375、0.0425、0.05，单位11^/1111，氯霉素和苯氧乙醇的浓度范围为0.005~0.0511^.1111-1。 分别按上述色谱条件进样检测，记录波长Xmax=278nm时氯霉素的吸收度，和Amax=265nm时 苯氧乙醇的吸收度，以峰面积吸收度为纵坐标(Y)，以浓度为横坐标(X)，绘制色谱图，X、Y为 已知，通过对照品求得回归方程，波长Amax=278nm的氯霉素吸收度Y=24.76X+0.4021，波长入 max=265nm苯氧乙醇吸收度Y=18 ? 21X-0 ? 1905，线性关系指标r=0 ? 9999(检测次数n=10次）(r 越接近1，正比关系越好）。
[0021]如果最初取的氯霉素和苯氧乙醇分别为500mg，新洁尔灭的数量与上述相同或不 同，配制溶液，那么仍然要将溶液稀释为氯霉素和苯氧乙醇的重量浓度为0.05 mg/ml，相当 于加10升水。以上述同样方法进行检测，得到上述相似的色谱图和相似的回归方程。如果最 初取的氯霉素和苯氧乙醇是其它数目，配制溶液后要稀释到百分之一mg/ml的数量级的浓 度来进行高效液相色谱仪的吸收度进行分析。
[0022]优选方案为，检测三次，分别测定波长278nm时氯霉素的吸收度，求相同浓度时的 平均值，分别测定波长265nm苯氧乙醇吸收度，求相同浓度时的平均值，以峰面积吸收度平 均值为纵坐标(Y)，以浓度为横坐标(X)，绘制色谱图，X、Y为已知，通过对照品求得回归方 程，即为上面的回归方程。这样尽量减小了误差。
[0023]因此，氯霉素和苯氧乙醇的浓度范围为0.01-100mg/ml时，有良好的线性关系。 [0024] 3供试品溶液的检测、线性关系考察精密量取供试品溶液10ml至50ml棕色容量 瓶中，加纯化水至刻度摇匀溶解至完全，再取5ml至25ml棕色容量瓶中加流动相至刻度摇 匀，作为供试品溶液。如果仍然达不到检测要求，则继续稀释。按上述色谱条件进样检测，记 录波长Xmax=278nm时氯霉素的吸收度，和Amax=265nm时苯氧乙醇的吸收度Y，代入回归方 程，根据Y计算X就可求得氯霉素和苯氧乙醇的含量。
[0025] 4方法专属性 取氯霉素-苯氧乙醇对照品溶液，按上述色谱条件进样检测，分别测定波长278nm和 265nm的吸收度，分离度为2.6良好，见图1和图2。不加对照品氯霉素和苯氧乙醇按原有处方 规定配制空白溶液，按测定上述对照品溶液的方法进样检测，得到图3空白溶液图谱，在 278nm和265nm处，无杂质吸收峰出现，方法专属性良好。
[0026] 5精密度试验取对照品溶液，按照上述色谱条件，连续进样6次，记录峰面积，经过 计算结果氯霉素峰面积RSD为0.52%，苯乙醇峰面积RSD为0.75%，说明精密度良好。
[0027] 6重复性试验精密量取同一批号（20141212)氯苯溶液6份，按照供试品溶液配制方 法分别进行稀释，按照上述相同色谱条件进样，按外标法计算各自含量，结果该批氯苯溶液 产品氯霉素平均含量为标示量的99.65%，RSD为0.46%，苯氧乙醇平均含量为标示量的 100.3%，RSD为0.62%，说明该测量方法重复性较好。
[0028] 7稳定性试验分别将同一批(20141212)氯苯溶液按上述方法制成的供试品溶液分 别在室温下放置0，l，3,5,7,9，15,24h后取样按上述相同的方法进行测试，测得氯霉素峰面 积RSD为0.78%，苯氧乙醇峰面积RSD为0.47%，结果说明方法稳定性较好。
[0029] 8供试品含量测定取5批氯苯溶液（20141103,20150115,20150312,20150314， 20150328)按照上述供试品溶液制备方法进行稀释，作为待测样品。按照上述色谱条件和相 同测试方法进行进样检测，按外标法代入上述回归方程计算5批样品含量，结果见表1。
[0031]氯霉素-苯氧乙醇溶液(简称氯苯溶液)作为医院制剂，未有国家统一标准，我们作 为研制单位，为了提高其检测质量标准，确保制剂质量稳定有效，参考《中国药典》2015年版 及文献方法，对氯霉素和苯氧乙醇采取HPLC法检测，检测方法线性关系、稳定性、重复性和 精密度均较好。据氯霉素和苯氧乙醇极性差别，参考氯霉素滴眼液质量标准（中国药典）和 文献方法，对流动相进行优选，确定适合的流动相甲醇-水(75:75)流动相进行分离，分离后 的成分最大吸收波长分别为278nm和265nm，经过试验在任意单一波长278nm或265nm测定其 含量时受干扰较大，吸收度差别不大，对计算结果的准确度和精密度不好，故采用双波长 法，分别于各自最大吸收波长处测其吸收度，在278nm和265nm分别测定氯霉素和苯氧乙醇 的吸收度较好，经过回归方程分别计算含量，结果稳定，方法简便。
【主权项】
1. 一种HPLC法测定氯霉素-苯氧乙醇制剂中有效成分含量的工艺，其特征在于:包括以 下步骤： 首先，配制对照品溶液:配制已知浓度并且浓度不同的氯霉素和苯氧乙醇的混合溶液， 其中添加有一定数量的抑菌剂； 然后，对照品溶液的检测：采用高效液相色谱仪检测对照品吸收度，记录波长Amax= 278nm时氯霉素的吸收度，和Xmax=265nm时苯氧乙醇的吸收度，以峰面积吸收度为纵坐标 (Y)，以浓度为横坐标(X)，进行绘制色谱图，X、Y均为已知，通过对照品求得回归方程； 最后，供试品溶液的检测:将供试品稀释到符合检测要求，采用高效液相色谱仪检测稀 释液的吸收度，记录波长Xmax=278nm时氯霉素的吸收度Y，和Amax=265nm时苯氧乙醇的吸收 度Y，代入回归方程，根据Y计算X就可求得氯霉素和苯氧乙醇的含量。2. 根据权利要求1所述的HPLC法测定氯霉素-苯氧乙醇制剂中有效成分含量的工艺，其 特征在于：回归方程为，波长Amax=278nm的氯霉素吸收度Y=24.76X+0.4021，波长A max= 265nm苯氧乙醇吸收度Υ=18 · 21Χ-0 · 1905。3. 根据权利要求1所述的HPLC法测定氯霉素-苯氧乙醇制剂中有效成分含量的工艺，其 特征在于： 色谱条件:采用高效液相色谱仪，色谱柱为Acc lcciml 20C18柱4.6mm X 150mm，5μηι，柱温 为室温，检测波长为双波长，氯霉素检测波长278nm，苯氧乙醇检测波长265nm，进样量为10μ 1，流动相为甲醇-水体积比75:75，流速为0.5-2ml/min。4. 根据权利要求1所述的HPLC法测定氯霉素-苯氧乙醇制剂中有效成分含量的工艺，其 特征在于： 对照品溶液的检测：精密称取105°C干燥至恒重的氯霉素对照品，100°C干燥至恒重的 苯氧乙醇对照品，量取一定数量和浓度的抑菌剂新洁尔灭，共同置于一个棕色容量瓶中，加 纯化水振摇溶解，再加至刻度度机械振动15min至溶解完全作为对照品储备液，精密量取一 定体积的溶液至另一棕色容量瓶中，加流动相稀释至刻度摇匀，达到可检测浓度，作为对照 品； 分别取上述配好的对照品贮备溶液，取不同体积的10份，分别放入一定容积的棕色容 量瓶中，加流动相甲醇-水容积比75:75至刻度摇匀，分别按上述色谱条件进样检测，记录波 长Amax=278nm时氯霉素的吸收度，和Amax=265nm时苯氧乙醇的吸收度，以峰面积吸收度为 纵坐标(Y)，以浓度为横坐标(X)，进行绘制色谱图，吸收度Y为已知，通过对照品求得回归方 程，波长Amax=278nm的氯霉素吸收度Υ=24 · 76X+0 · 4021，波长Xmax=265nm苯氧乙醇吸收度Y= 18.21X-0.1905，线性关系指标r=0.9999，检测次数n=10次。5. 根据权利要求1所述的HPLC法测定氯霉素-苯氧乙醇制剂中有效成分含量的工艺，其 特征在于:氯霉素和苯氧乙醇的浓度范围为〇.〇l-l〇〇mg/ml时，有良好的线性关系。6. 根据权利要求1所述的HPLC法测定氯霉素-苯氧乙醇制剂中有效成分含量的工艺，其 特征在于： 供试品溶液的检测：精密量取供试品溶液一定数量至一定容积的棕色容量瓶中，加纯 化水至刻度摇匀溶解至完全，再取稀释一次后的一定数量的溶液至一定容积的另一棕色容 量瓶中加流动相至刻度摇匀，作为供试品溶液;如果仍然达不到检测要求，则继续稀释;按 上述色谱条件进样检测，记录波长Xmax=278nm时氯霉素的吸收度，和Amax=265nm时苯氧乙 醇的吸收度Y，代入回归方程，根据Y计算X就可求得氯霉素和苯氧乙醇的含量。
【文档编号】G01N30/02GK105929075SQ201610286104
【公开日】2016年9月7日
【申请日】2016年4月29日
【发明人】孙国栋, 孙东升
【申请人】孙国栋