一种汞离子检测用的纸芯片比色分析系统及其构建方法和应用
【专利摘要】本发明属于汞离子检测技术领域，具体为一种汞离子检测用的纸芯片比色分析系统及其构建方法和应用。纸芯片比色分析系统的构建，包括：纸芯片塑料承载基体的制备，纸芯片的设计和制备，该纸芯片类似微反应容器，用于进行铂纳米颗粒催化TMB/H2O2显示反应；简易的光纤分析设备的搭建，用于以数值形式表征纸芯片上颜色的强度。本发明原理：铂纳米颗粒具备优异的类似过氧化氢酶活性，可快速催化TMB/H2O2底物生成蓝色沉淀物，而当汞离子存在时PtNPs会迅速与其反应导致自身酶活性受到抑制，最终通过反应后颜色的变化实现溶液中汞离子识别和定量。本发明具备优越的特异性和选择性，具有广阔的应用前景。
【专利说明】
一种汞离子检测用的纸芯片比色分析系统及其构建方法和应用
技术领域
[0001]本发明属于汞离子检测技术领域，具体涉及一种汞离子检测用的纸芯片比色分析系统及其构建方法和应用。【背景技术】
[0002]工业飞速发展致使工业污水肆意排放、人类生活垃圾不断堆积导致重金属污染问题日趋严重，其中汞离子就是目前外界环境中普遍存在的一种高毒性污染物。研究表明，汞元素通过饮用水或者生物链途径被人类摄取时是无法通过新陈代谢作用外排出去。因而， 由于汞离子的集聚效应以及汞离子的高毒性会对人身体健康带来严重危害，例如微量的汞离子积聚在人体内就会引起大脑损伤、造成肾脏衰竭以及中枢神经系统损伤等疾病。此外， 虽然工业污水和生活污水排放附近区域汞离子含量通常严重超标，但这些危害因素却因为人们无法有效对汞离子污染进监测而成为隐患。因此，大量研究工作者致力于发展一种便捷、经济实用的可用于自然环境中汞离子实时监测的检测手段。目前，已经报道很多基于汞离子检测的有效方法，如原子发射光谱法(AES，Atomic Emiss1n Spectroscopy)、原子吸收光谱法(AAS，Atomic Absorpt1n Spectroscopy)、电化学方法(Electrochemical Analysis)和电感耦合等离子体质谱(ICP-MS)等。这些方法虽能够实现了灵敏、快速地汞离子检测，但是往往需要繁琐的操作程序、昂贵的仪器，因而无法适用于污染源处实时实地检测汞离子。故设计一种携带方便、操作简便、成本低廉、可重复使用同时又能兼顾灵敏度和选择性的汞离子检测策略有非常重要的意义。另外，此类发明也会让贫穷落后的地区和国家、现场家庭和紧急情况下可以有效实现重金属的快速检测。[〇〇〇3] 纸基分析设备(paper-based analytical device，PAD)简称纸芯片作为微流控芯片中的最新发展技术手段，为环境监测、食品安全控制和医疗快速诊断提供了新的研究方向和有力手段。纸芯片采用纸质材料作为基底，通过对纸材料进行各种精细设计和加工后，就会得到具备特定结构和功能的分析元件。另外，基于这些纸质材料元件具备化学稳定性强(不参与大多数生化反应)、生物相容性优越、无需外力驱动反应液就可纸质上顺利流通等良好特性，因而可在一块简单微型的纸芯片就可以快速地完成进样、反应以及检测等众多步骤。由于纸芯片具备众多优越特性，故发展快速、简便、低成本的纸芯片分析平台将会给水质、食品和环境中汞离子的实时原位监测带来极大的便捷。本发明基于此设计了一种纸芯片分析元件实现了汞离子的灵敏快速检测。
【发明内容】
[0004]本发明的目的之一是提供一种快速、便捷地检测汞离子用的比色分析设备一纸芯片比色分析系统及其构建方法。
[0005]本发明的另一目的是提供所述比色分析设备一比色分析纸芯片系统的应用，即提供一种检测汞离子的纸芯片比色分析方法。
[0006]本发明主要通过设计一种纸芯片作为微反器，进行PtNps催化TMB/H2〇2底物显色反应，实现快速、便捷、高灵敏的汞离子检测，操作简便，结果可通过肉眼进行判定。
[0007]同时，本发明还设计了一套光纤分析设备，用来进一步数值化精确定量检测汞离子含量。
[0008]本发明的机理如下:汞离子可以快速与PtNPs结合并导致其类过氧化物酶活性丧失。于是，纸芯片上的TMB/H2〇2底物溶液就无法被催化而产生蓝色沉淀物。最终根据纸芯片上蓝色强度即可有效快速定量待检测的水溶液中汞离子浓度。
[0009]本发明提供的检测汞离子用的比色分析设备一纸芯片比色分析系统的构建方法， 具体步骤如下:(1)设计一种长方体的塑料模块作为基底，并在中间位置开一个直径为6-8_的圆形空心小孔作为检测区域，用来放置纸芯片分析元件；(2)以亲水性膜材(如玻璃纤维膜)为原料，制作圆形纸芯片元件，纸芯片元件直径为8-10 mm，将纸芯片元件放置于上述塑料模块的检测区域中；干燥，常温下放置待用；其中，圆形纸芯片元件可由如下方法批量制作:在工作电脑上用绘图软件绘制直径为 8-10 _圆形纸芯片模板，然后通过连接于电脑的切刻机对玻璃纤维膜进行切割，在几分钟内就会得到大量规格同等的纸芯片元件，随后将其摆放在塑料模块上检测区域中；(3)在纸芯片元件上滴加TMB/H2〇2显色底物反应液15-20ul，得到纸芯片微反器；(4)用高纯水稀释，配置含适量?丨即8(?丨似11(^31'1:〇168，钼纳米颗粒)的溶液，分为若干份，每份2 mL，分别加入塑料滴瓶中；随后向各滴瓶中加入同体积、含不同浓度汞离子的水溶液，各滴瓶中所加的汞离子的水溶液浓度呈梯度变化(如线性梯度变化);混合反应2-3 分钟；这里，所谓含适量的Pt Nanoparticales的溶液，是因为纳米材料的浓度高低直接会影响后面比色分析的显色效果，如果铂纳米颗粒浓度过高，汞离子对其类过氧化氢酶活性抑制能力就不明显。同时，铂纳米颗粒的浓度过低，比色分析就没有优异的显色效果。这里的Pt Nanoparticales适量浓度是按如下方法配置:取10-20 uL配制的PtNPs原液加入到含 2ml双纯水滴瓶中；即溶液浓度为5-10 uL/ml;(5)将上述滴瓶中混合液滴加一滴至纸芯片的检测区域上，与纸芯片已经滴加的TMB/ H2〇2显色底物反应液混合，反应5-6分钟；纸芯片上的TMB/H2〇2显色底物反应液无法被催化而产生蓝色沉淀物；由于若干份溶液中的汞离子浓度呈梯度变化，得到的若干份纸芯片上的蓝色沉淀物的蓝色深浅程度也呈梯度变化;即得到可用于比色分析的纸芯片系统；(6)用数码相机或者智能手机对各纸芯片的颜色结果拍照并记录保存，可直接用于肉眼比色分析。[0〇1〇] 本发明中，所述TMB/H2O2显色底物溶液组成如下:20 mM Tris-HAc(140 mM NaAc PH 4.0)溶液中含有2% v/v TMB(30 mM)和 2% v/v H2〇2(30 wt %)。
[0011] TMB由无水乙醇溶解，TMB和H2〇2溶液均需现配现用。[0〇12] 本发明中，所述Pt Nanopartcles可按照如下方法获得:(1)用现配王水浸泡所有实验需用的玻璃仪器和1-2颗磁转子，实验过程要小心谨慎并尽量在30-40分钟内完成，随后处理掉王水废液，并用大量的高纯水反复清洗，冲洗12-18次后轻轻将水甩干；(2 )用烘箱烘干玻璃仪器，这段时间内可以搭建好实验装置以及配置反应试剂；(3)将玻璃仪器搭建平稳，稳定转子转速，向单颈瓶中加入38 mL双纯水，随后将精确配制的六氯铂酸(16 mM)溶液和柠檬酸三钠(40 mM)溶液分别用移液枪滴加lmL到单颈瓶中， 调节转子高速搅拌5-10min，随后逐渐降低转子转速至开始稳定状态。30-40 min后，将现配制的硼氢化钠(50 mM)溶液逐滴滴加200-300 ul到反应液内，伴随着搅拌同时观察瓶中颜色基本稳定时，进一步在滴加少许硼氢化钠溶液观察颜色有无变化来判断反应是否完全。 随后在避光、室温条件下，静置自然反应1-2 h后收集。[〇〇13]本发明中，所述纸芯片比色分析系统的若干份纸芯片，其份数一般为10-20份，其对应使用的若干份溶液中的汞离子浓度呈梯度变化，其浓度变化范围为0 UM-100 uM(即检测的汞离子浓度范围为0uM-100uM)。
[0014]本发明中，所述用于进一步数值化精确读取纸芯片系统的颜色强度的光纤分析设备，其结构包含:一个可发射红色激光的探针，一个用于对反射激光强度分析的探针元件。 该光纤分析设备主要原理如下:可发射红色激光的探针发射红色激光，当红色的激光照射在纸芯片上时，被蓝色沉淀物较强的吸收，从而使得反射的激光强度衰减，而另一探针元件分析得到相应较低的数值。由于该数值大小可以表征纸芯片上蓝色的强弱，故能更准确地反应水溶液中汞离子的浓度。
[0015]由上述方法得到纸芯片分析比色系统，可用于溶液中汞离子含量的比色分析，具体步骤如下:(1)利用上述得到的纸芯片微反器；(2)取2 mL浓度为5-10 uL/mlPt Nanopartcles的溶液，放于滴瓶中，然后加入等体积的汞离子溶液，混合反应2-3分钟；(3)将上述滴瓶中混合液滴加一滴至纸芯片微反器的检测区域上，与纸芯片已经滴加的TMB/H2〇2显色底物反应液混合，反应5-6分钟；纸芯片上的TMB/H2〇2显色底物反应液无法被催化而产生蓝色沉淀物；(4)将上述蓝色沉淀物颜色与纸芯片系统中颜色比对，便可获知(用肉眼观测)待检测汞离子溶液的浓度范围，即得到汞离子的含量范围。
[0016]或者，把经步骤(3)得到的纸芯片，使用光纤分析设备，数值化精确读取纸芯片系统的颜色强度，从而获知待检测汞离子溶液的浓度范围，即得到汞离子的含量范围。
[0017]本发明中，所述用于数值化精确读取纸芯片系统的颜色强度的光纤分析设备，其结构包含:一个可发射红色激光的探针，一个用于对反射激光强度分析的探针元件。该光纤分析设备主要原理如下:可发射红色激光的探针发射红色激光，当红色的激光照射在纸芯片上时，被蓝色沉淀物较强的吸收，从而使得反射的激光强度衰减，而另一探针元件分析得到相应较低的数值。由于该数值大小可以表征纸芯片上蓝色的强弱，故能更准确地反应水溶液中汞离子的浓度。
[0018]本发明构建了利用汞离子调控PtNPs催化TMB/H202底物显色反应的新型比色设备一纸芯片，并用于水溶液中汞离子的浓度检测。由于纸芯片具备微型化、集成化、便携化等优势，因而对于自然环境和水资源中汞离子的监测具有很大的优势，具有良好的应用前景。【附图说明】
[0019]图1为汞离子比色检测纸芯片设计图例。其中圆心纸质芯片安放在塑料模块中间的检测区域处。
[0020]图2为基于纸芯片的汞离子比色检测流程图。
[0021]图3为基于纸芯片比色分析设备对不同浓度汞离子检测的结果图。左侧拍摄照片表征的是不同浓度汞离子在纸芯片上的比色结果。右图表征的是溶液中汞离子浓度与纸芯片通过光纤设备分析的数值之间线性关系。
[0022]图4为基于纸芯片比色分析设备对不同金属离子检测的结果图。在相同操作条件下，其他金属离子(10 uM)检测结果基本一致并且与汞离子(25 nM)检测结果区别比较明显。【具体实施方式】
[0023]下面通过具体实施例进一步描述本发明。
[0024]实施例1:纸芯片比色检测汞离子含量以及检测限考察纸芯片比色检测汞离子的示意图如图2所示。具体步骤如下:在塑料滴瓶中加入2 mL稀释至固定倍数的PtNPs溶液，随后加入同等体积用含汞离子的水溶液，摇晃混匀静置2-3 min。随后组装好纸芯片元件并在纸质基底上滴加15 ul -20 ulTMB/H2〇2显色底物溶液，进而小心缓慢滴加一滴滴瓶中混合液进入检测区域中。静置纸芯片5-6分钟确保反应完全，随后用数码相机或智能手机对纸芯片进行拍照来记录比色结果；同时将其放置到光纤设备的探头下进一步用数值方式精确地读取芯片上颜色强度。最终结果如图3所示，当反应液中不存在汞离子时，最终纸芯片上可以看到蓝色很深沉淀物出现，这是由于PtNPs具有良好的类过氧化物酶催化活性，可以催化TMB/H2〇2底物快速反应。而当反应液中汞离子浓度超过100 nM最终纸芯片上几乎没有明显蓝色沉淀物生成，这表明了汞离子的存在有效地抑制了 PtNPs的类过氧化物酶活性，并且纸芯片上颜色强度随着汞离子浓度增加而逐渐变淡(图3 (A))，同时光纤检测的数值也随着汞离子浓度的增加呈现较好的线性关系。最后，从结果中可以证实本方法最低可实现对10 nM汞离子灵敏检测。以上结果表明这一系列检测手段可以实现快速、灵敏的汞离子纸芯片比色检测。
[0025]实施例2:纸芯片比色检测汞离子的选择性考察为了验证该纸芯片比色分析汞离子的特异性，我们用其他13中不同金属离子:Na+，K +，Ba2.，Cd2+，Zn2+，Pb2+，Ca2+，Cu2+，Mg2.，Al3.，Ni2.，Fe3.，Fe2.，Sr2+等作为对照， 按照上述操作方法，分别对浓度为10 yM干扰金属离子和25 nm汞离子进行比色检测。如图4 所示，当溶液中含有25 nM汞离子时，最终光纤设备检测得到的数值较高，表明当溶液中汞离子浓度在25 nM时，已经较强地抑制了PtNPs的类过氧化物酶催化活性。而含其他干扰金属离子时结果都比较接近且与汞离子结果差异很大，说明该纸芯片比色分析策略对于汞离子具有较好的选择性。
[0026]以上结果可以看出，本发明的纸芯片比色分析设备对于汞离子具有很好的选择性和特异性，设计和操作过程都十分简便、成本低廉、又兼顾较好的灵敏度，因而未来在对生态环境和水资源中汞离子实时快速监测领域有着很大的潜在应用价值。
【主权项】
1.一种检测汞离子用的纸芯片比色分析系统的构建方法，其特征在于具体步骤如下:(1)设计一种长方体的塑料模块作为基底，并在中间位置开一个直径为6-8 mm的圆形 空心小孔作为检测区域，用来放置纸芯片分析元件；(2)以亲水性膜材为原料，制作圆形纸芯片元件，纸芯片元件直径为8 -10 mm，将纸芯 片元件放置于上述塑料模块的检测区域中；干燥，常温下放置待用；(3)在纸芯片元件上滴加TMB/H2〇2显色底物反应液15-20 ul，得到纸芯片微反器；(4)用高纯水稀释，配置浓度为5-10 uL/ml的PtNPs溶液，分为若干份，每份2 mL，分别 加入塑料滴瓶中；随后向各滴瓶中加入同体积、含不同浓度汞离子的水溶液，各滴瓶中所加 的汞离子的水溶液浓度呈梯度变化;混合反应2-3分钟；(5 )将上述滴瓶中混合液滴加一滴至纸芯片的检测区域上，与纸芯片已经滴加的TMB/ H2〇2显色底物反应液混合，反应5-6分钟；纸芯片上的TMB/H2〇2显色底物反应液无法被催化 而产生蓝色沉淀物；由于若干份溶液中的汞离子浓度呈梯度变化，得到的若干份纸芯片上 的蓝色沉淀物的蓝色深浅程度也呈梯度变化;即得到可用于比色分析的纸芯片系统；(6)用数码相机或者智能手机对各纸芯片的颜色结果拍照并记录保存，直接用于肉眼 比色分析。2.根据权利要求1所述的检测汞离子用的纸芯片比色分析系统的构建方法，其特征在 于，步骤(2)中所述圆形纸芯片元件由如下方法批量制作:在工作电脑上用绘图软件绘制直 径为8-10 mm圆形纸芯片模板，然后通过连接于电脑的切刻机对亲水性膜材进行切割，在几 分钟内就会得到大量规格同等的纸芯片元件。3.根据权利要求1所述的检测汞离子用的纸芯片比色分析系统的构建方法，其特征在 于，所述TMB/H2O2显色底物溶液组成如下:20 mM Tris-HAc(140 mM NaAc PH 4.0)溶液中含 有2% v/v TMB(30 mM)和 2% v/v H2〇2(30 wt %)。4.根据权利要求1所述的检测汞离子用的纸芯片比色分析系统的构建方法，其特征在 于，所述PtNPs按照如下方法获得:(1)用现配王水浸泡所有实验需用的玻璃仪器和1-2颗磁转子，实验过程要小心谨慎并 尽量在30-40分钟内完成，随后处理掉王水废液，并用大量的高纯水反复清洗，冲洗12-18次 后轻轻将水甩干；(2 )用烘箱烘干玻璃仪器，这段时间内可以搭建好实验装置以及配置反应试剂；(3 )将玻璃仪器搭建平稳，稳定转子转速，向单颈瓶中加入38 mL双纯水，随后将配制的 16 mM六氯铂酸溶液和40 mM柠檬酸三钠溶液分别用移液枪滴加lmL到单颈瓶中，调节转子 高速搅拌5-10 min，随后逐渐降低转子转速至开始稳定状态；30-40 min后，将现配制的50 mM硼氢化钠溶液逐滴滴加200-300 ul到反应液内，伴随着搅拌同时观察瓶中颜色基本稳定 时，进一步在滴加少许硼氢化钠溶液观察颜色有无变化来判断反应是否完全;随后在避光、 室温条件下，静置自然反应1-2 h后收集。5.根据权利要求1所述的检测汞离子用的纸芯片比色分析系统的构建方法，其特征在 于，所述纸芯片比色分析系统的若干份纸芯片，其份数为10-20份，其对应使用的若干份溶 液中的汞离子浓度呈梯度变化，其浓度变化范围为〇 uM-100 uM。6.由权利要求1-5之一所述构建方法得到的纸芯片比色分析系统。7.如权利要求7所述的纸芯片比色分析系统在汞离子检测中的应用，具体步骤如下:(1)利用得到的纸芯片微反器；(2)取2 mL浓度为5-10 uL/ml的PtNPs溶液，放于滴瓶中，然后加入等体积的汞离子溶 液，混合反应2-3分钟；(3)将上述滴瓶中混合液滴加一滴至纸芯片微反器的检测区域上，与纸芯片已经滴加 的TMB/H2〇2显色底物反应液混合，反应5-6分钟；纸芯片上的TMB/H2〇2显色底物反应液无法 被催化而产生蓝色沉淀物；(4)将上述蓝色沉淀物颜色与纸芯片系统中颜色比对，便可获知待检测汞离子溶液的 浓度范围，即得到汞离子的含量范围；或者，把经步骤(3)得到的纸芯片，使用光纤分析设备，数值化精确读取纸芯片系统的 颜色强度，从而获知待检测汞离子溶液的浓度范围，即得到汞离子的含量范围。
【文档编号】G01N21/78GK105973879SQ201610256924
【公开日】2016年9月28日
【申请日】2016年4月25日
【发明人】陈伟伟, 方雪恩, 李花, 曹宏梅, 杨茜, 王丽娟, 孔继烈
【申请人】复旦大学, 上海速芯生物科技有限公司, 上海速创诊断产品有限公司