一种用于检测眼病的试剂盒及其检测方法
【专利摘要】本发明公开了一种特异结合sICAM?1的核酸适体及试剂盒。本发明提供的核酸适体，与sICAM?1具有较好的亲和能力。利用本发明的核酸适体，可以捕获溶液中的sICAM?1，将其制备成为相应的试剂盒，将用于眼病的筛查。利用本发明的试剂盒，具有高灵敏、成本低的特点，适合大规模的筛查。
【专利说明】
一种用于检测眼病的试剂盒及其检测方法
技术领域
[0001] 本发明涉及一种用于检测眼病的试剂盒及其检测方法。
【背景技术】
[0002] 甲状腺相关眼病（thyroid associated ophthalmopathy,ΤΑΟ)是内分泌科常见疾 病之一，也是目前世界上治疗最为困难的疾病之一。ΤΑ0病程较长，各年龄段均可发生，以女 性多发。轻者可影响生活、工作质量，损伤外貌，重者可导致视力下降，甚至失明，给患者带 来了沉重的经济及心理负担。近年来，由于生活方式的改变，工作压力的增加，社会环境状 况的变化，食用加碘盐的普及，以及不正规用药等因素，ΤΑ0的发病率明显上升，住院率高。 目前由于本病原因未明，临床主要以激素、免疫抑制剂、生长激素类似物、抗甲状腺药物、眶 内放射、眼眶减压术等综合治疗为主，但由于种种原因，效果并不尽人意，迄今为止尚无任 何一种药物能有效治疗ΤΑ0,并获长期缓解。因此，研究治疗甲状腺相关眼病的药物是亟待 解决的技术问题。而检测所述疾病更是本领域积极研究的方向。
[0003] 近年来的研究表明，细胞间粘附分子-1的表达与自身免疫甲状腺病免疫病理过程 密切相关。甲状腺炎患者的甲状腺组织内浸润淋巴细胞、内皮细胞的sICAM-1和sICAM-1表 达异常活跃。另外，发现伴有突眼的患者血清sICAM-1水平异常增高，这是因为患者眼球后 组织强烈表达sICAM-1，所以血清sICAM-1升高的水平多与眶周炎症浸润程度密切相关。此 外，研究还发现，在药物的治疗过程中，甲状腺功能和临床症状的好转与血清sICAM-1水平 的下降并不同步，往往甲状腺功能的恢复在很大程度上要早于sICAM-1的恢复。综上所述， 可溶性细胞间粘附分子-1的浓度变化可能对于判断GD的自身免疫紊乱水平、停药与否和是 否复发等具有重要意义。细胞间粘附分子-1的表达与甲状腺相关眼病有直接关联，因此，检 测细胞间粘附分子-1的表达情况，可以直接用于鉴定甲状腺相关眼病。然而传统的检测细 胞间粘附分子-1的表达情况具有操作复杂，费时的缺点。
[0004] 核酸适体(Aptamer,又称适配体，适配子)是能高亲和性、高特异性的结合某种生 物革E1标的单链寡核酸分子(ssDNA或ssRNA)。核酸适体是通过指数富集配体系统进化技术 (Systematic Evolution of Ligands by Exponential enrichment，SELEX)从人工合成的 DNA/RNA文库中筛选得到的能够高度特异性结合靶标分子的单链DNA/RNA。已报道核酸适体 的靶标包括金属离子、有机小分子、多肽、蛋白质、细胞甚至组织等。核酸适体的分子识别功 能与抗体类似，具有与抗体分子相当甚至更强的靶标识别能力，但与抗体相比具有很多优 良的特性，如分子量小，能批量生产，不易失活，无免疫原性、容易合成与标记、快速的穿透 组织、良好的代谢动力学、不同批次之间产品不会存在差异和具有很好化学稳定性，在生物 检测、疾病诊断治疗等领域具有重要的应用前景。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是提供一种特异结合sICAM-1的核酸适体及其试剂盒。
[0006] 本发明提供的核酸适体，是序列表的序列1-15所示的单链DNA。
[0007 ]所述核酸适体与s I CAM-ι蛋白具有较好的亲和能力。
[0008] 还可将所述核酸适体进行修饰或改造，得到所述核酸适体的衍生物。
[0009] 所述核酸适体的衍生物可为如下任意一种：
[0010] a)将所述核酸适体删除部分或增加部分互补的核苷酸，得到的与所述核酸适体具 有相同功能的核酸适体的衍生物；
[0011] b)将所述核酸适体进行核苷酸取代或部分修饰，得到的与所述核酸适体具有相同 功能的核酸适体的衍生物；
[0012] c)将所述核酸适体的骨架改造为硫代磷酸酯骨架，得到的与所述核酸适体具有相 同功能的核酸适体的衍生物；
[0013] d)将核酸适体改造为肽核酸，得到的与所述核酸适体具有相同功能的核酸适体的 衍生物；
[0014] e)将所述核酸适体连接上荧光、放射性和治疗性物质后，得到的与所述核酸适体 具有相同功能的核酸适体的衍生物。
[0015] 所述核酸适体可用于制备检测sICAM-1的试剂盒。
[0016] 利用本发明的核酸适体，可以捕获血液中的sICAM-1，从而用于甲状腺相关眼病筛 查。利用本发明的核酸适体，部分代替单克隆抗体捕获sICAM-1进行检测，具有高灵敏、成本 低、易制备、易保存的优点。本发明具有很高的应用价值。
【具体实施方式】
[0017] 以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验 方法，如无特殊说明，均为常规方法。
[0018] 实施例1、核酸适体的筛选和制备
[0019] 设计两端包含大约20个核苷酸、中间包括39个核苷酸的随机核酸文库如下：
[0020] 5'-ACGACTAACGTGTAACAG(N39)CAGTGCATGATGCTACGAA-3' ；N39代表39个随机核苷 酸。
[0021 ]将单链DNA文库扩增为双链DNA，产物经2%琼脂糖凝胶电泳并切胶回收纯化；以回 收的双链DNA为模板，体外转录出单链RNA随机文库，转录产物经PAGE纯化。75yg RNA文库经 硝酸纤维素膜反筛去除与膜结合的RNA分子，然后与2ug sICAM-1蛋白（通过陈志鸿等，人细 胞间黏附分子-1的真核细胞表达与鉴定中公开的方法，表达得到的目的蛋白），37°C孵育 30min，反应液经硝酸纤维素膜滤过，洗涤滤膜;然后将滤膜剪碎，置于洗脱缓冲液(6mol/L 尿素，0.55mol/L醋酸铵，1.5mmol/L EDTA,0.15%SDS)中煮沸5min，离心，取上清，无水乙醇 沉淀RNA，并重新溶解于20ylDEPC水中；以RNA为模板RT-PCR扩增双链DNA，体外转录出RNA文 库用于下一轮筛选;每轮筛选过程中RT-PCR得到双链DNA文库，以该双链DNA为模板体外转 录出RNA适配子库，筛选共进行10轮。得到了 15个适配子，其序列分别为SEQ ID N0:1-15所 示。具体序列如下所示：
[0022] sICAM-1-l：
[0023] ACGACTAACGTGTAACAGTCCAAGTATTCATACATACCATAAATTCATTGTCATTAACAGTGCATGATGCTACGAA (SEQ ID N0:1)
[0024] sICAM-1-2：
[0025] ACGACTAACGTGTAACAGCAGACACCATATATACTATCTACTACCACATACCTCTACCAGTGCATGATGCTACGAA (SEQ ID NO:2)
[0026] sICAM-1-3：
[0027] ACGACTAACGTGTAACAGCTAACTTCTTATAACTTAAGATACTTCTTCCAAACAACACAGTGCATGATGCTACGAA (SEQ ID NO:3)
[0028] sICAM-1-4：
[0029] ACGACTAACGTGTAACAGTACATCACTCTAATCTTCACGCCTCAGTTACATTCCCTTCAGTGCATGATGCTACGAA (SEQ ID NO:4)
[0030] sICAM-1-5：
[0031] ACGACTAACGTGTAACAGATGTATATTCCTTATATGACTATAATTCTTACCTATAAACAGTGCATGATGCTACGAA (SEQ ID NO:5)
[0032] sICAM-1-6：
[0033] ACGACTAACGTGTAACAGACCTCTATCTCACTCTTCCCTTTCGCCTACACATCCGAACAGTGCATGATGCTACGAA (SEQ ID N0:6)
[0034] sICAM-1-7：
[0035] ACGACTAACGTGTAACAGAGATTCACTAATATTTCTTCGCCTCGCCATACTTAAGATCAGTGCATGATGCTACGAA (SEQ ID NO:7)
[0036] sICAM-1-8：
[0037] ACGACTAACGTGTAACAGTACCCATCCACCTTCTTACTACTGCTCTCTCAATCTACACAGTGCATGATGCTACGAA (SEQ ID N0:8)
[0038] sICAM-1-9：
[0039] ACGACTAACGTGTAACAGACAGATACATTCATATCAAGTTACACATCTCCATGTTAACAGTGCATGATGCTACGAA (SEQ ID N0:9)
[0040] sICAM-1-10：
[0041] ACGACTAACGTGTAACAGCAGAACACAAATCTATACAAATCAGCATCACACTCATACCAGTGCATGATGCTACGAA (SEQ ID NO:10)
[0042] sICAM-1-11：
[0043] ACGACTAACGTGTAACAGATACCAATCGCCACCTACACTTACATCTAGACACTCTATCAGTGCATGATGCTACGAA (SEQ ID NO:11)
[0044] sICAM-1-12：
[0045] ACGACTAACGTGTAACAGTATCTACACATAGATCCTCCACTTAATAACAATCTGTCACAGTGCATGATGCTACGAA (SEQ ID NO:12)
[0046] sICAM-1-13：
[0047] ACGACTAACGTGTAACAGATACCTCATCAGATATTACATTCGCCAATATTTCTCTATCAGTGCATGATGCTACGAA (SEQ ID NO:13)
[0048] sICAM-1-14：
[0049] ACGACTAACGTGTAACAGTCTATAACGCCTAACTACACCACTCCACTCATTATAATACAGTGCATGATGCTACGAA (SEQ ID NO:14)
[0050] sICAM-1-15：
[0051] ACGACTAACGTGTAACAGATCTATTTCACCATTAAGAACCATATCGCATCACCCTTCCAGTGCATGATGCTACGAA (SEQ ID NO:15)
[0052] 实施例2sICAM_l蛋白结合适配子的性能测定
[0053] 将RNA适配子分别取2.0yg，用牛小肠碱性磷酸酶(CIP)37°C消化lh，纯化回收去磷 酸化的RNA;通过T4多核苷酸激酶标记[γ -32P]ATP于去磷酸化的RNA分子末端。lOnmol放射 性标记的RNA适配子分别与不同浓度（1-200ηΜ)的sICAM-1 37 °C孵育30min，各组反应液经 硝酸纤维素膜滤过，洗涤滤膜，干燥滤膜，液闪计数仪测定滤膜上残留的放射量，同一样品 平行做两次测定。计算各个适配子与sICAM-1的解离常数。结果如下：
[0054]
[0055] 实施例3所述适配子特异性分析以及稳定性分析
[0056] 分别采用人血白蛋白，免疫血清球蛋白，霍乱弧菌VgrG3C蛋白，大肠杆菌外膜蛋白 A，Lp-PLA2蛋白，与15条适配子进行特异性检测，经过结合试验发现，这些适配子都不与这 些蛋白相结合，而只与sICAM-1结合保持较高的特异性。
[0057] 将所述的适配子，取0.2ug，分别置于常温的血清、水溶液中，放置二周。通过RT-PCR检测，发现二周的放置其结构稳定，没有被降解。
[0058]实施例4所述适配子疾病的诊断
[0059] 将15个适配子分别与10个甲状腺相关眼病患者以及正常人的血液混合30min，通 过生物素分离，定量分析其中的sICAM-1蛋白的含量，通过分析发现，10个甲状腺相关眼病 患者中sICAM-1蛋白的含量相对于正常人显著增加。
[0060]以上仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人 员来说，凡在本发明的精神和原则之内所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本 发明的保护范围之内。
【主权项】
1. 一种用于眼病检测的试剂盒，其特征在于:包含核酸适体。2. 如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于:所述核酸适体为SEQ ID No: 10所述。 3. SEQ ID No: 10所述的适体在制备检测眼病的试剂盒中的应用。4. 如权利要求1-2所述的试剂盒，其特征在于:所述眼病为甲状腺相关眼病。5. 如权利要求3所述的应用，其特征在于:所述眼病为甲状腺相关眼病。
【文档编号】G01N33/68GK105974137SQ201610628510
【公开日】2016年9月28日
【申请日】2015年11月1日
【发明人】李倩
【申请人】李倩