用于分析对象聚群的方法和设备的制作方法

专利名称：用于分析对象聚群的方法和设备的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种用于处理并度量量化对象的图像的方法和设备，
所述对象包含点/斑点的聚群(cluster)，例如包括细胞聚群的生物样 本，特别是人类或动物源(origin)的细胞或者其图像。
背景技术：
包含点/斑点聚群的对象或对象图像的例子可以由包含细胞组的 生物组织例如受到急性或慢性炎症感染的组织来表示，也可以通过诸 如由卫星等所获取的城镇或城市图像的地形图像来代表。
通常借助于显微镜来执行对人类、动物或植物的组织的观察和分 析。已知这样一种工作站，其中显微镜可操作地与用于获取图像的照 相机或摄像机相连接并且与用于视觉分析和确立(elaboration)所获取 的图像的计算机相连接。
另一方面，当病理诊断需要观察身体部分或器官时，这种观察可 以是直接的或通过间接的手段，例如射线照相术、计算机轴向断层摄 影术(CAT)、描述生态学(ecography)分析等。而且，可以仅借助 于计算机或借助于计算机/照相机系统来获取并分析图像，即所观察的
身体部分或器官的数字图像。
然而在任何情况下，在已知的设备中存在几个缺点。主要缺点涉 及计算机处理所获取的图像的方式。在一些情况下，实际上有必要估 计所观察的身体部分或生物组织的物理和几何特性，从而评估病理的 演变。在应当评估点/斑点聚群所覆盖的面积时遇到了困难。在这种情 况下，已知的装置不能够对所需参数(周长、面积等)正确量化，因
此导致分析结果可能不正确甚至是误导性的。特定的例子是对发炎组 织的范围的度量量化，即由发炎细胞覆盖的面积，所述发炎细胞可分 组到聚群中和/或在所分析的组织中随机地分布。
因此需要一种改进的设备，使得可对需要这种量化的任何项的形 态测量参数的正确量化。
本发明阐明了以上及其他问题并且利用权利要求书中所描述的方 法和设备来解决它们。


参照附图通过非限制性例子给出的优选实施例的下列描述，根据 本发明的用于分析对象的图像的方法和设备的其他特性和优点将变得 清楚，其中
图1是根据本发明的设备的示意图2是示出根据本发明的用于获取图像的方法的流程图3是示出根据本发明的用于处理所获取的图像的方法的流程图。
具体实施例方式
本发明的方法允许人们分析并度量量化对象的图像，特别是包括 点/斑点聚群的对象的图像。当分析生物样本时常常重复出现这类对象。 然而，本发明的方法不应当仅限于这种特定的应用，而是可以有效地 用于任何应用领域，其中有必要分析对象的图像，无论通过显微镜观 察还是通过直接的图像观察，例如在地形或地球物理测量的情况下。
术语"生物样本(biological specimens)"这里指的是从人类、动 物或植物体(例如组织或细胞采样)所获取的任何种类的生物釆样或 者人类、动物或植物体部分的任何图像(例如射线照相术、描述生态 学、CAT等)。
下文中将描述的例子涉及用于获取并处理图像的系统1，其包括 显微镜2，该显微镜2具有能够沿着笛卡尔轴x、 y、 z移动的电动扫描 镜台(stage) 3。显微镜2优选为允许从25x直到1000x的放大倍数的类型。
显微镜2设置有至少一个物镜8、至少一个目镜4以及用于照相 机附件的至少一个图像4见频(photo-video)端口 5。对该后者来说，可 操作地连接电子图像获取装置6，特别是图像/视频照相机。优选地， 这种电子图像获取装置6是数字照相机，更优选地具有1.3兆像素的分 辨率。
电子图像获取装置6可操作地与处理系统7连接。处理系统7可 以借助于包括总线的个人计算机(PC)来实现，该总线将例如中央处 理器(CPU)的处理装置互连到存储装置，例如包括RAM工作存储器、 包含用于启动计算机的基本程序的只读存储器(ROM)、磁硬盘、可 选地还有用于读取光盘(CD-ROM)的驱动器(DRV)、可选地还有 用于读取/写入软盘的驱动器。此外，处理系统7可选地包括用于控制 与信息通信服务(telematics)网络通信的MODEM或其它网络装置、 键盘控制器、鼠标控制器和视频控制器的通信。键盘、鼠标和监视器8 连接到各自的控制器。电子图像获取装置6借助于接口端口 (ITF)连 接到总线。扫描镜台3也借助于控制接口端口 (CITF)连接到总线， 借此来控制该镜台沿着笛卡尔轴的移动。
在执行阶段期间被加载到工作存储器中的程序(PRG)以及各自 的数据库被存储在硬盘上。典型地，程序(PRG)分布在一个或多个 CD-ROM上，用于安装在硬盘上。
如果处理系统7具有不同的结构，例如如果所述处理系统7由连 接有各个终端的中央部件或由信息通信服务计算机网络(例如因特网、
内联网、VPN)构成，如果它具有其它部件(例如打印机)等，那么 应用类似的考虑。可替代地，所述程序在软盘上提供，被预先加载到
硬盘上，或者存储在可以由计算机读取的任何其它基质(substrate)上， 借助于信息通信服务网络发送到用户计算机，由无线电广播或者更一 般地以可以直接加载到用户计算机的工作存储器中的任何形式提供。
现在开始描述根据本发明的用于获取并处理生物样本的图像的方 法，样本承载滑动片置于显微镜2的扫描镜台3上。
应当指出，本发明的方法的一些步骤可以由计算机系统7通过执 行程序PRG来执行。
本发明的方法的第一阶段是其图像应当被获取并量化的对象识别 阶段(ID阶段)。
用于识别所关注对象的下列方法是基于以下假设的由于在所述 对象和背景之间亮度的高对比，所以可清楚地识别这种对象。如果在 所观察的样本中最初不存在这种高对比，则例如可以通过利用适当的
着色对样本进行着色来增强所述高对比，其中所述着色标记了对象或
些旦 冃尔。
在ID阶段的开始，按所想要的值来设置放大倍数，在该例子中放 大倍数为200x。所述方法通过下列步骤开始
la)产生由多个框形成的网格(grid)以在图像上重叠；然后
2a)由CPU向电动扫描镜台3发送命令，使得在轴x、 y上定位 在对应于显微镜物镜与图像必须被获取的网格的第一框的对准位置的 第一位置(开始位置)并且向电子图像获取装置6发送命令用于获取 此第一框的数字图像，所述图像临时保存在RAM存储器中。 一旦已经 获取一个框的图像，就
3a)由所述CPU评估在所述第一框中单个像素的亮度，将它与预 设值相比较并且确定在所述框内的亮度对比。然后所述方法通过下列 步骤继续
4a)向电动扫描镜台3发送命令，使得在轴x、 y上定位在对应于 网格的第二框的下一位置(第二位置)，向电子图像获取装置6发送 命令用于获取此第二框的数字图像并且将它临时保存在所述RAM存 储器上并且对这种图像重复步骤3)的操作。
所述方法通过下列步骤继续
5a)重复步骤4)的例程直到扫描完整个承载滑动片并且处理了网 格的每个框的图像。在整个例程的执行期间，将具有在预定义的值以 上的亮度对比的网格框的x、 y位置保存在硬盘存储器中。
优选地，根据下列方法来执行用于处理网格框的图像的步骤3a)， 所述图像已经临时保存在RAM存储器中。
i) 构建所分析框的像素的亮度强度的直方图，
ii) 根据直方图的平均值来计算标准偏差，并且
iii) 将标准偏差的计算值与预定义值相比较。
将具有在这种预定义值以上的标准偏差的框的位置保存在硬盘 上。标准偏差的这种预定义值取决于应当检测的对象种类，其依次取 决于肌体组织的种类、怎样着色等。
在点i) 、 ii)和iii)所描述的过程并不是用于执行步骤3)的唯 一可能，其它已知的方法也是适用的，而且具有即使在模糊图像的情 况下也允许可靠结果的优点。这里，实际上应当注意，在此阶段通常 尚未对图像进行聚焦。在识别出要被观察的对象之前的聚焦可能导致 整个过程所花费时间的不可接受的增加。
更优选地，由其中执行相同的步骤1)到5)但通过以较低放大倍 数(例如，25x到100x)来设置显微镜2的识别预览阶段(ID-PREV
阶段)来代替以上ID阶段或置于所述ID阶段之前。由于要反复迭代
(iterate)的网格框数将更少，因此该过程使得较快地执行ID阶段。 在ID-PREV阶段在ID阶段之前而不代替ID阶段的情况下，将只在整 个图像的区域上执行此ID阶段，在该区域中已经通过ID-PREV检测 到了对象的存在。
应当理解，上述对象识别阶段对于本发明的方法的执行不是严格 必须的，即使它允许所述方法自动化并且使其更快地执行。在缺少ID 阶段和/或ID-PREV阶段的情况下，可以手动地识别采样。另一方面， 由于可能会捕获整个承载滑动片图像，缺少人工识别阶段可能导致进 一步的图像获取阶段过长。
本发明的方法的第二阶段是聚焦设置阶段(FCS阶段)。根据此 第二阶段
lb)在要获取的对象图像上选择多个聚焦点； 2b) CPU向扫描镜台3发送命令以在显微镜的物镜下定位第一聚 焦点；
3b)对所述第一聚焦点调节焦距并且将其聚焦参数自动地保存在 处理系统7的存储装置中；
4b)对于每个点重复步骤2b)和3b)的例程。
优选通过下列过程自动地执行步骤3b):
3bi)沿着z驱动轴选择多个，优选为五个，聚焦位置；
3bii)对于每个聚焦位置，计算亮度对比，比较这样获得的亮度对
比值并且选择具有最高亮度对比值的聚焦位置；
3biii)分别在所选择的聚焦位置以及在步骤3bi)的之前和之后较
近的聚焦位置之间选择另外两个聚焦位置；
3biv)重复步骤3bi) 、 3bii)和3biii)达预设的次数，优选不超
过五次；
3bv)将所找到的聚焦位置保存在处理系统7的存储装置中。
根据上述过程(步骤3a)来获得亮度对比。
在步骤lb)中所选择的聚焦点可以彼此相等地间隔开或者在任何 情况下均匀地分布在对象表面上。更优选地，选择九个聚焦点并且其 位于在所检査对象中内接的最大平行六面体的四个角、中心以及各边 的中点。
所述方法的第三阶段是白校准阶段(WCAL阶段)。此阶段通过 下列过程执行
lc)通过电子图像获取装置6获取承载滑动片的非样本区域(空 白图像)并且将它保存在处理系统7的存储装置中。
在随后的图像获取阶段中，由每个图像区域的所获取的图像减去 此空白图像。这允许在所获取的图像中消除任何边界阴影效应 (borderline shadow effect)。
本发明的方法的第四阶段是图像获取阶段(IM-ACQ阶段)，所 述阶段根据下列步骤实现
Id) CPU向扫描镜台3发送命令，以便对准显微镜的物镜将它移 动到根据先前步骤5a)所选择的网格的第一保存框位置；
2d)对最接近所述第一框的至少两个聚焦点，通过从根据先前步 骤lb)到4b)所计算的聚焦参数进行内插来计算所述第一框图像的聚 焦参数；
3d)通过所述图像获取装置6来获取所述第一框的图像； 4d)从所获取的第一框的图像减去根据上面步骤lc)所获取的空 白图像；
5d)将源于步骤4d)的图像保存在处理系统7的存储装置中； 6d)重复步骤ld)到5d)，直到已经扫描了要获取的整个对象； 7d)通过将单个框的图像相对于它们的初始位置对准来重新组合
所述对象的整个图像并且将所述整个图像保存在所述处理系统7的存 储装置中。
优选地，重新组合对象的整个图像的所述步骤7d)通过下列过程 来实现
1)通过在对准的方向上重叠图像边的边缘来将每个框的图像与邻 近框的图像对准；
m)在重叠区域中，通过彼此相对地移位所述框的图像来使在重 叠像素之间的亮度和/或颜色强度差最小化；
n)对于每对邻近的框，重复步骤l)和m)。
本发明的方法的下一阶段是图像确立阶段(IMA-EL阶段)。此阶 段通过将图像量化为"1比特"来执行，以便选择图像的区域，在该区 域上执行进一步的计算。根据下列步骤来实现IMA-EL阶段
le)考虑每个像素的参数；
2e)将所述像素的参数与所述参数的预设阈值或阈值范围相比较； 3e)根据所述比较来选择有效像素聚群和无效像素聚群。
所述像素的参数优选为亮度强度(黑白图像)或数字颜色值。所 述参数的预设阈值或范围将取决于应当检测的对象的种类，其依次取 决于肌体组织的种类、怎样着色等或者取决于所述图像是黑白图像(例 如射线照相术)还是任何种类或来源的彩色图象。在任何情况下都可 以由技术人员选择这种阈值或范围，对于特定情况，其不必练习任何 发明技能。例如，如果其图像必须被获取的对象是由免疫组织化学 (immunohistochemistry)治疗的发炎细胞，那么有效像素可以是对于 红色具有在0和255之间的数字值、对于蓝色具有在60和255内的数 字值并且对于绿色具有在0和160之间的数字值的那些像素。
一旦数字图像已经量化为1比特，本发明的方法就提供用于度量 处理所述图像的阶段，所述阶段依次包括下面将要描述的不同阶段。
本发明的方法的下一阶段是对象的量化阶段(OUANT阶段)。
QUANT阶段的第一步骤是计算所检查的对象的面积。测量单位可 以是/^2或像素。从而通过计数属于根据先前IMA-EL阶段所选择的有 效像素聚群的像素数目并且乘以像素面积的结果来计算所检查对象的 面积A。像素的面积是取决于几个因素的已知参数，例如数字摄像机 参数、放大倍数等。
依照这种方式，计算聚于群的和非聚于群的点/斑点(随机分布) 集的总面积AT。在包含细胞集(即，发炎细胞等)的生物组织的情况 下，每个点/斑点对应于其中细胞无法单独挑出的细胞或细胞子集。可 以通过求和每个点/斑点的面积来计算聚于群和非聚于群的细胞的总面 积ATINF。
已知所检査细胞子集中的细胞周长相当不规则并且为了能够用良 好的逼近性计量其面积，估计其分形维数DA。可以使用已知的"计盒 (box-counting)"算法来自动地确定此分形维数。
根据"计盒"方法，由以下数学公式来给出分形维数D "-lim一)[log,/log,]
其中e是网格的框的边的长度，其中对象的图像已经被划分并且 W(f)是完全覆盖所测量对象的面积(DA)所需的框数。长度e以像素 或/zm来表示并且在本计算方法中，e趋向于l个像素。
从而本发明的方法的下一阶段是维数计算阶段(DIM-CLC阶段)。
为了避免在这种计算中的困难，分形维数DA被近似为通过在笛卡 尔轴系中加入参数log 比log(l一)所获得的直线斜率。
在实践中，用来确定DA的方法包括由处理系统7的CPU执行的 下列步骤
a) 将对象的图像划分为具有边长e的框的多个网格，其中e从第
一值以及作为所述第一值一小部分的预定义值改变，所述第一值基本 上对应于所述对象在其中内接的框的边，
b) 对步骤a)的每个e值，计算iV(s)的对数函数值和l/s的对数函 数值，其中7V(s)是完全覆盖对象(细胞或细胞子集)的面积(A)所需 的框数，从而获得iV(s)的所述对数函数的第一组值和l/s的所述对数函 数的第二组值，
c) 将分形维数DA计算成在步骤b)的所述第一组值对照所述第 二组值做内插的的直线的斜率。
如先前所述，通过对根据上述IMA-EL阶段所选择的有效像素进 行标准形态定量估计，即通过计数属于相同区域的有效像素的数目， 来计算面积At或Atinf。为了这样做，必须首先识别属于相同区域即 属于相同小对象的有效像素，然后计算每个区域的面积。因此，本发 明的方法包括对象的分类阶段(SORT阶段)，包括下列步骤
lf)在x、 y轴系上沿着预定义的方向扫描被量化为"1比特"的图像；
2f)沿着所述扫描方向选择第一有效像素，所述有效像素由第一 组x、 y值来识别，所述第一有效像素属于第一对象的图像；
3f)在方向线上，在紧挨着所述选择的像素位置处，对所述第一 选择的有效像素执行搜索例程；
4f)反复执行步骤3f)直到找到无效像素；
5f)向根据这种步骤3f)和4f)所选择的每个有效像素分配一组 x、 y值，将它们保存在处理系统7的存储装置中(所有这种像素按渐 进顺序具有相同的y值和x值)并且在对象的图像中将所述像素从有效切换为无效；
6f)在垂直于所述扫描方向的方向上，对根据步骤3f) 、 4f)和 5f)所选择的每个像素评估两个接下来的像素并且选择有效像素；
7f)对根据步骤6f)所选择的每个有效像素执行步骤3f)到5f) 的例程；
8f)反复执行步骤6f)和7f)直到已经保存属于相同对象的所有 连接像素；
9f)重复步骤lf)和2f)直到找到另一对象的图像的第一有效像
素；
10f)重复步骤3f)到9f)直到已经扫描整个图像。
步骤lf)中的预定义方向优选从左至右从上到下开始。
在上面步骤lf)到10f)中所描绘的过程允许识别由4连接像素所 组成的对象，即其中所述像素具有共同的一边。
为了分类8连接像素对象，如下地修改上面过程的步骤6f): 6f)在垂直于所述扫描方向的方向上，对根据步骤3f) 、 4f)和 5f)所选择的每个像素评估两个接下来的像素以及在邻近方向线的平行 线上评估与这两个像素中的每个相邻近的两个像素并且选择有效像
素。 .
然后根据步骤7f)到10f)进行该过程。
上面所描绘的过程是半递归方法，相对于现有技术的标准递归方 法，它允许更短的执行时间和更少的存储器需求。实际上，考虑由MxiV 个有效像素所组成的图像，只需要M次递归调用，而根据现有技术方 法，递归调用的数目可能为WxM-l。
根据下列步骤由对象单一化(OBJ-SNG)阶段来完成SORT阶段 lg)将具有长度或宽度的至少一个大于10微米的对象细分为10 微米边的对象；
2g)通过计数属于所述对象的图像的像素数目并且将它乘以每个
像素的面积来计算根据SORT阶段和步骤lg)所识别的对象的面积； 3g)删除源于细分步骤lg)所产生的具有面积<5微米2的对象； 4g)将根据SORT阶段和步骤lg)至3g)所识别的每个对象与具
有IO微米边的框的网格相重叠；
5g)计算对应于步骤4g)的每个框的有效像素的一组xp y,值， 并且将它单独地保存在处理系统7的存储装置中，使得每个框识别单 个对象。
所述细分步骤lg)包括下列步骤
lgi)对每个对象，找到外接该对象的、具有最小尺寸nx、 my的 多边形；
lgii)检査nx或my中的至少一个是否>10微米；
lgiii)如果检査步骤lgii)是肯定的，那么将所述多边形与具有
IO微米边的框的网格相重叠；
lgiv)将所述对象细分为部分，每个所述部分内接在网格的框中
并且忽略空的框。
在SORT和OBJ-SNG阶段之后，执行三角化阶段(TRIANG阶段)。 在本发明中，使用根据Ddaunay算法的三角化方法。
通常，对点的聚群进行Delaimay三角化提供了用于连接每对点并 且满足所谓的"空圆"属性的线段(segment)集合。即对于每个线段 来说，必须可以找到只包含该线段的顶点而不包含该聚群的其它点的 一个圆。此算法是公知的并且在以下几个出版物中有所描述GuibasL. 等人的"Primitives for the Manipulation of General Subdivision and the Computation of Voronoi Diagrams" ， ACT TOG， 4(2)， 1985年4月； Fortune S.的 "A Sweepline Algorithm for Voronoi Diagrams"， Algorithmica， 2:153-174， 1987年；Leach G.的"Improving Worst-Case Optimal Delaunay Triangulation Algorithms"， 第4届关于计算几何学 的加拿大会议，1992年。
24 因此，在组织样本表面上的每个发炎细胞被认为是连续架构的节 点，其覆盖由非常不规则的三角形部分所组成的整个部分，其中每个 三角形与一个邻近的三角形具有共同的边。利用由最外部的三角形边 所形成的连续线来任意地识别聚群的边界，所述三角形边具有《20;/m 的长度，大约对应于淋巴细胞直径(7~12/^)的二倍。由此边界所界 定的所有点(细胞)被认为属于聚于群的细胞的子集I，而由较长线段 所连接的点被认为是非聚于群的发炎细胞(子集II)。
从而，为了执行所述TRIANG阶段，根据上面步骤lgv)所保存 的对象/框必须变换为点。因此，TRIANG阶段提供了用于
lh)计算根据步骤5g)所保存的每个框的中心点，其具有坐标 A+X2/2和少,+^/2，其中Xl， y1; xP y2; x2， y1; x2， y2分别是每个 框的顶点的坐标；
2h)将对应于框的每个中心点的x、 y值保存在处理系统7的存储 装置中作为点集。
然后TRIANG阶段执行下列步骤 3h)考虑根据步骤2h)所获得的点集中的一对点； 4h)绘制其周边包含所述两个点的圆并且检查所述圆是否包含点 集的其它点；
5h)只有在所述检查为否定的并且所述两个点的距离小于或等于 20微米时，才在两个点之间绘制线段；
6h)对点集中的每对点重复步骤3h) 、 4h)和5h)，从而获得三 角形网格；
7h)在处理系统7的存储装置中，保存在三角形网格中所包括的 点的第一子集(子集I)作为聚于群的点，并且保存点的第二子集(子 集II)作为非聚于群的点，非聚于群的点与每个最接近的点的距离大于 20微米。
本发明的方法的下一阶段是参数计算阶段(PAR-CLC阶段)。
要计算的第一参数是由TRIANG阶段(PERI-CLC)所获得的三角 形网格的外周长。根据下列步骤执行此计算
li)在三角形网格中为每个三角形的每个线段编索引并且保存三 角形网格的线段的识别索引集；
2i)为用于将聚于群的点的任何边界点与最近的非聚于群的点连 接的每个线段编索引，并且保存用于非聚于群线段的识别索引集；
3i)求和线段的长度，所述线段的识别索引在所述三角形网格的 识别索引集中仅重复出现一次；
4i)双重求和所述非聚于群的线段的识别索引集中线段的长度。
要计算的第二参数是聚群的面积Ar (AC-CLC)，对应于三角形 网格的面积。此计算包括下列步骤
11)计算三角形网格的每个三角形的面积； 21)求和三角形网格的所有三角形的面积。
要计算的第三参数是聚于群对象(在该具体例子中，为聚于群的
发炎细胞)的面积A「T^ (ACINF-CLC)。如上所述，在QUANT阶段 以及在OBJ-SNG阶段的步骤2g)中进行此计算，即通过求和聚群内(即 在三角形网格的周长内)的有效像素并且将产生的数目乘以每个像素 的面积。
然后由下列表达式获得非聚于群对象(即发炎细胞)的面积ApT^ (APINF隱CLC):
ApiNF = A頂F AciNF
其中根据QUANT阶段计算Ato^并且上面只是示出了 Acinf。
要计算的下一参数是聚于群对象的密度Dc (DC-CLC)，其由下 式获得<formula>formula see original document page 27</formula>
要计算的最后一个参数是Hurst指数(H-CLC)，根据下列表达式
H = E + (1-DA)
其中E是欧几里得维数(在这种情况下E-1)并且Da是分形維 数(参见DIM-CLC阶段)。
显然以上参数可以用于各个目的。特别地，在分析发炎组织的情 况下，这些参数可以给出关于疾病状态以及疾病进展程度的有用指示。
从上述内容，如果与己知方法相比较，显然本发明的计算方法体 现了改进。分形几何提供了源自微积分的数理模型，当其应用于欧几 里得几何学时，结合自然的和不规则对象的形态定量测量图，从而使 它们更接近于实际值。
即使上述方法被解释为借助于显微镜来检查组织样本，如前所述， 显然它还可以应用于人类或动物体或其部分的图像，例如射线照相术 图像、计算机轴向断层摄影术(CAT)、描述生态学分析等。在这种 情况下，不必使用显微镜，这是因为图像可以由摄像机直接数字化并 且由计算机软件获取。因此，所述方法的相同的阶段基本上还可以应 用于这种图像，唯一差异在于图像获取装置6在不插入显微镜的情况 下直接读取所述图像。
在这种情况下，其中要求识别小对象或具有模糊轮廓的对象，(例 如射线照相术)，上述的ID阶段不允许高效的识别，使得应当使用不 同的方法。
对象识别的可能过程利用被称作四叉树(QuadTree)的图像表示 方法。根据这种已知的方法，图像首先被划分为四个四分块。每个四 分块又依次被划分为四个子四分块，等等，直到得到1像素边的四分
块。图像信息被报告到4度树，其中双亲节点包含所有子女节点(从 每个双亲节点产生四个子女节点)共同的信息，所述子女节点是指所 述双亲四分块被划分成的四个四分块。
适于本发明的方法的第一候选识别过程是包括下列步骤的图像减 去技术
lm)产生要检査的对象的模糊图像；
2m)从所述对象的图像中减去所述模糊图像以便获得这样的图
像，其中亮色区域对应于具有较高对比的图像区域并且暗色区域对应 于具有较低对比的图像区域；
3m)将其颜色或亮度值在预定义阈值以上的区域的图像保存在处 理系统7的存储装置中。
优选地，产生模糊图像的步骤lm)通过以下过程执行
-根据四叉树方法将所述图像反复地划分为四分块，直到四分块具 有预定义的边长(优选地，l像素边长的四分块)；
-以每个划分标度为每个四分块计算所述像素的平均值，以便使每 个四分块与一组值相关联；
-产生彩色图(RGB图像)或强度图(灰度图像)，其中每个点值 是每个四分块的该组值的平均值，所述颜色或强度图是原始图像的模 糊图像。
在此上面所描述的过程特别适合于小对象检测的情况，或者适于 将前景中的对象与背景区分开。
此外，通过调节模糊度，例如通过只选择在预定大小以下的对象 可以区分不同尺寸的对象。实际上，如果一旦到达例如IO像素的最小 四分块大小(而不是最小1像素大小)就停止四叉树过程，那么模糊 度更高，这意味着获得更模糊的图像。如果根据上面步骤2h)从对象 的图像中减去这种更模糊的图像，那么排除了所有具有IO像素以上大
小的对象并且所产生的图像只示出较小的对象。
适于本发明的方法的ID阶段的第二种替换识别过程包括根据下 列步骤产生均匀图
In)根据四叉树方法反复地将图像划分为四分块，直到所述四分 块具有预定义的边长(优选地，l像素边的四分块)；
2n)以每个划分标度为每个四分块计算作为标准偏差除以像素平 均值所获得的相对离散度(RD)，以便使每个四分块与一组RD值相 关联；
3n)产生均匀图作为灰度图像，每个点的亮度由每个四分块的该 组RD值的平均值给出，其中具有高亮度的图像区域对应于均匀区域；
4n)选择具有在预定义阈值以上的亮度强度的均匀图的像素，并 且将它们的位置保存在处理系统7的存储装置中。
当然，只是描述了根据本发明的用于分析生物组织样本的方法和 设备的一些具体实施例，并且本领域技术人员将能够对其进行适合特 定应用所需的任何修改，而并不偏离本发明的保护范围。
权利要求
1. 用于处理不规则形对象的图像的方法，所述对象呈点状或斑点形对象的至少一个聚群的形态，所述方法包括获取所述对象的数字图像的阶段，用于把所述数字图像量化为1比特的图像确立(IMA-EL)阶段，以及用于度量处理所述1比特量化图像的阶段，其中所述度量处理阶段包括对象的度量量化(QUANT)阶段，该度量量化阶段又依次包括三角化(TRIANG)阶段，用于把所述点状或斑点形对象的至少一个聚群变换为三角形的网格，其中三角形的顶点对应于所述点状或斑点形对象的中心；参数计算(PAR-CLC)阶段，用于计算下列参数中的至少一个-所述三角形网格的外周长；-所述三角形网格的面积(AC)；-在所述三角形的网格内的所述点状或斑点形对象的面积(ACINF)；-在所述至少一个聚群之外的孤立的点状或斑点形对象的面积(APINF)；-在所述至少一个聚群之内的所述点状或斑点形对象的密度(DC)。
2. 如权利要求1所述的方法，进一步包括对象分类(SORT)阶 段，用于识别由4连接像素组成的对象，该阶段包括下列步骤lf)在x、 y轴系上沿着预定义方向扫描被量化为"1比特"的图像；2f)沿着所述扫描方向选择第一有效像素，所述有效像素由第一 组x、 y值来识别，所述第一有效像素属于第一对象的图像；3f)在该方向线上，在所述选择的像素的紧接着的各位置，对所 述第一选择的有效像素执行搜索例程；4f)反复执行步骤3f)直到找到无效像素；5f)向根据这样的步骤3f)和4f)选择的每个有效像素分配一组 x、 y值，将它们保存在处理系统7的存储装置中，并且在对象的图像 中把所述像素从有效切换为无效；6f)在垂直于所述扫描方向的方向上，对根据步骤3f) 、 4f)和 5f)选择的每个像素评估两个紧接着的像素并且选择有效像素；7f)对根据步骤6f)选择的每个有效像素执行步骤3f)至5f)的 例程；8f)反复执行步骤6f)和7f)直到已经保存了属于相同对象的所 有连接像素；9f)重复步骤lf)和2f)直到找到另一对象的图像的第一有效像素；10f)重复步骤3f)到9f)直到已经扫描了整个图像。
3. 如权利要求2所述的方法，其中步骤lf)中的所述预定义方向 优选从左至右从上到下开始。
4. 如权利要求2或3所述的方法，其中还执行根据权利要求2的 步骤lf)到10f)的对象分类阶段，用于识别由8连接像素所组成的对 象，所述阶段中的步骤6f)修改如下6f)在垂直于所述扫描方向的方向上，对根据步骤3f) 、 4f)和 5f)所选择的每个像素评估紧接着的两个像素以及在邻近该方向线的平 行线上评估与这两个像素中的每个相邻近的两个像素并且选择有效像 素。
5. 如权利要求1到4中任意一项所述的方法，进一步包括对象单 一化(OBJ-SNG)阶段，该阶段包括下列步骤lg)把长度或宽度的至少一个大于IO微米的对象细分为10微米 边的对象；2g)通过计数属于所述对象的图像的像素数目并且把该数目乘以 每个像素的面积来计算根据所述SORT阶段和步骤lg)所识别的对象 的面积；3g)删除细分步骤lg)所产生的面积小于5微米2的对象；4g)把根据所述SORT阶段和步骤lg)至3g)所识别的每个对象 与具有IO微米边的框的网格相重叠；5g)计算对应于步骤4g)的每个框的有效像素的一组x,、 yi值， 并且把所述值独立地保存在处理系统(7)的存储装置中，从而使得每 个框识别单个对象。
6. 如权利要求5所述的方法，其中所述细分步骤lg)包括下列步骤lgi)对每个对象，找到外接该对象的、具有最小尺寸nx、 my的矩形；lgii)检查nx或my中的至少一个是否大于IO微米；lgiii)如果检查步骤lgii)的结果是肯定的，则把所述对象与具有IO微米边的框的对象相重叠；lgiv)把所述对象细分为各部分，每个所述部分内接在所述网格的框中，并且忽略空的框。
7. 如权利要求2到6中任意一项所述的方法，其中所述三角化 (TRIANG)阶段包括下列步骤1h)计算根据步骤5g)所保存的每个框的中心点，具有坐标x,+;^/2 和少,+h/2，其中xp y1; Xl， y2; x2， y1; x2， y2分别是每个框的顶点 的坐标；2h)把对应于每个框的中心点的x、 y值保存在处理系统(7)的 存储装置中作为点集；3h)考虑根据步骤2h)所获得的所述点集中的一对点；4h)绘制圆周包含所述两个点的圆，并且检查所述圆是否包含所 述点集中的其它点；5h)仅当所述检査的结果为否定的并且所述两个点的距离小于或 等于20微米时，才在所述两个点之间绘制线段；6h)对所述点集中的每对点重复步骤3h) 、 4h)和5h)，从而获 得三角形网格；7h)在处理系统7的存储装置中，保存在所述三角形网格中所包 括的点的第一子集(子集I)作为聚于群的点，并且保存点的第二子集 (子集II)作为非聚于群的点，非聚于群的点与每一个最接近的点的距 离大于20微米。
8. 如权利要求1到7中任意一项所述的方法，其中所述三角形网 格的外周长的所述计算包括下列步骤li)为三角形网格中每个三角形的每个线段编索引，并且保存所 述三角形网格的线段的识别索引集；2i)为用来把聚于群的点的任何边界点与最近的非聚于群的点连 接的每个线段编索引，并且保存用于非聚于群的线段的识别索引集；3i)对那些识别索引在所述三角形网格的识别索引集中仅重复出 现一次的线段求和；40双重求和所述非聚于群的线段的识别索引集中的线段的长度。
9. 如权利要求1到8中任意一项所述的方法，其中所述的三角形 网格的所述面积(Ac)的计算包括11)计算所述三角形网格的每个三角形的面积； 21)求和所述三角形网格的所有三角形的面积。
10. 如权利要求1到9中任意一项所述的方法，其中所述三角形 网格内的点状或斑点形对象的所述面积(ACINF)的计算包括对所述三 角形网格内的有效像素求和并且将所产生的结果乘以每个像素的面 积。
11. 如权利要求1到10中任意一项所述的方法，其中所述的在所 述至少一个聚群之外的孤立的点状或斑点形对象的所述面积的计算包 括应用下列表达式<formula>formula see original document page 5</formula>其中ATINF是通过求和所述图像的所有有效像素并且把所产生的 数目乘以每个像素的面积所计算的对象总面积，并且AdOT是根据权利 要求10所计算的在所述三角形网格内的所述点状或斑点形对象的面 积。
12. 如权利要求1到11中任意一项所述的方法，其中所述的在所 述至少一个聚群之内的所述点状或斑点形对象的密度(Dc)的计算包括应用下列表达式DC = ACINF/AC。
13. 如权利要求1到12中任意一项所述的方法，进一步包括根据 下列表达式计算Hurst指数(H-CLC)的阶段H = E + (1-DA)其中E是欧几里得维数并且Da是分形維数，其中在维数计算 (DIM-CLC)阶段计算所述分形维数DA，所述维数计算阶段包括a) 把对象的图像划分为多个边长为e的框的网格，其中e从第一 值和作为所述第一值一小部分的预定义值改变，所述第一值基本上对 应于把所述对象内接于其中的框的边，b) 对步骤a)的每个e值，计算W(s)的对数函数值和l/s的对数函 数值，其中iV(《是为了完全覆盖对象(细胞或细胞子集)的面积(A) 所需的框数，从而获得所述W(《的对数函数的第一组值和所述1/s的对 数函数的第二组值，c) 把分形维数DA计算成在步骤b)的所述第一组值对照所述第 二组值做内插的直线的斜率。
14. 如权利要求1到13中任意一项所述的方法，其中根据下列步 骤执行所述图像确立(IMA-EL)阶段le)考虑每个像素的参数；2e)把所述像素的参数与所述参数的预设阈值或阈值范围相比较； 3e)根据所述比较来选择有效像素聚群和无效像素聚群。
15. 如权利要求14所述的方法，其中所述像素的参数是亮度强度 (黑白图像)或数字颜色值。
16. 如权利要求1到15中任意一项所述的方法，其中所述的获取所述对象的数字图像的所述阶段包括下列阶段-)提供用于获取并处理图像的系统(1)的阶段，所述系统(1) 包括具有能够沿着笛卡尔轴X、 y、 z移动的电动扫描镜台(3)的显微镜(2)，可操作地连接到所述显微镜(2)的电子图像获取装置(6),， 所述电动扫描镜台(3)和电子图像获取装置(6)可操作地连接到处 理系统(7)，所述处理系统(7)包括处理部件(CPU)以及存储装置， 所述存储装置包括RAM工作存储器和硬盘；-)用于保存所述对象的图像的笛卡尔参数的对象识别阶段(ID)，以及-)所述识别对象的图像获取(IM-ACQ)阶段。
17. 如权利要求16所述的方法，其中所述对象识别阶段(ID)包 括下列步骤la)按所述显微镜(2)的预设放大倍数产生由多个框所形成的网 格，以重叠在图像上；2a)向电动扫描镜台(3)发送命令，使得在轴x、 y上定位在对 应于显微镜物镜与图像必须被获取的网格的第一框的对准位置的第一 位置(开始位置)，并且向所述电子图像获取装置(6)发送命令以用 于获取此第一框的数字图像，所述图像临时保存在工作存储器(RAM) 中；3a)评估在所述第一框中单个像素的亮度，将它与预设值相比较 并且确定在所述框内的亮度对比；4a)向电动扫描镜台(3)发送命令，使得在轴x、 y上定位在对 应于所述网格的第二框的下一位置(第二位置)，向电子图像获取装 置(6)发送命令以获取此第二框的数字图像并且将它临时保存在所述 工作存储器(RAM)上并且对该图像重复步骤3)的操作；5a)反复执行步骤4)的例程直到扫描完整个承载滑动片并且处理 了所述网格的每个框的图像，其中在整个例程的执行期间，把具有在预定义的值以上的亮度对比的网格框的x、y位置保存在硬盘存储器中， 其中所述显微镜(2)的所述预设放大倍数优选为200x放大倍数。
18. 如权利要求17所述的方法，其中根据下列方法执行用于处理 网格的框的图像的所述步骤3a),其中所述图像已经临时保存在所述 工作存储器(RAM)中i)构建所分析框的像素的亮度强度的直方图，ii)根据所述直方 图的平均值计算标准偏差，并且iii)把标准偏差的计算值与预定义的 值相比较，其中把具有在这种预定义值以上的标准偏差的框的位置保 存在硬盘上。
19. 如权利要求1到18中任意一项所述的方法，其中由识别预览 阶段(ID-PREV)代替所述ID阶段或置于所述ID阶段之前，所述识 别预览阶段包括如权利要求17中所述的步骤la)到5a)，并且其中在 25x和100x之间选择所述显微镜(2)的放大倍数。
20. 如权利要求16到19中任意一项所述的方法，进一步包括聚 焦设置阶段(FCS)，包括下列步骤lb)在待获取的对象图像上选择多个聚焦点；2b)所述CPU向扫描镜台(3)发送命令使得在显微镜的物镜下 定位第一聚焦点；3b)对所述第一聚焦点调节焦距并且将其焦点参数自动地保存在 处理系统(7)的存储装置中；4b)对于每个点重复步骤2b)和3b)的例程。
21. 如权利要求20所述的方法，其中优选按照下列过程自动地执 行步骤3b):3bi)沿着z驱动轴选择多个，优选为五个，聚焦位置；3bii)对每个聚焦位置，计算亮度对比，比较这样获得的各亮度对 比值并且选择具有最高亮度对比值的聚焦位置；3biii)分别在所选择的聚焦位置与在步骤3bi)的之前和之后的较 近的聚焦位置之间选择另外两个聚焦位置；3biv)反复执行步骤3bi) 、 3bii)和3biii)达预设的次数，优选 不超过五次；3bv)把所找到的聚焦位置保存在处理系统(7)的存储装置中。
22. 如权利要求20或21所述的方法，其中所述选择的各聚焦点 彼此等距地间隔开或者均匀分布在对象表面上。
23. 如权利要求22所述的方法，其中选择九个聚焦点并且置于所 检查对象中内接的最大平行六面体的四个角、中心以及各边的中点。
24. 如权利要求16到23中任意一项所述的方法，进一步包括白 校准(WCAL)阶段，包括lc)通过电子图像获取装置(6)获取非样本区域的图像(空白图 像)并且将它保存在处理系统(7)的存储装置中。
25. 如权利要求16到24中任意一项所述的方法，其中所述图像 获取(IM-ACQ)阶段包括下列步骤ld)向所述扫描镜台(3)发送命令，使得将它移动到根据权利要 求17的先前步骤5a)所选择的网格的第一保存框位置，对准显微镜的 物镜；2d)对接近所述第一框的至少两个聚焦点，通过从根据先前步骤 lb)到4b所计算的聚焦参数进行内插来计算所述第一框图像的聚焦参 数；3d)通过所述图像获取装置(6)来获取所述第一框的图像； 4d)从所获取的第一框的图像减去根据上面步骤lc)所获取的空 白图像；5d)把步骤4d)产生的图像保存在处理系统(7)的存储装置中；6d)重复步骤ld)到5d)，直到已经扫描了要获取的整个对象； 7d)通过将单个框的图像相对于它们的初始位置对准来重新组合 所述对象的整个图像并且将所述整个图像保存在所述处理系统(7)的存储装置中。
26. 如权利要求25所述的方法，其中用于重新组合所述对象的整 个图像的所述步骤7d)包括1)通过在对准的方向上重叠图像边的边缘来把每个框的图像与邻 近框的图像对准；m)在重叠区域中，彼此相对地移位所述框的图像，使得在重叠 像素之间的亮度和/或颜色强度差最小化；n)对于每对邻近的框，重复步骤l)和m)。
27. 如权利要求16到26中任意一项所述的方法，其中通过下列 过程执行所述ID阶段lm)产生待检查的对象的模糊图像；2m)从所述对象的图像中减去所述模糊图像以获得这样的图像， 其中亮色区域对应于具有较高对比的图像区域并且暗色区域对应于具 有较低对比的图像区域；3m)把颜色或亮度值在预定义阈值以上的区域的图像保存在处理 系统(7)的存储装置中。
28. 如权利要求27所述的方法，其中产生模糊图像的所述步骤 lm)包括-)根据四叉树方法反复地将所述图像划分为四分块，直到四分块 具有预定义边长；-)按每个划分标度为每个四分块计算像素的平均值，使得每个四 分块与一组值相关联；-)产生彩色图(RGB图像)或强度图(灰度图像)，其中每个点 值是每个四分块的所述一组值的平均值，所述颜色或强度图是原始图像的模糊图像。
29. 如权利要求16到26中任意一项所述的方法，其中按照下列过程执行所述ID阶段In)根据四叉树方法把所述图像反复地划分为四分块，直到四分块具有预定义的边长；2n)按每个划分标度为每个四分块计算作为标准偏差除以像素平 均值而获得的相对离散度(RD),使得每个四分块与一组RD值相关 联；3n)产生作为灰度图像的均匀图，每个点的亮度由每个四分块的 所述一组RD值的平均值给出，其中具有高亮度的图像区域对应于均匀 区域；4n)选择具有在预定义阈值以上的亮度强度的均匀图的像素，并 且将它们的位置保存在处理系统(7)的存储装置中。
30. 如权利要求16到29中任意一项所述的方法，其中所述系统 (1)包括能够沿着笛卡尔轴x、 y、 z移动的电动扫描镜台(3)，可操作地与所述电动扫描镜台(3)对准的电子图像获取装置(6)，所述 电动扫描镜台(3)和所述电子图像获取装置(6)可操作地连接到处 理系统(7)，所述处理系统(7)包括处理部件(CPU)以及存储装置， 所述存储装置包括RAM工作存储器和硬盘。
31. —种用于获取并处理图像的系统(1)，包括能够沿着笛卡尔 轴x、 y、 z移动的电动扫描镜台(3)，可操作地与所述电动扫描镜台(3)对准的电子图像获取装置(6)，所述电动扫描镜台(3)和所述 电子图像获取装置(6)可操作地连接到处理系统(7)，所述处理系 统(7)包括处理部件(CPU)以及存储装置，所述存储装置包括RAM 工作存储器和硬盘，所述处理系统(7)运行程序(PRG)以执行如权 利要求1到30中任意一项所述的方法。
32. —种用于执行如权利要求1到30中任意一项所述的方法的软 件程序(PRG)。
33. —种计算机可读载体，包括用于执行如权利要求1到30中任 意一项所述的方法的程序(PRG)。
34. 如权利要求31所述的系统(1)的使用，用于执行如权利要 求1到30中任意一项所述的方法。
全文摘要
本发明涉及一种用于处理并度量量化对象的图像的方法和设备，所述对象包含点/斑点的聚群，诸如包括细胞聚群的生物样本，特别是人类或动物源的细胞或者其图像。特别地，本发明涉及一种用于处理呈点状或斑点形对象的至少一个聚群形态的不规则形对象的图像的方法，包括获取所述对象的数字图像的阶段、用于将所述数字图像量化为1比特的图像确立(IMA-EL)阶段以及用于度量处理所述1比特量化图像的阶段，其中所述度量处理阶段包括对象的度量量化(QUANT)阶段，其依次包括-用于将所述点状或斑点形对象的至少一个聚群变换为三角形网格的三角化(TRIANG)阶段，其中所述三角形的顶点对应于所述点状或斑点形对象的中心；-用于计算下列参数的至少一个的参数计算(PAR-CLC)阶段-所述三角形网格的外周长；-所述三角形网格的面积(AC)；-在所述三角形网格内的所述点状或斑点形对象的面积(ACINF)；-在所述至少一个聚群外的孤立的点状或斑点形对象的面积(APINF)；-在所述至少一个聚群内的所述点状或斑点形对象的密度(DC)。
文档编号G06T7/00GK101390129SQ200680053562
公开日2009年3月18日 申请日期2006年2月28日 优先权日2006年2月28日
发明者卡洛·鲁索, 尼古拉·迪奥瓜尔迪, 巴尔巴拉·弗兰切斯基尼, 法比奥·格里齐 申请人:仁爱米拉索莱有限公司