专利名称：用于校正检测器间频带增宽效应的方法
技术领域：
本发明涉及用于校正频带增宽效应的方法，尤其涉及用于校正检测器间频带增宽效应的方法。
背景技术：
用液相色谱技术对溶液中的大分子物质进行分析，通常是通过在适当的溶剂中制备样品，然后将它的小等份注射进入色谱仪来完成的。该色谱仪包括各种类型的分级器件， 它们在样品经过它们时将其分离。一旦通过这些通常是基于尺寸、质量或柱亲和力的方法将样品分离后，便用光散射、折光指数、紫外线(UV)、粘度响应等方法对其进行分析。例如， 为了确定通过尺寸排阻色谱柱进行分离的特定样品的质量和尺寸分布，色谱仪将先后用多角度光散射MALS和差动式折射计(differential refractometer) dRI测量样品。dRI确定浓度，而MALS仪器测定超瑞利比(excess Rayleigh ratio)，将它作为每个洗脱级分的角度函数。对于比入射光波长小得多的分子，通常在一个单一的角度上进行光散射测量就足够了。当各个级分经过检测器时，便产生了通常称之为“频带(band)”或者“波峰 (peak)，，的信号。由于扩散和混合效应，样品每次穿过不同的器件时，这些频带便会增宽一些。考虑由单分散性蛋白的低浓度等分样品。在这种情况下，瑞利逾量比与摩尔质量和浓度成正比。光散射信号和浓度信号应该具有相同的形状，并且当这两种响应被归一化而具有相等面积时，它们将完全重叠。然而，当样品从MALS检测器经过而进入dRI检测器时，它要经过中间区域和连接部位，这会导致样品的扩散和混合。由John Wiley & Sons于1979年出版的Yau等人所著的《Modern size exclusion liquid chromatography》一书中详细
讨论了频带增宽的许多因素和一些与其有关的补救措施。在上述例子中，dRI信号与MALS 信号相比，总是显得略宽。图1清楚地显示了增宽效应，该图表示了水缓冲液中的牛血清蛋白BSA样品的色谱图以及未校准增宽效应的计算出的摩尔质量。迹线1示出没有校准的摩尔质量。该摩尔质量是用除以单体的摩尔质量Mwtl后的结果表示，因此对于单体，纵轴上的读数为1，二聚体的读数为2，等等。迹线2反映作为时间函数的90°光散射信号。迹线3反映dRI信号。聚集状态已经被分级，于是，最右边从16分钟到18分钟的波峰区域是来自纯单体的数据，从 14分钟到16分钟的波峰区域来自二聚体，等等。在每个波峰中，增宽导致波峰中心处的浓度降低，而在“两翼”处的浓度增高。将此变宽的dRI信号和MALS信号结合起来确定各个洗脱时间处的摩尔质量，导致了在波峰中心附近确定的摩尔质量被系统地高估，而两翼处的却被低估。当浓度检测器在MALS检测器上游时，情况就反过来。假如没有频带增宽，数据将由一系列平台组成，对于单体来说是1，对于二聚体来说是2，等等。当被分级的样品变成更加多分散性时，频带增宽效应变得不那么明显(但是仍然存在)。对于被恰当地分级的具有离散的聚集状态的样品，该问题是明显的。在图1中，单体的波峰被很好地分辨出来， 所以增宽问题是最清楚的。聚集体逐渐变得不能很好地分辨出来，所以它们显现出该问题的程度就轻些。人们采用了各种方法来补偿这些变形。大多数方法都是基于L. H. Tung在其1969 年的论文中介绍的成果，该论文发表在《the Journal of Applied Polymer Science》，第 13卷，第775等页。在前面提到的Yau等人的著作讨论了一些校正频带增宽的方法。在整个色谱技术文献中，许多论文都提出了实施这些校正的方法，即，将变宽的频带恢复到假如没有增宽因素时它所具有的形状。这些技术中的大多数在数值上是不稳定的，可能导致实质上不合理的结果，例如负的浓度，或者负的散射强度，因此很少被使用。通过MALS测量得到的蛋白质特征表现为一个相当重要的面积，然而即便在这里，由于存在与实施相关的困难，因此很少见到对频带增宽进行校正。频带增宽效应出现在液相色谱的各种多检测器操作中。例如，如果要使用在线粘度计测量样品以获得它的特性粘度，那么也需要使用dRI。当样品从dRI移动到粘度计时， 便会出现频带增宽，这导致比粘度曲线相对于由dRI测量获得的浓度曲线出现扩展。另外， 在将变宽的信号恢复为符合在没有增宽的情况下它所具有的信号时，所存在的计算上的困难常常导致有问题的结果，特别是当样品确实是单分散性的，例如非聚集的蛋白质时。
发明内容
本发明的目的是提供一种分析方法，通过该方法可以用软件既容易又精确地校正频带增宽效应。本发明的另一个目标是为这些校正提供一种新的方法，该方法与传统方法的不同之处使其明显区别于传统方法。认为本发明用于分析蛋白质样品的分离最为有效。 该应用的一个结果将是更精确地表征蛋白质缀合物及其聚集态。本发明的进一步应用在于它能够改进特性粘度测量值的确定方法，这是通过校正样品在经过浓度检测器和粘度计之间时发生的频带增宽效应来实现的。本发明的一个重要应用是它可以用于快速测定不分级样品的第二维里系数，例如在美国专利第6，411，383号中以及Trainoff和Wyatt于2002 年7月M日提交的、现在正处于公布阶段的美国专利申请第10/205，637号中所讨论的样品。该方法的成功实施关键取决于能够准确地确定每个洗脱体积处浓度的平方。这要求对每个洗脱体积处的浓度进行准确测量。后面的测定一般是在不分级样品上进行的，该不分级样品的检测器响应是一个单峰，它的质量组成在所选择的每个时间间隔都是相同的。当它从一连串检测器经过时，这个单峰变宽，如果不对增宽效应进行校正，则在获得的结果中出现了系统误差。本发明包括一种对在液相色谱仪的检测器之间出现的频带增宽效应进行校正的方法。该方法扩宽第一检测器的频带使其与第二检测器处变宽了的频带相一致，而不是将在第二检测器处的频带恢复为第一检测器处的形式来校正第二检测器处所产生的频带增宽。由此获得一种更简单、更适用和更易实施的方法来校正所有检测器处的频带增宽效应。 尽管这种方法在波峰部分重叠时会导致波峰的分离度下降，但是大多数应用领域都是针对具有被很好地被分离和分辨的波峰的单分散性样品。本发明还可应用于任何数目的串连的检测器。
还应说明，本发明所披露的方法特别与本发明的受让人和发明人的多个专利和专利申请相关，这些专利和专利申请包括 Steven P. Trainoff 禾 Π Phi 1 ip J. Wyatt 于 2003 年 11 月 18 日发布的美国专利申请第 6，651，009 号“Method for determining average solution properties of macromolecules by the injection method，，。Philip J.Wyatt于2002年6月25日获得授权的美国专利第6，411，383，25号 "Method for measuring the 2nd virial coefficient，，。Steven P. iTrainoff于2001年1月30日获得授权的美国专利第6，180，906号 "Electrode design for electrical field flow fractionation，，。Steven P. Trainoff等人于2000年10月3日获得授权的美国专利第6，128，080 号"Extended range interferometric refractometer，，。Gary R Janik等人于1999年5月4日获得授权的美国专利第5，900，152号 "Apparatus to reduce inhomogeneities in optical flow cells，，。Gary R Janik等人于1997年10月14日获得授权的美国专利第5，676，830 "Method and apparatus for reducing band broadening in chromato graphic
detectors，，。Philip J. Wyatt等人于1996年6月25日获得授权的美国专利第5，530，540号 "Light scattering measurement cell very small volumns，，。David W. Siortt于1996年6月18日获得授权的美国专利第5，528，366号 "Precision determination for molecularweights，，。Philip J.Wyatt于1994年4月19日获得授权的美国专利第5，305，071号 "Differential refractometer，，。
图1显示了 BSA样品摩尔质量的未经校正的曲线，dRI检测器在MALS检测器下游。图2显示了对注射量为5 μ 1，溶于甲苯的200kD聚苯乙烯的90°光散射迹线进行拟合的混杂增宽模型。图3显示了用本发明的方法校正的图1的数据。图4显示了 BSA样品的特性粘度对洗脱体积的未经校正的曲线，dRI检测器在粘度计下游。图5显示了用本发明的方法校正的图4的数据。迹线11是校正后的特性粘度。图6显示了 BSA样品摩尔质量的未经校正的曲线，其中紫外检测器在MALS下游。图7显示了用本发明的方法校正的图6的数据。
具体实施例方式溶液中的分子通常是用它们的重均摩尔质量Mw、它们的均方半径<rg2>和第二维里系数A2来表征。后者是分子与溶剂之间的相互作用的量度。对于不分级的溶液，这些性质可以通过测量它们的光散射行为来确定，其中可以使用Bruno Zimm于1948年发表在《the Journal of Chemical Physics》，第16卷，第1093至1099页的开创性论文中描述的方法。最近，在由Trainoff和Wyatt的美国专利申请第6，651，009号中讨论的方法代表着一种将取代更传统的Zimm方法的先进技术。在某个角度和浓度范围内测量来自小体积溶液的散射光。由光散射测量得到的性质的关系符合Zimm的下列公式R( θ ) = K^MwcP( θ ) [1-2A2MwcP( θ )]+0(c3) (1)其中，R(9)是在(θ)方向上测到的每单位立体角的超瑞利比，定义为R( θ) =[Is( θ)-Isolv ( θ )]r2/I。V ;IS( θ )是每单位立体角的由溶液散射的光强度；Isolv ( θ ) 是每单位立体角的由溶剂散射的光强度山是入射光强度；r是该散射体积到检测器的距离；V是由检测器看到的被照射的体积；Ρ(θ)是发生散射的分子的形状因子，定义为
P(^) = lim^)// (0) 二 An2{dnIdcfnl /(iV^)，其中 Na 是阿伏加德罗常数，dn/dc 是折
光指数增量，no是溶剂折光指数，c是浓度，λ ^是入射光在真空中的波长。设定入射的准直光束相对于含有光散射检测器的平面为垂直偏振。形状因子与均方半径<rg2>的关系满足 Ρ{θ) = 1 - 1^A < ^ >/2) + o(sin4{θ)! )(2)
3义0多角度光散射仪测量来自流体样品的散射光的量，它是角度和时间的函数。对于小到可以与入射光的波长相比较的分子来说，光散射测量可以限制在一个单一的散射角， 例如90°，原因在于测量不到散射光强度随角度的变化，但是，在这种限度内，可以测量摩尔质量却不能测量均方半径。当该仪器被用来分析一个分离系统例如尺寸排阻色谱仪SEC的洗脱物时，样品的组成和浓度随时间变化。进一步地，SEC柱通常稀释该样品的浓度，以致于等式(1)的右边的第二和第三项与第一项相比可以忽略。这种情况在形式上表示为2A2cMw << 1(3)对于与光散射仪器联合使用的色谱分离来说，通常设定上述条件，除非从先前的实验已经知道A2，在这种情况下该数值可以在式1中直接使用。另外，如果恰当地实施了分离，在每一个时间点该样品的大小基本上是单分散性的，其质量通常也是单分散性的。如果该样品在质量上也是单分散性的，我们可以进一步简化得到R( θ，t) = K尹Mc(t)P( θ，t)(4)所以，光散射信号应该与浓度信号成正比，摩尔质量可以通过下述比例式计算M = j^hmR(0,t) (5)对于一个MALS系统的正确操作而言，一种普通的实验是注射近单分散性的样品使其通过分离柱，然后测量光散射和浓度信号，得到单分散性的波峰。假如进行归一化，则它们就应该在所有的洗脱时间都精确地重叠，与等式(5)表达的常数对应。然而，如果浓度检测器在MALS检测器的下游，两种效应将会改变波峰的形状混合和扩散。在这种情况下， 波峰会变宽；波峰的中心变低，而“两翼”增高。所以，当计算式( 中的比值时，不会得到常数，从波峰附近得到的摩尔质量将被系统地高估，而在两翼附近得到的摩尔质量将被低估。 当浓度检测器在MALS检测器上游时，情况相反。应该指出，未经分级而注射进入色谱仪的样品，常常被描述为流式注射，在它们从一个检测器到达另一个检测器的过程中，也发生带的增宽。尽管期望每个连续的洗脱体积的摩尔质量分布都保持固定，但是频带增宽效应会影响从在所选择的检测器处发生增宽的下游获得的各种重均性质。所以，当被注射的样品经过，例如，光散射检测器和dRI浓度检测器之间时，具有多分散性摩尔质量分布的样品波峰将会变宽。当未分级的光散射信号与变宽的浓度检测器信号结合时，在波峰的中心附近获得的重均摩尔质量的计算结果将偏大，而在两翼获得的对应数值将偏小。这个结果和在分级样品中看到的结果是完全一样的。样品的混合主要取决于系统的几何性质管的长度和直径、连接器的数目、表面的粗糙程度和机械缺陷导致的夹杂物的数目，以及测量池的几何性质。混合效应在一定限度内基本上与样品的组成无关，在该限度内，体流体性质例如粘度不随样品而发生明显的变化。相反，扩散明显地取决于样品的性质。估计样品在两个检测器之间流动时扩散和混合的相对重要性是具有指导意义的。 对于均一的球体，Stokes-Einstein关系式
权利要求
1.一种获得顺次通过一组两个或多个检测器i (i = Ln)的样品的选择的物理性质的方法，其中η是检测器的数目，当一些所述检测器显示出其信号的频带增宽时，该方法使用响应于从中通过的所述样品由所述检测器产生的作为时间的函数的信号的组合Di (t)，该方法包括步骤a)应用参数化增宽函数Β(α0，α1， ... , α1, τ)到检测器组以因此获得相应组的检测器信号，其中α特性化检测器i的增宽的范围，而1是可调参数的数目，
2.根据权利要求1所述的方法，其中，要获得的所述选择的物理性质是所述样品的重均摩尔质量Mw，和所述样品的均方半径<rg2>。
3.根据权利要求1所述的方法，其中，所述检测器信号依次来自紫外检测器和多角度光散射检测器，并且多角度光散射的信号被增宽。
4.根据权利要求1所述的方法，其中，所述检测器信号依次来自折射率检测器和粘度计，并且所述折射率检测器的信号被增宽。
5.根据权利要求1所述的方法，其中，可调参数α0代表仪器的高斯宽度δ，并且可调参数α1代表由于混合而导致的增宽W，并且所述增宽函数由下式给出
6.根据权利要求5所述的方法，其中所述检测器i(i= 1，n)的增宽函数的最佳拟合参数由下述步骤确定a)选择包含一组可调参数aj(j= 0，...，1)的所述增宽函数Β(α0，α1 . . .，α1, τ )，其中1是可调参数的数目；b)注入均勻成分的参考样品；c)从所述i个检测器Di(t)的每个检测器收集作为对应于来自每个所述检测器的所述样品的波峰的时间函数的检测器信号，其中波峰被定义为一段时间范围，在该时间范围内， 具有均勻成分的样品被洗脱；d)定义参考信号Dn(t)为显示最宽临时响应的信号；e)对于每个检测器i，形成Xi2模型，该模型得自所述增宽模型，并且使用所述信号Dn(t)作为所述检测器i要被比较的参考，在所述波峰将被最小化;
7.根据权利要求2所述的方法，其中，所述检测器信号依次来自多角度光散射检测器和折射率检测器，并且所述多角度光散射检测器的信号被增宽。
8.根据权利要求7所述的方法，其中，所述样品的所述重量平均摩尔质量和所述均方半径得自Zi_公式R ( θ ) = K*MwcP ( θ ) [1-2A2MwcP (θ )+0 (c3)，其中P ( θ )是从所述多角度光散射检测器获得的在时间t方向θ的超瑞利比，c是从所述折射率检测器获得的在时间 t的浓度，ρ(θ )是所述样品中的散射分子的形状因子，A2是第二维里系数，而K*是一个常数，并且其中所述多角度光散射信号已经被增宽。
全文摘要
色谱分离经常由多个检测器表征，样品连续流经所述检测器。当所述样品在几个检测器间流动时，它由于混合和扩散而逐步稀释。这种现象被传统地称为检测器间的“频带增宽”，经常导致例如摩尔质量的计算所得物理物理性质的显著畸变。本公开描述一种表征目前在色谱系统中所述增宽的方法以及一种算法，凭借该算法，上行检测器的窄波峰从数值上增宽，以使它们可与下行检测器的增宽波峰相比较。虽然所述技术导致分辨率的一些损失，但其稳定性和通用性允许其广泛应用。示例包含随MALS检测器的RI检测器增宽的较正、随UV检测的MALS增宽的较正、随MALS和RI检测的粘度增宽的较正以及其中的所有渗透。
文档编号G06F19/00GK102183607SQ201110008100
公开日2011年9月14日 申请日期2004年8月6日 优先权日2003年9月18日
发明者S·P·特拉伊诺夫 申请人:怀雅特技术公司