专利名称：用软件建立体内屏障晶体结构模型及其制备方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明属于制药工程及生物技术领域，具体涉及用软件建立体内屏障晶体结构模型及其应用。
背景技术：
脑是中枢神经系统的主要部分，它控制和协调行动、体内稳态(例如心跳、血压、体温等)以及精神活动(例如认知、情感、记忆和学习)。当脑发生疾病时(如脑中风、脑肿瘤等)，会给身体造成严重的后果，故对脑疾病的治疗是医学领域的前沿攻关难题。血液与脑组织之间在存在着血脑屏障(blood-brain barrieer, BBB),能有效地限制有害物质进入脑组织，从而保护脑组织。它是由脑毛细血管内皮细胞、基膜和神经胶质膜构成。脑毛细血管内皮细胞之间以紧密连接封闭，内皮外有基板、周细胞及星形胶质细胞突起的脚板围绕。内皮细胞是构成血脑屏障的主要结构，营养物质和代谢产物可顺利通过，以维持神经系统内环境的相对稳定。星形胶质细胞有诱导内皮细胞形成屏障特性的作用。脑具有以下特殊的组织结构
①脑毛细血管缺少一般毛细血管所具有的孔，或者这些孔既少且小。内皮细胞彼此重叠覆盖，
而且连接紧密，能有效地阻止大分子物质从内皮细胞连接处通过。②内皮细胞还被一层连续不断的基底膜包围着。③基底膜之外还有许多星形胶质细胞的血管周足(终足)把脑毛细血管约85%的表面包围起来，构成了脑组织的防护性屏障。在病理情况下，如血管性脑水肿时，内皮细胞间的紧密粘合处开放，由于内皮细胞肿胀重叠部分消失，很多大分子物质可随血浆滤液渗出毛细血管，这会破坏脑组织内环境的稳定，造成严重后果。故血脑屏障是药物进入脑组织所需要通过的屏障。治疗脑疾病的药物需要透过血脑屏障，进入到病灶，达到一定的血药浓度才可以发挥疗效。另外，皮肤屏障、胃肠道、鼻、口腔粘膜屏障、神经突触前后膜、细胞膜(还包括线粒体膜、叶绿体膜、内质网膜、核膜等)等和血脑屏障有着相似的结构，都是上皮细胞紧密的贴在一起生长成致密层而形成不同的屏障。上皮细胞的屏障结构基础是脂质体双分子层，在此基础上表达不同的、特异性的蛋白质来执行功能。故各种身体屏障如血脑屏障、皮肤屏障、胃肠道、鼻、口腔粘膜屏障、神经突触前后膜、细胞膜(还包括线粒体膜、叶绿体膜、内质网膜、核膜等)等最终是通过表达有不同蛋白质的脂质体双分子类晶体结构来体现并且直接执行屏障功能的，故可以用计算机软件模拟以上结构特征，进行药物的筛选和研究。另外，单纯的脂质双分子层可以模拟纳米脂质体，研究包囊其中的药物扩散释放行为。
发明内容
本发明需要解决的问题是提供一种计算机软件模拟血脑屏障、皮肤屏障、胃肠道、鼻、口腔粘膜屏障、神经突触前后膜、细胞膜(还包括线粒体膜、叶绿体膜、内质网膜、核膜等)等晶体结构模型，并且可以用于计算和分析。解决了目前血脑屏障、皮肤屏障、胃肠道、鼻、口腔粘膜屏障、神经突触前后膜、细胞膜(还包括线粒体膜、叶绿体膜、内质网膜、核膜等)模型复杂繁琐，而且不容易重复等许多问题。本发明所述用软件建立体内屏障晶体结构模型是用计算机软件NAMD或DS或MS或GR0MACS或AMBER或VMD或CHARMM等建立血脑屏障、皮肤屏障、胃肠道、鼻、口腔粘膜屏障、神经突触前后膜、细胞膜(包括线粒体膜、叶绿体膜、内质网膜、核膜等)等晶胞结构模型。(I).本发明所述用软件建立体内屏障晶体结构模型的制备方法
将大豆磷脂或卵磷脂或二棕榈酰磷脂酸(DPPA)或二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPP)或二棕榈酰磷脂酰乙醇胺(DPPE)或二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)或二棕榈酰磷脂酰甘油(DPPG)或二棕榈酰磷脂酰丝氨酸(DPPS)或双肉豆蘧磷脂酸(DMPA)或双肉豆蘧磷脂酰丝氨酸(DMPS)或双肉豆蘧磷脂酰乙醇胺(DMPE)或双肉豆蘧磷脂酰胆碱(DMPC)或双肉豆蘧磷脂酰甘油(DMPG)或二月桂酰磷脂酰甘油(DLPG)或二月桂酰磷脂酰胆碱(DLPC)或二油酰磷脂酰甘油(DOPG)或二油酰磷脂酰胆碱(DOPC)或二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)或二硬脂酰磷脂酰甘油(DSPG)或胆固醇等，单独或按不同比例混合建立血脑屏障的双层脂质体晶胞结构中。将表达在血脑屏障上的ZO-1或Z0-2或Z0-3或occluding或claudin或junctionadhesion molecular (JAM)或P_gp等蛋白加入到上述双层脂质体晶胞结构中，构成血脑屏障模型。将表达在皮肤屏障上的hCTLA4_Ig或K3 / K12等蛋白加入到上述双层脂质体晶胞结构中，构成皮肤屏障模型。将胃肠道、鼻、口腔等粘膜表面表达的粘蛋白MUCI或MUC2或MUC3或MUC4或MUC5AC或MUC6或Cytokeratins等蛋白加入到上述双层脂质体晶胞结构中，构成胃肠道粘膜、鼻粘膜、口腔粘膜等屏障模型。将表达在神经突触前膜或后膜屏障上的突触素synaptophysin或synapsin或synaptobrevin或synaptotagmin或synaptoporin或SERT等蛋白加入到上述双层脂质体晶胞结构中，构成神经突触前膜或后膜模型。根据细胞和细胞亚结构的种类和特征将细胞膜(还包括线粒体膜、叶绿体膜、内质网膜、核膜等)表面特异性表达的蛋白加入到上述双层脂质体晶胞结构中，构成各种特异性细胞膜结构模型。将要筛选的药物加入到以上模型中可用来筛选出透血脑屏障、皮肤屏障、胃肠道、鼻、口腔粘膜屏障、神经突触前后膜、细胞膜(还包括线粒体膜、叶绿体膜、内质网膜、核膜等)等的有效成分，通过扩散系数，判定药物透过以上结构屏障的能力大小。另外，不加任何蛋白质的双层脂质体晶胞结构，模拟纳米脂质体或类脂质体结构，模拟药物从脂质体或类脂质体结构中扩散和释放过程。( 2 )本发明与现有技术相比，其有益效果是
目前，国内外建立各种血脑屏障用于新药开发和科研试验。
①活体脑组织中药物的检测
用透析装置取脑组织液测定药物浓度，计算透血脑屏障百分率。②离体脑组织中药物的检测
分离脑组织，制备匀浆，测定脑组织中药物的浓度，计算药物透血脑屏障的百分率。③细胞培养
用脑血管内皮细胞和神经细胞共同培养，形成致密层，模拟血脑屏障，用Transwell装置进行试验。这种方法目前广为用于科研，但离体细胞模型和体内的环境存在着比较大的差异。以上三种方法是常用的研究药物透血脑屏障的体内外模型，各有利弊。皮肤屏障一般采用活体动物(大鼠、小鼠等)皮肤或离体动物皮肤，需要脱毛处理后用药。体内取血浆，测定血药浓度；体外将离体皮肤夹在扩散池样品池和扩散池中间，测定扩散到下层扩散池中的药物浓度等步骤。胃肠道、鼻、口腔粘膜屏障一般也采用活体或者分离局部粘膜用于试验。神经突触前后膜、细胞膜(还包括线粒体膜、叶绿体膜、内质网膜、核膜等)可以直接进行细胞培养，荧光标记后，研究药物的透过率。但体内研究都存在试验繁琐，成本高，不容易重复等，不利于快速筛选的缺点。而本发明所述计算机软件建立的血脑屏障、皮肤屏障、胃肠道、鼻、口腔粘膜屏障、神经突触前后膜、细胞膜(还包括线粒体膜、叶绿体膜、内质网膜、核膜等)等可以更好更快捷的筛选出有效的药物，推动脑疾病、皮肤疾病、胃肠道、神经系统等疾病治疗药物研究的深入发展。药物从脂质体中扩散，释放行为是药剂领域中非常重要的检测指标，用计算机软件建模后分析计算，可以了解药物从脂质体中释放的快慢。比用常规的透析袋或透析盒测定释放行为要方便快捷得多。计算机软件NAMD或DS或MS或GR0MACS或AMBER或VMD或CHARMM等建立血脑屏障、皮肤屏障、胃肠道、鼻、口腔粘膜屏障、神经突触前后膜、细胞膜(还包括线粒体膜、叶绿体膜、内质网膜、核膜等)等的晶体结构模型。再用NAMD或DS或MS或GR0MACS或AMBER或VMD或CHARMM等软件进行分子动力学模拟，通过分析均方位移等指标，计算出扩散系数等参数，可以检测待筛选或比较药物对血脑屏障、皮肤屏障、胃肠道、鼻、口腔粘膜屏障、神经突触前后膜、细胞膜(还包括线粒体膜、叶绿体膜、内质网膜、核膜等)等的透过作用能力的大小。这个计算机软件建立的屏障模型平台，能快速、有效地筛选出透血脑屏障、皮肤屏障、胃肠道、鼻、口腔粘膜屏障、神经突触前后膜、细胞膜(还包括线粒体膜、叶绿体膜、内质网膜、核膜等)等的有效药物，故在新药筛选方面具有重要的应用价值。同时，可以模拟纳米脂质体或类脂质体中药物的扩散、释放行为，故在药物制剂领域也有广阔的应用前景。
图1用DMPC建立的脂质双分子层晶胞结构(3D图的平面快照图)
图2在DMPC建立的脂质双分子层晶胞结构中加入表达在血脑屏障上的ZO-1蛋白(用solid ribbon显示),形成血脑屏障模型(3D图的平面快照图)
图3药物川芎嗪(用CPK表示)透血脑屏障模型过程(3D图的平面快照图)
图4药物川芎嗪(用CPK表示)在血脑屏障立体晶体模型中
具体实施例方式下面以血脑屏障模型为代表，用药物川芎嗪进行应用实施。其它的皮肤屏障、胃肠道、鼻、口腔粘膜屏障、神经突触前后膜、细胞膜(还包括线粒体膜、叶绿体膜、内质网膜、核膜等)、脂质体等模型及药物的作用模式是类似的。实施例1DMPC建立的脂质双分子层晶胞结构
DMPC按照极性自组装，形成极性基团分布在脂质体双分子的外层，非极性的两条长长的碳链(灰白色表示)对称分布在内层。这和生物体中的脂质双分子层类晶体结构是相似的。(图1)。实施例2在DMPC建立的脂质双分子层晶胞结构中加入各自特异性蛋白，形成屏障模型
现在DMPC建立的脂质双分子层晶胞结构中加入表达在血脑屏障上的ZO-1蛋白，形成血脑屏障模型(图2)。实施例3药物川芎嗪作用于血脑屏障模型
将药物川芎嗪加入到已建立好的血脑屏障模型中(图3)，用计算机软件MS进行分子动力学模拟、分析、计算。实施例4药物川芎嗪放入血脑屏障立体模型中
选用DMPC建立脂质双分子层晶体结构，将一定比例数量的DMPC分子(10 40个)放入到设定大小的立体晶体模拟盒中，再加入I个ZO-1蛋白和I 6个川芎嗪(图4)，最后进行能量最小化。实施例5分子动力学模拟
先运行分子动力学模拟程序NVT，平衡准备扩散的晶胞，温度298K，时间步长O. 5 Ifs,总模拟步长I 20万，达到温度平衡和能量平衡。然后再运行另外一个分子动力学程序NVE，温度298K，时间步长O. 5 lfs，总模拟步长I 20万，重复3 4次。用于轨迹分析,分析均方位移(mean square diaplacement,MSD ) ο实施例6分析均方位移
运行Forcite下的Analysis进行分析，输出数据到电子文档，画出Log(MSD)与Log(Time)曲线,得到一条直线。线性拟合为Y = aX+b,记下a值。实施例7计算扩散系数 扩散系数公式
d涉多而〉
式中的微分近似用MSD对时间微分的比例来代替，也就是曲线的斜率a。N为系统中扩散原子的数目，MSD的值已对扩散原子数N做了平均。故公式可以简化为D = a/6
计算的结果在1. OX 10—5 4. OX IO-5Cm2S-1O
权利要求
1.一种用软件建立体内屏障晶体结构模型，其特征是用计算机软件NAMD或DS或MS或GROMACS或AMBER或VMD或CHARMM建立血脑屏障或皮肤屏障或胃肠道或鼻、口腔粘膜屏障或神经突触前后膜或线粒体或叶绿体膜或内质网膜或核膜晶胞结构模型。
2.根据权利要求1所述用软件建立体内屏障晶体结构模型的制备方法，其特征是由以下步骤构成 (1)·取大豆磷脂或卵磷脂或二棕榈酰磷脂酸DPPA或二棕榈酰磷脂酰胆碱DPPP或二棕榈酰磷脂酰乙醇胺DPPE或二棕榈酰磷脂酰胆碱DPPC或二棕榈酰磷脂酰甘油DPPG或二棕榈酰磷脂酰丝氨酸DPPS或双肉豆蘧磷脂酸DMPA或双肉豆蘧磷脂酰丝氨酸DMPS或双肉豆蘧磷脂酰乙醇胺DMPE或双肉豆蘧磷脂酰胆碱DMPC或双肉豆蘧磷脂酰甘油DMPG或二月桂酰磷脂酰甘油DLPG或二月桂酰磷脂酰胆碱DLPC或二油酰磷脂酰甘油DOPG或二油酰磷脂酰胆碱DOPC或二硬脂酰磷脂酰胆碱DSPC或二硬脂酰磷脂酰甘油DSPG或胆固醇，单独或按不同比例混合建立双层脂质体晶胞结构模型； (2).将(I)建立的脂质双分子层晶胞结构中，插入血脑屏障或皮肤屏障或胃肠道、鼻、口腔粘膜屏障或神经突触前后膜或线粒体膜或叶绿体膜或内质网膜或核膜上表达的特异性相关蛋白即脂蛋白或糖蛋白后，模拟血脑屏障或皮肤屏障或胃肠道、鼻、口腔粘膜屏障或神经突触前后膜或线粒体膜或叶绿体膜或内质网膜和核膜屏障模型； (3).将(2)建立的屏障模型结构中加入不同的药物即中药有效成分或中药复方或化合物或蛋白质或多肽、或小肽或基因或microRNA后，用计算机软件NAMD或DS或MS或GROMACS或AMBER或VMD或CHARMM进行分子动力学模拟，通过分析均方位移Mean SquareDisplacement, MSD计算出扩散系数，检测它们血脑屏障或皮肤屏障或胃肠道、鼻、口腔粘膜屏障或神经突触前后膜或线粒体膜或叶绿体膜或内质网膜或核膜透过作用能力的大小； (4).加入川芎嗪实施对应用血脑屏障透过作用。
3.权利要求1所述用软件建立体内屏障晶体结构模型在药物筛选中的应用，该模型平台，能快速有效地筛选出透血脑屏障或皮肤屏障或胃肠道、鼻、口腔粘膜屏障或神经突触前后膜或线粒体膜或叶绿体膜或内质网膜或核膜的有效药物，用于进一步的药理实验。
全文摘要
本发明属于制药工程及生物技术领域，具体涉及用软件建立体内屏障晶体结构模型及其制备方法和应用。用计算机软件NAMD或DS或MS或GROMACS或AMBER或VMD或CHARMM等分子动力学模拟，通过分析均方位移等,计算出扩散系数等，可以检测待筛选或研究的药物对血脑屏障、皮肤屏障、胃肠道、鼻、口腔粘膜屏障、神经突触前后膜、细胞膜透过作用能力的大小。这个体外计算机建立的模型平台，能快速、有效地筛选出透血脑屏障、皮肤屏障、胃肠道、鼻、口腔粘膜屏障、神经突触前后膜、细胞膜的有效药物，故在新药筛选方面具有重要的应用价值。同时，可以模拟纳米脂质体或类脂质体中药物的扩散、释放行为，故在药物制剂领域也有广阔的应用前景。
文档编号G06F19/00GK103020483SQ201310005750
公开日2013年4月3日 申请日期2013年1月8日 优先权日2013年1月8日
发明者夏红梅, 徐银祥, 程志清, 刘亚琴 申请人:安徽中医学院