一种基于肝癌免疫组化图像的血管角度自动测量方法与流程

本发明属于病理学技术领域，具体涉及一种基于肝癌免疫组化图像(ihc)的血管角度自动测量方法。

背景技术：

现代医学认为肝癌的发生是一个多因素、多步骤的生物学过程，肝癌细胞的增殖、侵袭需要依赖血管。而血管的生成与肝癌的生长、浸润和复发均有明显的相关性。临床上，当癌肿增大明显时，受侵袭的血管段不规则、压迹、移位，直接影响肝脏毛细血管走向，从而提出了根据血管角度的大小来判别肝癌分化程度的方法。现阶段免疫组化技术的应用提高了临床病理诊断的准确性，已经成为判断肿瘤良恶性及生长程度的重要评价标准。然而目前免疫组化自动分析方法不足以解决血管的全部形态问题，只能获得血管长度、面积，长宽比等常规统计学信息。目前尚无研究人员提出血管角度的自动测量方法，仅靠人工测量角度工作量大、易受个人主观因素的影响。

免疫组化是生物成像的核心技术，生物医学图像处理技术的提高促进了免疫组化图像自动分析工具的发展，这对辅助病理学家进行与疾病相关的生物学活性检测具有重要的意义。面对ihc存在的染色剂分布不均、成像有噪声等复杂情况，如何精确地提取血管结构以用于辅助诊断等有着关键性作用，它的处理结果将影响后续定量检测的精度。

由于ihc图像使用多种染色剂进行着色，直接采用传统的方法不能达到对象准确分割的目的。比如：有学者采用r、g、b分量上的色差来作为分割依据，但由于r、g、b这三个颜色空间存在很强的相关性，直接在rgb颜色模型下很难实现免疫组化阳性区、阴性区和背景区的颜色分离。一些学者将rgb颜色模型转换为hsi模型或者cmyk模型进行多着色的图像分割，但是这种方法依赖于阈值的设置，容易导致大量信息的丢失，影响检测的精确度。

技术实现要素：

发明目的：针对现有技术中存在的不足，本发明的目的是提供一种基于肝癌免疫组化图像的血管角度自动测量方法，对免疫组化图像血管角度测量准确率高，对判断恶性实体肿瘤的生长、转移有很重要的意义。

技术方案：为了实现上上述发明目的，本发明采用的技术方案为：

一种基于肝癌免疫组化图像的血管角度自动测量方法，包括如下步骤：

1)采集肝癌免疫组化的血管图像；

2)对图像进行染色分离、阈值分割、平滑、填充处理，使血管清晰、完整；

3)对目标血管进行特征点提取并将所提取的特征点分为两个等量的集合；

4)根据所分的两个集合，拟合两根直线，并对这两根直线进行判断、调整，最后计算出血管角度。

步骤2)中，染色分离利用的是颜色去卷积算法(具体参考论文“fastboundaryartifactreductionalgorithmforimagedeconvolution”)，颜色去卷积算法为了获取每种着色的独立信息，需对rgb信息进行正交变换，而且为了获得每种着色正确的吸收因子，需对变换进行标准化。通过临床上最常用的两种染色剂dab与h&e的实验证明，颜色去卷积的方法可以成功地分割出不同的染色区域；

步骤2)中，阈值分割法利用的是改进的otsu算法，本发明在分析传统的otsu算法原理的基础上，用后验概率信息代替传统的otsu算法均值信息对于免疫组化图像来说具有更好的自适应性,能够有效地减少图像的灰度线性变化和平移变化对传统的otsu算法的影响，在复杂背景下仍能获得最佳的分割阈值。本发明改进的otsu算法步骤具体包括

所获得的染色分离图像为灰度图像，其灰度直方图产生的灰度信息概率为

u(a)(0＜a＜l-1)，同时满足染色分离图像均值当阈值t选择到最佳值时，图像则会被分类成两个部分：血管和基质。血管和基质的后验概率分别为pb(t)和pj(t)。血管和基质的灰度均值可表示为zb(t)和zj(t)。则归一化的otsu阈值分割准则函数为：

血管和基质的后验概率pb(t)和pj(t)对应的rényi信息熵rn为

其中n为信息熵参数。

将获得的信息熵rn(p,t)作为otsu阈值准则函数的约束条件，则获得改进的otsu算法的正则化最佳阈值判别准则函数为：

步骤2)中，平滑利用的是中值滤波方法，中值滤波是图像平滑的一种方法，它是一种非线性平滑滤波技术，通常采用一个含奇数个点的滑动窗口，用窗口中的灰度值的中值来代替中心点的灰度值；

步骤2)中，填充利用的是四连通域种子填充算法，该算法从多边形区域的一个内点开始，由内向外用给定的颜色画点直到边界为止，如果边界是以一种颜色指定的，则种子填充算法可逐个像素地处理直到遇到边界颜色为止；

步骤3)中，对目标血管进行特征点提取采用的是surf算法(具体参考论文“researchonmedicalimageregistrationalgorithmbasedonsurfimprovement”)，surf特征点提取，通过计算hessian矩阵行列式的局部极值点,来确定特征点的位置。surf算法利用盒子滤波器代替高斯二阶微分,并引入了积分图像,极大的提高了运算速度和精度。将盒子滤波器与图像进行卷积运算,其结果分别为dxx、dxy和dyy。于是,hessian矩阵的行列式可以简化为:det(h)＝dxydyy-(wdxy)²(式中w是权重系数)，按照式中近似hessian矩阵行列式的计算方法，对图像中每一点求取响应并记录下来当响应大于阈值时，则标记为特征点；

步骤3)中，将所提取的特征点分为两个等量的集合包括如下步骤：

(1)对获取的n个特征点进行编号包括如下步骤：

①根据特征点的坐标位置关系，采用线扫描的方式从上、下、左、右四个方向进行扫描，分别找出四个方向上经扫描后的第一个点，标记为tup、tdown、tleft、tright，分别计算出该点与最邻近的两个点的角度，记为∠tup1、∠tup2、∠tdown1、∠tdown2、∠tleft1、∠tleft2、∠tright1、∠tright2，再计算出同方向上两个角度之间的差值的绝对值：如∠tup1-2＝|∠tup1-∠tup2|，取其中角度差值最小的点为血管起始点，记为p1；

②根据欧几里得距离关系oρ＝sqrt((x1-x2)²+(y1-y2)²)，分别计算p1与其他n-1个特征点的距离，取到p1距离最小的点记为p2，再分别计算p2到其他n-2个特征点的距离，当最小时，记i为p3，以此类推，直到标记出所有的特征点。

(2)n为奇数时，取编号为(n+1)/2的特征点为标记点，n为偶数时，取编号为n/2与n/2+1之间的距离作为标记点，把血管中n个特征点分成等量的两个集合s1与s2，(其中n为奇数时，s1＝{p1，...,p(n-1)/2},s2＝{p(n+1)/2，...,pn},n为偶数时，s1＝{p1，p2，...,pn/2}，s2＝{pn/2+1，...，pn})；

步骤4)中，根据所分的两个集合，拟合两根直线包括如下步骤：

(1)根据两个集合中的特征点利用最小二乘法拟合两根直线l1、l2(具体参考论文“multipleadaptiveleastsquarecurvefittingalgorithmandapplications”)。

步骤4)中，对所拟合成的两根直线进行判断、调整包括如下步骤：

(1)由公式：(公式描述：公式中cov(x,y)为x,y的协方差，d(x)、d(y)分别为x、y的方差。)可知，当|ρxy|＝1时，称x,y完全相关，此时，x,y之间具有线性函数关系；|ρxy|＜1时，x的变动引起y的部分变动，ρxy的绝对值越大，x的变动引起y的变动就越大，|ρxy|＞rhigh时称为高度相关，当|ρxy|＜rlow时称为低度相关，其它时候为中度相关；

(2)当拟合的两条直线l1、l2相关系数均大于|ρxy|＞rhigh时，确定这两条直线为输出直线；

(3)当拟合的两条直线仅有一条直线相关系数大于|ρxy|＞rhigh时记为lx，标记点随机移动一个位置，使s1＝{p1,p2,...,pn/2,p(n/2)+1},s2＝{p(n/2)+2,...,pn},再进行直线拟合，若lx相关系数ρ变小，则反方向移动标记点，使s1＝{p1,p2,...,p(n/2)-1},s2＝{pn/2，p(n/2)+1，...,pn},使相关系数达到最大，但对于另一条拟合直线，相关系数也发生相应变化，理论上相关系数大于a即可；

步骤4)中，计算血管角度的公式：其中，k1、k2分别为两直线的斜率。

有益效果：现有血管角度计算需要人工处理，当面对大批量计算时，效率和准确率会产生很大波动，而本发明的自动测量肝癌免疫组化图像的血管角度的方法，通过图像处理技术，将免疫组化图像进行处理，分离血管组织和其他组织，从而使得免疫组化图像血管角度测量准确率高，对判断恶性实体肿瘤的生长、转移有很重要的意义。

附图说明

图1是未经处理的高分化肝癌血管图像图；

图2是未经处理的中分化肝癌血管图像图；

图3是未经处理的低分化肝癌血管图像图；

图4是进行染色分离后的高分化图像图；

图5是进行染色分离后的中分化图像图；

图6是进行染色分离后的低分化图像图；

图7是进行阈值分割后的高分化图像图；

图8是进行阈值分割后的中分化图像图；

图9是进行阈值分割后的低分化图像图；

图10是进行平滑、填充后的中分化图像图；

图11是进行平滑、填充后的低分化图像图；

图12是经过特征提取后的血管上的特征点图。

图13是选择特征点起始点方法示意图；

图14是进行初始特征点聚类后拟合直线示意图；

图15是特征点聚类优化后拟合直线示意图。

具体实施方式

下面结合附图和实施例，对本发明作进一步详细描述。以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

实施例1

一种基于肝癌免疫组化图像的血管角度自动测量方法，包括如下步骤：

步骤1：采集肝癌免疫组化的血管图像。如图1、2、3所示，分别为未经处理的高分化肝癌血管图、中分化肝癌血管图像和低分化肝癌血管图像图。

步骤2：图像的预处理

1)染色分离：染色分离利用的是颜色去卷积算法，颜色去卷积算法为了获取每种着色的独立信息，需对rgb信息进行正交变换，而且为了获得每种着色正确的吸收因子，需对变换进行标准化，颜色去卷积的方法可以成功地分割出这两种染料的染色区域。如图4、5和6所示，分别是是进行染色分离后的高分化图像、中分化图像、低分化图像。通过染色分离后，可以将血管组织和其他组织进行区分，有助于后续血管角度计算。

2)阈值分割：阈值分割法利用的是改进的otsu算法，本发明在分析传统的otsu算法原理的基础上，用后验概率信息代替传统的otsu算法均值信息对于免疫组化图像来说具有更好的自适应性，能够有效地减少图像的灰度线性变化和平移变化对传统的otsu算法的影响，在复杂背景下仍能获得最佳的分割阈值。本发明改进的otsu算法步骤具体包括：

所获得的染色分离图像为灰度图像，其灰度直方图产生的灰度信息概率为：u(a)(0＜a＜l-1)，同时满足染色分离图像均值当阈值t选择到最佳值时，图像则会被分类成两个部分：血管和基质。血管和基质的后验概率分别为pb(t)和pj(t)。血管和基质的灰度均值可表示为zb(t)和zj(t)。则归一化的otsu阈值分割准则函数为：

血管和基质的后验概率pb(t)和pj(t)对应的rényi信息熵rn为

其中n为信息熵参数。本实施例中n取0.5。

将获得的信息熵rn(p,t)作为otsu阈值准则函数的约束条件，则获得改进的otsu算法的正则化最佳阈值判别准则函数为：本实施例中根据不同染色剂量，t^*的最佳阈值范围为(87-101)。

如图7、8和9所示，分别是进行改进的otsu阈值分割后的高分化图像、中分化图像、低分化图像；这样即在染色分离后的图像基础上，得到了血管的边缘和位置信息。

3)平滑、填充：平滑利用的是中值滤波法，中值滤波是图像平滑的一种方法，它是一种非线性平滑滤波技术，通常采用一个含奇数个点的滑动窗口，用窗口中的灰度值的中值来代替中心点的灰度值。填充利用的是四连通域种子填充算法，该算法从多边形区域的一个内点开始，由内向外用给定的颜色画点直到边界为止，如果边界是以一种颜色指定的，则种子填充算法可逐个像素地处理直到遇到边界颜色为止。如图10和11所示，分别是进行平滑、填充后的中分化图像、低分化图像图；由于有些血管的边缘不够连续，或者血管内部有空腔，采用平滑、填充处理可以使得血管的边缘平滑，内部填充，有助于血管特征点的定位。

步骤3：血管特征拟合

1)对目标血管进行特征点提取：对目标血管进行特征点提取采用的是surf算法，surf特征点提取，通过计算hessian矩阵行列式的局部极值点，来确定特征点的位置。surf算法利用盒子滤波器代替高斯二阶微分，并引入了积分图像，极大的提高了运算速度和精度。将盒子滤波器与图像进行卷积运算，其结果分别为dxx、dxy和dyy。于是，hessian矩阵的行列式可以简化为：det(h)＝dxydyy-(wdxy)²(式中w是权重系数，实际应用中取0.9)，按照式中近似hessian矩阵行列式的计算方法，对图像中每一点求取响应并记录下来，当响应大于阈值0.8时，则标记出特征点，如图12所示。

2)利用特征点拟合两根直线

对获取的17个特征点进行编号：根据特征点的坐标位置关系，采用线扫描的方式从上、下、左、右四个方向进行扫描，分别找出四个方向上经扫描后的第一个点，标记为tup、tdown、tleft、tright。如图13所示，本实施例中，tup和tright为同一点。分别计算出该点与最邻近的两个点的角度，∠tup1＝45°、∠tup2＝80°、∠tdown1＝76°，∠tdown2＝46°、∠tleft1＝152°、∠tleft2＝228°，再计算出同方向上两个角度之间的差值的绝对值，∠tup1-2＝|∠tup1-∠tup2|＝35°、∠tdown1-2＝|∠tdown1-∠tdown2|＝30°、∠tleft1-2＝|∠tleft1-∠tleft2|＝76°，取其中角度差值最小的点为血管起始点，记为p1，由此可得，tdown即为p1点。

根据欧几里得距离关系：oρ＝sqrt((x1-x2)²+(y1-y2)²)，分别计算p1与其他16个特征点的距离，取到p1距离最小的点记为p2，再分别计算p2到其他15个特征点的距离，当最小时，记i为p3，以此类推，按顺序排列所有17个特征点。

3)将标记出的特征点分为两个集合：把血管中17个特征点以p9为标记点分成等量的两个集合s1与s2，(s1＝{p1，...,p8}，s2＝{p10，...,p17})。

步骤4：血管角度测量

1)根据集合s1、s2拟合两根直线：根据两个集合中的特征点利用最小二乘法拟合两根直线l1、l2，如图14所示。

2)对所拟合成的两条直线进行判断，调整：

由公式：可得，ρl1＝0.85，ρl2＝0.44，由于ρl1>0.8，而ρl2<0.8，所以要适当调整两个集合的特征点数。

令标记点p9随机移动一个位置到p11，使s1＝{p1，p2，...,p10}，s2＝{p12,p13...,p17}，重新拟合两根直线，如图15所示。

再由公式：可得，ρl1＝0.81，ρl2＝0.94，此时的ρl1>0.8,ρl2>0.8，可确定这两条直线为输出直线。

3)计算血管角度：由计算血管角度的公式：可得，图示血管角度为107.8°。