使用基于血液的样本的质谱的肺癌患者的治疗选择的制作方法
【专利说明】
[0001]相关申请的交叉引用 本申请根据35 U.S.C. § 119来要求2014年4月4日提交的美国临时申请序号61/ 975267的优先权，通过引用将其结合到本文中。
技术领域
[0002] 本发明涉及生物标志发现和个性化医疗的领域，以及更具体来说，涉及一种用于 在治疗之前预测与化学疗法相比、非小细胞肺癌(NSCLC)患者是否可能从上表皮生长因子 受体抑制剂(EGFR-I)、例如厄洛替尼或吉非替尼得到更多有益效果的方法。
【背景技术】
[0003] 非小细胞肺癌是美国的男性和女性死于癌症的主要原因。存在至少四（4)种不同 类型的NSCLC，包括腺癌、鳞状细胞、大细胞和支气管肺泡癌（bronchoaldeolar carcinoma)。肺部的鳞状细胞(表皮状)癌是与吸烟最频繁相关的显微类型的癌症。肺部的 腺癌占美国的所有肺部病例的50%以上。这种癌症在女性中更常见，并且仍然是在非吸烟者 中看到的最频繁类型。大细胞癌、特别是具有神经内分泌特征的癌通常与肿瘤向大脑的扩 散关联。当NSCLC进入血流时，它能够扩散到不同部位，例如肝、骨、大脑和肺部的其它位置。
[0004] NSCLC的治疗多年来一直较差。化学疗法、即晚期癌症的主要治疗只是轻微有效 的，除了局部癌症之外。虽然外科手术是NSCLC的最可能治疗选项，但是根据癌症阶段，它不 是始终可能的。
[0005] 用于研制治疗NSCLC患者的抗癌药物的最近方式集中于降低或消除癌细胞生长和 分离的能力。这些抗癌药物用来中断送往细胞的信号，以通知它们是生长还是死亡。通常， 细胞生长通过细胞接收的信号来严密控制。但是，在癌症中，这个信令出错，并且细胞按照 不可控方式继续生长和分离，由此形成肿瘤。当体内称作上表皮生长因子的化学品接合到 在体内的许多细胞的表面上发现的受体时，这些信令通路之一开始。称作上表皮生长因子 受体(EGFR)的受体经过细胞中发现的、称作酪氨酸激酶(TK)的酶的激发来向细胞发送信 号。信号用来通知细胞生长和分离。
[0006] 被研制并且向NSCLC患者开处方的两个EGRF-I抗癌药物称作吉非替尼（商标名"易 瑞沙"）和厄洛替尼（商标名"特罗凯"）。这些抗癌药物针对EGRF通路，并且在治疗NSCLC癌症 的有效性方面是有希望的。易瑞沙抑制存在于肺癌细胞中的酶酪氨酸激酶以及正常组织中 的其它癌症，并且其看来对癌细胞的生长是重要的。易瑞沙一直用作在两种其它类型的化 学疗法之后有进展或者无法响应两种其它类型的化学疗法的NSCLC的治疗的单一制剂。在 针对使用使用不同化合物的相同EGFR通路的研制和验证中存在其它药物，例如不可逆 EGFR-TKI抑制剂阿法替尼(勃林格殷格翰)和达克替尼(辉瑞）。
[0007] 本发明人的受让人开发了称作VeriStrat ?的测试，其预测NSCLC患者是否可能获 益于EGFR通路靶向药物、包括吉非替尼和厄洛替尼的治疗。在美国专利7736906中描述本文 中又称作"VS 1.0"的测试，通过引用将其内容结合到本文中。该测试也在在Taguchi F.等 人(J.Nat.Cancer Institute，2007 ν·99( 11)，838-846)中描述，也通过引用将其内容结合 到本文中。在本受让人的其它专利(包括美国专利7858380、7858389和7867774)中描述测试 的附加应用，通过引用将其内容结合到本文中。
[0008] 简言之，VeriStrat测试基于癌症患者的血清和/或血衆样本。经过在计算机中实 现的MALDI-TOF质谱和数据分析算法的组合，它借助于分类算法将在预定义m/z范围的八个 累积峰值强度的集合与来自训练组群的强度进行比较。该分类算法生成患者样本的类标 签:VeriStrat "良好"、VeriStrat "不良"或VeriStrat "中等"。在多个临床验证研究中，已经 表明，与其样本引起VeriStrat "不良"特征的那些患者相比，其预治疗血清/血浆为 VeriStrat "良好"的患者在采用上表皮生长因子受体抑制剂药物来治疗时具有明显更好的 结果。在极少病例（少于2%)中，不能进行确定，从而引起VeriStrat "中等"标签。VeriStrat 是从本发明的受让人Biodesix，Inc.可购买的，并且用于非小细胞肺癌患者的治疗选择中。
[0009] 从采用吉非替尼治疗的NSCLC患者的多机构研究的分析中开发VeriStrat测试。使 用来自遭受长期稳定疾病或者对吉非替尼疗法的早期进展的患者的预治疗血清样本的训 练集合，来开发测试。来自这些患者的血清样本的质谱(MS)用来定义12个质谱特征（即，谱 峰值），从而区分这两个结果编组。测试基于k最近邻法(KNN)分类方案及其使用来自训练组 群的附加谱所优化的参数来利用这些特征中的八个。测试还对采用吉非替尼或厄洛替尼来 治疗的患者的两个单独组群的预治疗血清、按照单盲方式(blinded fashion)来证明。这些 研究确认，分类为VeriStrat良好(VSG)的患者比分类为VeriStrat不良（VSP)的患者具有更 好的结果（在一个组群中死亡风险比[HR] = 0.43 P = 0.004,在另一组群中死亡HR = 0.33 P = 0.0007)。测试表明与沿用表皮状EGFR TKI疗法而不是沿用化学疗法或术后的临 床结果相关，因为在接受二线化学治疗之前、在分类为VSG或VSP的患者的总生存者(0S)中 没有看到统计上显著差异(在一个组群中HR = 0.74、P = 0.42,以及在另一个组群中HR = 0.81、P = 0.54)。在具有切除早期NSCLC的患者的第三控制组群中，0S的HR为0.90(P= 0.79)。
[0010] VeriStrat测试以后在称作PROSE研究的研究中正式、有希望地证明。参见患有不 宜手术的非小细胞肺癌的患者中的二线厄洛替尼与化学疗法的随机蛋白质分层阶段III研 究（Randomized Proteomic Stratified Phase III Study of Second-Line Erlotinib Versus Chemotherapy in Patients with Inoperable Non-Small Cell Lung Cancer, ClinicalTrials.gov # NCT00989690,向2013 ASC0 conference提供的简报，2013年6月）。 简言之，PROSE是在一线化学疗法治疗之后有进展的患有晚期NSCLC的285位患者的多中心 随机阶段3研究。患者经过1:1随机化接受标准剂量厄洛替尼或化学疗法（以研究人员的判 断的多西他赛或培美曲塞），其通过东部肿瘤协作组（EC0G)性能状态、吸烟状态和单盲 VeriStrat分类来分层。PROSE结果确认，分类为VSP的患者对化学疗法与厄洛替尼具有更好 的生存，并且分类为VSG的患者在采用厄洛替尼或化学疗法来治疗时具有相似0S。研究达到 表明治疗结果与VeriStrat分类之间的重要交互的主要目标，其中交互p值为0.031。
[0011] 虽然PROSE结果确认，VeriStrat对厄洛替尼的取消选择是有用的测试（即，测试 VSP的那些患者没有从厄洛替尼得到有益效果并且对化学疗法得到更好的生存），数据的进 一步审查表明，识别患者可能对厄洛替尼具有优于化学疗法的优良生存的测试具有附加临 床值。这种未满足临床需要引起本文档所述的、进行这个识别的新测试的开发。
【发明内容】
[0012] 在第一方面，一种用于在治疗之前预测非小细胞肺癌(NSCLC)患者是否为与化学 疗法、例如多西他赛或培美曲塞相比、可能从采取上表皮生长因子受体抑制剂(EGFR-I)的 投药的形式的NSCLC的治疗得到更大有益效果的一类癌症患者的成员的方法。该方法包括 步骤(a):在计算机可读介质中存储采取包括从通过基于血液的样本的质谱测定来确定为 被预测为从癌症的治疗中的EGFR-I得到总生存有益效果的一类患者的成员的多个癌症患 者、例如VS 1.0状态为"良好"的患者所得到的类标记质谱数据的训练集合的形式的非暂时 数据，这类患者还分为两个子类： 1. 在癌症的治疗中投药EGFR-I之后呈现疾病的早期进展的那些患者，这类患者的质谱 数据具有"早期"或等效物的类标签;以及 2. 在癌症的治疗中投药EGFR-I之后呈现疾病的后期进展的那些患者(类标签"后期"或 等效物）。
[0013] 该方法继续进行步骤(b):从NSCLC患者向质谱仪提供基于血液的样本，对基于血 液的样本进行质谱测定，并且由此生成基于血液的样本的质谱。
[0014] 该方法继续进行步骤(c):借助于经编程计算机对于在步骤(b)所得到的质谱进行 预定义预处理步骤。
[0015] 该方法继续进行步骤(d):在已经执行对步骤(c)所述的质谱的预处理步骤之后得 到在多个预定义m/z范围的所述质谱中的所选特征的累积强度特征值。
[0016] 该方法继续进行步骤(e):在经编程计算机中运行分类器，其包括用于将在步骤 (d)所得到的累积强度值与在步骤(a)所存储的训练集合进行比较并且作为响应而生成基 于血液的样本的类标签的分类算法。如果在步骤(e)所生成的类标签对基于血液的样本的 质谱是"后期"或等效物，则将该患者识别为与癌症的治疗中的化学疗法相比、可能从EGFR-I得到更大有益效果。
[0017] 存储训练集合的步骤(a)优选地在步骤(b)、（c)、（d)和(e)的执行之前执行。例如， 训练集合能够使用峰值查找和本文所公开的其它方法从经过质谱测定的样本集合来形成， 并且经过适当验证研究，然后存储在计算机系统、便携计算机介质、云存储或其它形式供以 后使用。在给定基于血液的样本将要按照步骤(b)-(e)来测试和处理的时候，训练集合被访 问并且用于按照步骤(e)的分类。
[0018] 在一个具体实施例中，组合治疗中的EGFR-I是小分子EGFR酪氨酸激酶抑制剂、例 如吉非替尼或等效物、如厄洛替尼。在其它可能实施例中，EGFR-I能够采取第二代EGFR-I， 例如达克替尼和阿法替尼。
[0019] 在一个实施例中，训练集合采取从多个NSCLC患者所得到的类标记质谱的形式。但 是，类标记谱可能从其它类型的固体上皮肿瘤癌症患者、例如直肠癌症患者或SCCHN癌症患 者来得到。
[0020] 在一个实施例中，分类器采取退出规则化和逻辑训练之后的经过滤微型分类器的 组合(CMC/D分类器)的形式。本文描述从样本的形成集合生成这种分类器的方法。
[0021] 在另一实施例中，该方法包括下列步骤:进行参考样本的质谱测定并且从参考样 本的质谱来得到参考样本特征值的集合;检查参考样本特征值与特征值的预定义集合的一 致性;从参考样本特征值来定义样本的质谱的特征校正函数；以及按照特征校正函数来校 正基于血液的样本的质谱的特征值。
[0022] 在另一个实施例中，该方法包括下列步骤:a)存储特征相关噪声特性的集合;b)生 成基于血液的样本的质谱的特征值的有噪特征值实现的集合;c)将分类器应用于有噪特征 值实现并且核对应用步骤的结果;d)对于在步骤c)所核对的结果生成统计数据；以及e)结 合对样本所生成的类标签来使用在步骤d)所生成的统计数据，以确定样本的类标签。
[0023] 在另一方面，一种用于处理非小细胞肺癌NSCLC患者的基于血液的样本以确定患 者是否为与NSCLC的治疗中的化学疗法相比、可能从采取上表皮生长因子受体抑制剂 (EGFR-I)的投药的形式的NSCLC的治疗得到更大有益效果的一类癌症患者的成员的系统。 该系统包括： (a) 质谱仪，生成基于血液的样本的质谱；以及 (b) 经编程计算机，包括处理单元以及存储来自质谱仪的质谱数据的存储器。存储器还 存储： 1) 采取训练集合的非暂时数据，包括从作为被预测从癌症的治疗中的EGFR-I得到总生 存有益效果的一类患者的成员的多个癌症患者(例如在VS 1.0测试中分类为"良好"的那些 患者)所得到的类标记质谱数据，这一类患者还分为两个子类： 1. 在癌症的治疗中投药EGFR-I之后呈现疾病的早期进展的那些患者，这类患者的质谱 数据具有"早期"或等效物的类标签;以及 2. 在癌症的治疗中投药EGFR-I之后呈现疾病的后期进展的那些患者(类标签"后期"或 等效物）； 2) 程序代码，用于实现采取对训练集合的退出规则化和逻辑训练的经过滤微型分类器 的组合(CMC/D分类器)的形式的分类器； 3) 程序代码，用于对在1)所存储的质谱进行预定义预处理步骤，在已经执行对质谱的 预处理步骤之后得到在多个预定义m/z范围的所述质谱中的所选特征的累积强度特征值； 以及 4) 程序代码，将CMC/D分类器应用于在3)得到的累积强度值和训练集合，并且作为响应 而生成基于血液的样本的类标签， 其中，如果由程序代码4)所生成的类标签对基于血液的样本是"后期"或等效物，则将 该患者识别为与癌症的治疗中的化学疗法相比、可能从EGFR-I得到更大有益效果。
[0024] 在另一方面，描述一种供分类样本中使用的设备，其包括计算机存储器，计算机存 储器存储采取包括从作为被预测从癌症的治疗中的EGFR-I得到总生存有益效果的一类患 者的成员的多个癌症患者所得到的类标记质谱数据的训练集合的形式的非暂时数据，这类 患者还分为两个子类： 1. 在癌症的治疗中投药EGFR-I之后呈现疾病的早期进展的那些患者，这类患者的质谱 数据具有"早期"或等效物的类标签;以及 2. 在癌症的治疗中投药EGFR-I之后呈现疾病的后期进展的那些患者，这类患者具有类 标签"后期"或等效物。
[0025] 在又一方面，公开一种治疗NSCLC患者的方法，包括下列步骤：向NSCLC患者投药 EGFR-I，其中通过在经编程计算机中运行分类器(其将质谱仪从NSCLC患者的基于血液的样 本所产生的质谱数据与包括从通过基于血液的样本的质谱测定来确定为被预测从癌症的 治疗中的EGFR-I得到总生存有益效果的一类患者的成员的多个癌症患者所得到的类标记 质谱数据的训练集合进行比较），预测患者与化学疗法相比更多地获益于EGFR-I，这类患者 还分为两个子类： 1. 在癌症的治疗中投药EGFR-I之后呈现疾病的早期进展的那些患者，这类患者的质谱 数据具有"早期"或等效物的类标签;以及 2. 在癌症的治疗中投药EGFR-I之后呈现疾病的后期进展的那些患者，这类患者的质谱 数据具有类标签"后期"或等效物。
【附图说明】
[0026] 图1是示出用于生成CMC/D分类器的方法的流程图。
[0027] 图2是示出用于使用按照图1所生成的CMC/D分类器来测试生物样本的测试方法的 流程图。
[0028]图3是类标签的初始指配并且在NSCLC/EGFR-I CMC/D分类器中划分为训练和测试 集合的图示。
[0029]图4A-4F是在CMC/D分类器生成方法（图1中的步骤1134)中生成的PFS和0S的测试 集合的早期和后期分类之间的风险比(HR)的分布的图表。图4A-4B用于初始类标签的PFS和 0S，而图4C-4F用于频繁错误分类的测试样本的类标签的一个或两个翻转(flip)之后的PFS 和0S。
[0030]图5是形成集合与通过从同一参考样本所得到的等式2的一致性的特征的谱的后 续返回之间的特征值比的图表。
[0031 ]图6A-6D是示出具有从生成集合谱所指配的标签的NSCLC/EGFR-I CMC/D分类器生 成集合的患者的时间-事件结果的Kaplan-Meier曲线。图6A示出吉非替尼治疗患者的0S;图 6B示出吉非替尼治疗患者的PFS，图6C示出化学疗法治疗患者的0S，以及图6D示出化学疗法 治疗患者的PFS。
[0032]图7是应用于PROSE样本集合的NSCLC/EGFR-I CMC/D分类器的灵敏度校正的回归 曲线的图表。
[0033]图8A和图8B是采用厄洛替尼（图8A)和化学疗法（图8B)所治疗的患者的编组后期 和早期/未知（原始Ver i Strat测试中测试Ver i Strat良好的那些患者）的总生存的Kap 1 an-Meier图表。
[0034] 图9A和图9B是采用厄洛替尼（图9A)和化学疗法（图9B)所治疗的患者的编组后期 和早期/未知（原始Ver i Strat测试中测试Ver i Strat良好的那些患者）的无进展生存的 Kap 1 an_Me i er 图表。
[0035] 图10是通过治疗分类为VeriStrat不良和后期的患者的总生存的Kaplan-Meier图 表。
[0036] 图11是通过治疗的VeriStrat良好早期/未知编组中的0S的Kaplan-Meier图表。
[0037]图12A是通过治疗的后期编组中的0S的Kaplan-Meier图表；图12B是通过治疗的后 期编组中的PFS的Kaplan-Meier图表。
[0038]图13是图2的平均工作流程模块1206的图示。
[0039] 图14是图2的预处理工作流程模块1212的图示。
[0040] 图15是将主分类器应用于校正测试样本特征值和有噪特征值实现的图2的模块 1228和1234的图示。
[0041] 图16是包括存储分类器和训练集合的计算机以及得到基于血液的样本的质谱的 质谱仪的测试样本处理系统的图示。
【具体实施方式】
[0042]以下描述分为四个一般小节： 小节I:描述形成本文称作CMC/D分类器的分类器的新方式(具有退出的微型分类器的 组合）。这种新方式在用于创建对进行本文档的测试方法有用的分类器。
[0043] 小节II:描述按照小节1所形成的特定CMC/D分类器(其用于本文档所述的预测测 试中）以及示范其预测与化学疗法相比、来自E