一种葡萄植株高温胁迫等级的确定方法
【技术领域】
[0001 ]本发明具体涉及一种葡萄植株高温胁迫等级的确定方法。
【背景技术】
[0002]温度是作物生长的重要环境因子，温度的变化直接影响作物的生理生特特征、分 布、同化、呼吸以及蒸腾等各项生理活动、从而影响植株的生长发育与产量形成，最终影响 产品的产量和质量(冯秀藻，1991)。研究表明：高温下细胞膜系统的稳定性同抗性成正相关 (马旭俊，2003)。植物面对高温胁迫时，植株的细胞膜的脂质透性增加，细胞内电解质外渗， 对植物造成了高温伤害(Martireau，1979)。在逆境胁迫下，植物通过应激性反应，激活抗氧 化剂和诱导抗氧化酶的活性，减弱膜脂过氧化作用，保持膜的稳定性(王洪春，1985)。光合 作用是植株对高温最敏感的部位之一，高温胁迫下，光合速率下降的程度与抗热性成负相 关(马德华，1999)。高温对光合作用的抑制是由非气孔因素作用的，叶肉细胞气体扩散阻抗 增加，CO 2的溶解度下降，Rubiso对CO2的亲和力降低或光合机构关键成分的热稳性降低的原 因所致(许大全，1998)。高温对植株最重要的伤害是对细胞酶的破坏，造成细胞的正常代谢 受阻，导致生长发育中止甚至细胞死亡等。国内外关于高温胁迫对植物的影响的研究主要 集中于对植物生理机制、光合作用以及生物量的累积等，并已取得一定进展，这对于我们进 一步探讨高温胁迫对作物伤害以及如何采取相应的防御措施具有重要的意义。
[0003]葡萄(Vitis vinifera)属落叶藤本植物，有"水果之神"的称号，是世界上四大水 果之一。近年来，中国葡萄栽培发展十分迅速，2014年全国葡萄栽培面积已达到300余万亩， 然而近年来，由于温室效应引起的全球气温持续升高，由此造成的农业生产损失也越来越 严重。在中国，最近几年的夏秋季节，多个地区发生了35°C-40°C的长时间高温天气，有些 地区甚至发生了40°C以上的短时间极端高温天气，夏秋季节正值葡萄开花坐果时期，高温 胁迫抑制葡萄正常的生长和发育，降低了产量和品质。国内外研究主要集中在高温对葡萄 生长及品质影响机理方面，而关于葡萄的灾害等级预报等方面研究较少。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的是为了解决现有技术中存在的缺陷，提供一种能有效确定葡萄的高 温胁迫等级的方法。
[0005] 为了达到上述目的，本发明提供了一种葡萄植株高温胁迫等级的确定方法，包括 以下步骤：
[0006] (1)将处于苗期的葡萄分别进行不同程度的高温处理，测定处理后的叶片相对电 导率、叶绿素 a含量和超氧化物歧化酶含量，比较不同处理下测得的参数，建立葡萄高温胁 迫指数的回归方程；
[0007] (2)通过步骤（1)建立的葡萄高温胁迫指数的回归方法，计算不同程度高温处理后 的葡萄高温胁迫指数，结合不同程度高温处理后的葡萄植株生长状态，确定不同高温胁迫 等级下高温胁迫指数的范围。
[0008]其中，步骤(1)中葡萄高温胁迫指数的回归方程为：
[0010]其中，R为高温胁迫指数，Ae、Be、Ce分别为不同程度高温处理后的叶片相对电导率、 超氧化物歧化酶含量、叶绿素 a含量，Ack、Ba、Cck分别为对照处理下的叶片相对电导率、超 氧化物歧化酶含量、叶绿素 a含量，η、r2、r3分别为叶片相对电导率、超氧化物歧化酶含量、 叶绿素 a含量的权重；对照处理为：日最高温度28°C，日最低温度18°C，环境相对湿度为 70%，光合有效福射为800μηιο1 · πΓ2 · 8^1;1'112、1'通过层次法确定。
[0011]确定的最佳葡萄高温胁迫指数的回归方程为：
[0013] 上述高温胁迫等级包括轻度、中度、重度、特重度；当高温胁迫指数大于5但不超过 10时，为轻度胁迫；当高温胁迫指数大于10但不超过15时，为中度胁迫；当高温胁迫指数大 于15但不超过20时，为重度胁迫；当高温胁迫指数大于20时，为特重度胁迫。
[0014] 上述步骤（1)中的高温处理设置为4个，昼温/夜温分别为:34°C/24°C、36°C/26°C、 38°C/28°C、40°C/30°C，每个高温处理的持续时间均分别进行2天、4天、6天和8天的处理，环 境相对湿度为70%，光合有效辐射为800μπι 〇1 · πΓ2 · ?Γ1，每个处理设置三盆重复。
[0015] 叶片相对电导率采用数字电导仪法测定；叶绿素 a含量采用分光光度计法测定 (Hugo, 2004、张立军，2004);超氧化物歧化酶含量采用氮蓝四唑还原法测定（王爱国， 1983) 〇
[0016] 本发明相比现有技术具有以下优点：高温胁迫下，植株叶片细胞膜透性增加，电解 质外渗，叶片相对电导率增大，逆境胁迫下植株抗氧化酶活性增强，从而减弱膜脂过氧化作 用，降低高温对植株的伤害。同时高温同时使得植株叶片叶绿素含量下降，光合速率下降。 本发明采用氮蓝四唑(NBT)还原法测定超氧化物歧化酶(SOD)活性、分光光度计法测定叶绿 素含量、数字电导仪法测定叶片相对电导率的方法，综合评估高温胁迫对不同生理指标的 影响，确定葡萄植株的高温胁迫等级，对于葡萄耐热性品种的选育、葡萄的栽培管理和高温 灾害防御具有重要的指导意义。
【具体实施方式】
[0017]下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。
[0018] 实施例1
[0019] 本发明葡萄植株高温胁迫等级的确定方法具体步骤如下：
[0020] 第一步:葡萄植株高温试验
[0021 ]将处于3年生的葡萄植株移栽至塑料盆中，放入人工气候室（TPG - 2009， Australian)，试验期间，设置4个高温处理，昼温/夜温分别为34°C/24°C(T1)、36°C/26°C (T2)、38°C/28°C(T3)、40°C/30°C(T4)，持续时间分别处理2、4、6、8天；以日最高28°C/ 日最 低18°C为对照(CK)，试验期间，环境相对湿度为70%，光合有效辐射为800μπι〇1 ·πΓ2 · s' 每个处理设置三盆重复。
[0022]第二步:仪器设备与药品准备
[0023] (1)仪器设备
[0024] 10-1000yL、1000-5000yL DRAG0NLAB可调式移液枪，上海万岛仪器科技有限公司；
[0025] 紫外分光光度计，日本岛津公司；
[0026] CT-3030电导率仪，上海天皇仪器仪表有限公司；
[0027] 电子天平，奥豪斯仪器(上海)有限公司；
[0028] (2)药品试剂
[0029] 磷酸二氢钾，分析纯，国药集团化学试剂有限公司，上海；
[0030] 三水合磷酸氢二钾，分析纯，国药集团化学试剂有限公司，上海；
[0031 ]石英砂，分析纯，国药集团化学试剂有限公司，上海；
[0032]乙二胺四乙酸二钠，分析纯，国药集团化学试剂有限公司，上海；
[0033] 氯化硝基四氮唑蓝，分析纯，国药集团化学试剂有限公司，上海；
[0034] L-甲硫氨酸，分析纯，中国惠兴生化试剂有限公司，上海；
[0035] 核黄素，分析纯，国药集团化学试剂有限公司，上海；
[0036]第三步:葡萄植株生理指标的测定
[0037] (1)相对电导率的测定
[0038]将环境控制试验的高温处理后的葡萄植株叶片样品取出解冻，并用蒸馏水擦拭干 净，晾干。利用仪器(DDSJ 308,上海)测定叶片电导率，测定时取一洁净小烧杯，加入40ml蒸 馏水，用数字电导仪测出其电导率R〇。选取经过高温处理的叶片，避开主叶脉，每组用打孔 器取直径1.5cm叶肉组织三等分（即三次重复），每份5片，置于小烧杯中，加入40ml蒸馏水浸 泡5-6h(尽量避免叶片之间重叠），测出其电导率R 1。再将小烧杯用保鲜膜封好放入水浴锅 中蒸煮30min，取出冷却后再次测定其电导率R2。相对电导率的计算方法如下：
[0040]根据式(1)，计算得到的不同程度高温处理下的葡萄叶片相对电导率如表1所示： [0041 ]表1葡萄叶片相对电导率随高温胁迫时间的变化
[0043] (2)叶片叶绿素含量测定
[0044]试验处理期间摘取葡萄功能叶片，采用Hugo、张立军等的方法来测定葡萄叶片叶 绿素 a、叶绿素 b和类胡萝卜素含量。将新鲜葡萄叶片置于96%乙醇中，直至叶片变为白色，叶 绿素完全提取出，用分光光度计在665、649、470nm波长下对提取液比色，计算得到叶绿素 a、 b和类胡萝卜素的含量。每个处理进行3次重复实验。
[0045] 计算得到的不同程度高温处理下的葡萄叶片叶绿素 a含量如表2所示：
[0046] 表2叶片的叶绿素 a含量(mg/g)随胁迫时间的变化
[0048] (3) SOD含量的测定
[0049] 取分析纯KH2P〇427.216g用蒸馏水定容到1000 ml作为A液，另取分析纯K 2HPO4 · 3H2045.644g，定容至 1000ml，作为B液;21.25mlA液+228.25mlB液混合，定容至 1000ml，得到 0.05M磷酸缓冲液（PH7.8);取1.9399g甲硫氨酸用磷酸缓冲液定容至100ml (Met)，取 0.06133g氮蓝四唑用磷酸缓冲液定容至1001111(呢1')，取0.03728乙二胺四乙酸二钠用磷酸 缓冲液定容至100ml (EDTA-Na2),取0.00753g核黄素用蒸馏水定容至1000ml (MFD)。其中 Met、NBT、EDTA-Na2需避光保存。SOD反应液的配置需：磷酸缓冲液:Met: NBT: EDTA-Na2: MFD: H2O 比例为：150:30