专利名称:金华猪乳腺组织的microRNA的制作方法
技术领域：
本发明属于生物和农业技术领域：
，尤其涉及一种金华猪乳腺组织通过测序分析新发现的microRNA序列。
背景技术：
microRNA (miRNA)是一类新发现的内源性单链非编码小RNA，长度约为21 25 个核苷酸。miRNA最初于1993年在秀丽线虫中被发现,当时Lee等在研究线虫发育缺陷时发现7i/ -4基因不编码蛋白质，但能时序调控秀丽线虫胚胎后期发育的基因。然而7i/ -4 的发现没能引起太大的关注，直至2000年Reinhart等在线虫中又发现了第2个类似功能的miRNA hi-7基因，才渐渐掀起一股miRNA的研究热潮。研究结果发现miRNA通过与靶基因特异性的碱基配对，抑制靶mRNA翻译或是启动靶mRNA降解，具有控制基因表达及细胞增殖、分化和凋亡等多种功能，已被大量实验证实是一种重要的基因表达调控因子。
猪是重要的肉品提供者，而且猪在解剖学、生理学、生物化学、病理学和药理学等方面与人类相似性极高，因此在人类健康研究中有着重要的作用，近年来已逐渐被公认为生物医学研究重要的模式系统，被广泛地应用于传染病研究、药物测试、新手术方式的练习、异体器官移植尝试以及一些如心血管疾病和肥胖症等的生活方式病的探索等。现在已经有大量的实验证明miRNA在动物(包括人类)的生化活动中起着多种重要的作用。但是在猪上发现的miRNA还比较少,在miRBASE数据库中收录有人的pre-miRNA (miRNA前体)1424 条，小鼠有720条，大鼠有408条，而猪只有228条。miRNA具有物种和组织特异性，因此最近几年猪各类组织的miRNA的研究报道越来越多，如骨骼肌、心脏、肝脏、胸腺、脂肪、肠等， 但是鲜有与猪乳腺相关miRNA的研究报道。对猪乳腺miRNA的研究不仅可以代替人类乳腺进行乳腺研究，而且也是开发乳腺生物反应器的理想材料。而且对猪乳腺miRNA的研究还可以帮助揭示乳腺泌乳的分子机理，从而为增加母猪泌乳量和提高仔猪生长速度提供帮助，有助于提高养猪业的经济效益。金华猪具有优良的繁殖性能，包括性成熟早，产仔多，产仔年限长(优良母猪高产性能可持续8、年)，乳头数多，泌乳力强，母性好等。所以本发明以金华猪为研究对象，对乳腺组织进行了 miRNA测序，并且发现了新的miRNA序列。
发明内容
本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种金华猪乳腺组织的miCToRNA。
本发明的目的是通过以下技术方案来实现的本发明构建金华猪的乳腺组织 cDNA库，通过测序技术对其进行深度测序来获得乳腺small RNA的序列，利用生物信息学方法对其进行分析，得到金华猪miRNA的种类和拷贝数，与数据库进行比对，发现了一些在哺乳动物未被收录的预测miRNA，其核苷酸序列如SEQ ID Ν0:1_90所示。
本发明的有益效果是，本发明提供的miRNA可以单独取其中几个进行猪乳腺泌乳、退乳等系列活动的研究，为增加母猪泌乳量和提高仔猪生长速度提供帮助，也可与目前已发现的miRNA—起用于定制芯片，用于乳腺活动或乳腺疾病的研究。
图I是金华猪乳腺组织总RNA凝胶电泳图；
图中:Y1、Y2是金华猪，Control是鼠总RNA0
具体实施方式
一、新 miRNA 的发现
I、乳腺组织采集和总RNA提取鉴定
在相同的饲养条件下，挑选健康的产后21天的金华猪(浙江省金华市种猪场)3头进行屠宰，用75%酒精对其乳房进行消毒，取乳腺组织各3管，然后迅速投入液氮，回到实验室后-80°C保存。
按照Animal Tissue RNA Purification Kit (LC Sciences, USA)说明提取总 RNA，用1%琼脂糖凝胶检测其完整性(图1)，可以看到28S和18S两条rRNA条带，取2yL RNA水溶液在紫外可见分光光度计上测定0D260和0D280值，比值在2. (Γ2. 2范围内，说明提取的RNA质量较好。
2、小RNA cDNA文库构建
按照 Small RNA Sample Prep Kit 说明(Illumina,protocol version 1004239_RevA, March 2008)，取10 μ g的总RNA混样来构建文库，过程具体如下从15% TBE-尿素-聚丙烯酰胺凝胶中分离含有15-50 bp RNA的凝胶小块，再经洗脱液洗脱和酒精沉淀得到纯化的小RNA片段；用T4 RNA连接酶(Promega )在纯化好的15-50 bp的小RNA片段5’和 3’端分别加上SRA 5，adapter和SRA 3，adapter (Illumina),再经洗脱和酒精沉淀得到 64-99 bp的小RNA片段；使用M-MLV ( Invitrogen )逆转录酶将上步中的小RNA反转录为cDNA，然后用DNA聚合酶(Invitrogen )将cDNA进行20个循环的PCR扩增。上游引物为MT GAT ACG GCG ACC ACC GAC AGG TTC AGA GTT CTA CAG TCC GA，下游引物为 CAA GCA GAA GAC GGC ATA CGA。反应体系共 50 μ L，具体为ddH20 20. 5 μ L, 5 XPhusion H-F buffer 10 μ L，dNTP(各 2. 5mM) 5.0yL，引物(25 uM stock)各 2· 0 μ L，cDNA 10. O μ L, Phusion 酶(2U/μ I) O. 5 μ L。反应条件为98 °C 30s, 98 °C 10s, 60 °C 30s, 72 °C 15s, 72°C 7min。将PCR产物进行电泳，从12%的TBE-聚丙烯酰胺凝胶中分离纯化出长度为 80-115 bp的PCR扩增产物，再将PCR产物经洗脱液洗脱和酒精沉淀得到纯化的cDNA片段， 用 Picogreen dsDNA 定量试剂(Invitrogen)在 Nanodrop ( Thermo Scientific )和 TBS-380 mini-f luorometer ( Turner Biosystems )仪上检测其质量。最后调整 cDNA 浓度为IOnM,使用Illumina Genome Analyzer IIx分别对两个cDNA文库进行高通量深度测序。
3、miRNAs的生物信息学分析
通过高通量深度测序得到了初始序列20，167，190条，根据miRBase 16. O对哺乳动物 miRNA的定义标准，对这些初始序列进行筛选，筛除序列接头、单种核苷酸序列超过80%的、 含两个及以上不确定核苷酸的、长度小于15个核苷酸的、拷贝数小于3的等不符合条件的， 也筛除已知的RNA序列，如NCBI数据库中收录的mRNA、Rfam数据库中收录的其他非miRNA 的非编码RNA和在Repbase数据库中收录的重复序列片段等。经过这些标准筛选后，金华猪猪10，495，166条初始序列(52%)被筛除，剩余9，672，024条(48%)比对序列。
把筛选后的序列通过NCBI Local BLAST定位到猪基因组上，定位过程主要包括以下几个步骤(I)将序列与miRBASE 16. O中的猪miRNA和pre-miRNA (miRNA前体)以及其他22种哺乳动物的miRNA和pre-miRNA进行比对；(2)将第一步中能比对上的序列与 Ensembl猪基因组数据库比对；(3)应用UNAFold对第一步中不能比对上的序列进行发夹结构预测。
最终得到90个尚未收录于miRBASE数据库的预测的miRNA，命名为SEQ ID NO. I-SEQ ID NO. 90。
二、新发现miRNA的应用
金华猪上新发现的miRNA可与已发现的猪的miRNA —起构建miRNA芯片，来研究猪发育、生长或疾病状态下miRNA的表达变化，有助于理解其背后的分子机理，从而为猪的经济价值，节约养殖成本等提供帮助。对于在人和猪上都有检测到的miRNA，可以将猪作为模式动物，来研究这些miRNA在人体内的作用，从而为人类健康做出贡献。预测的miRNA通过 RAKE检测就可以证实为新的miRNA，并上传miRBASE数据库，为后续研究奠定基础。就以下将结合实施例来进一步解释本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。
实施例I、SEQ ID NO 90的靶标预测
用TargetScan软件对该序列进行靶基因预测，由于该软件中不含有猪的信息，所以用人类mRNA与miRNA之间的互作来预测相应的靶基因，结果发现了 3个靶点，分布在3个靶基因上，分别为 IQSEC1(IQ motif and Sec7 domain I), EPHB2 (EPH receptor B2)和 SHANK3 (SH3 and multiple ankyrin repeat domains 3)。在 KEGG 检索后发现，IQSECl 为人类和猪所共有的基因，其编码的蛋白为ArfGEF家族蛋白，在细胞内吞过程中发挥作用； EPHB2也为人类和猪共有基因，编码一条含668个氨基酸的蛋白，属于EPHB家族，对器官发育过程中的轴突导向其作用；SHANK3存在于人类基因组，但在猪上没有发现，它编码的蛋白参与神经系统信号传递传递过程中谷氨酸受体的变化。因此，可以将猪作为实验动物，研究miRNA SEQ ID NO 90在人类细胞内吞和器官发育过程中的作用，从而为人类健康服务。
权利要求
1.一种金华猪乳腺组织的microRNA，其特征在于，它的核苷酸序列为SEQ ID NO. I-SEQ ID NO. 90中任意一个所示的序列。
专利摘要
本发明公开了一种金华猪乳腺组织中的microRNA，本发明通过测序技术对金华猪乳腺组织进行深度测序来获得乳腺smallRNA的序列，利用生物信息学方法对其进行分析，得到金华猪miRNA的种类和拷贝数，得到一些在哺乳动物未被收录的预测miRNA，其核苷酸序列如SEQIDNO:1-90所示；本发明提供的miRNA可以单独取其中几个进行猪乳腺泌乳、退乳等系列活动的研究，为增加母猪泌乳量和提高仔猪生长速度提供帮助，也可与目前已发现的miRNA一起用于定制芯片，用于乳腺活动或乳腺疾病的研究。
文档编号C12N15/113GKCN102586249SQ201110385819
公开日2012年7月18日 申请日期2011年11月29日
发明者张立凡, 徐宁迎, 沈一飞, 王颖 申请人:浙江大学导出引文BiBTeX, EndNote, RefMan